水稻OsCatB敲除突變體的構(gòu)建及耐逆性初步分析

劉 珊,趙李劍,劉 聰,鄧 勇,黃 劍,唐冬英,劉選明,林建中

(湖南大學(xué)生物學(xué)院植物功能基因組學(xué)和發(fā)育調(diào)控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國湖南長沙410082)

植物在生長發(fā)育過程中常常會遭受一些不良因素的侵襲,從而造成植物正常生長狀態(tài)被破壞甚至死亡。我們把導(dǎo)致植物生長發(fā)育過程被打斷或破壞的環(huán)境條件稱為逆境脅迫[1～3]。根據(jù)脅迫來源的不同,逆境脅迫分為兩大類,即生物脅迫和非生物脅迫。其中,最常見的高溫、高鹽、高堿等屬于非生物脅迫,會導(dǎo)致植物體內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧(reactive oxygen species,ROS),如超氧陰離子自由基(O2．-)、羥基自由基(·OH)和過氧化氫(H2O2)等[4～6]。ROS本身能夠作為一種重要的信號分子參與許多生物學(xué)過程,包括耐受生物與非生物逆境。但是,ROS的過量積累會氧化并破壞膜脂、蛋白質(zhì)和核苷酸等細(xì)胞組分,若不能及時(shí)清除將會嚴(yán)重影響植物新陳代謝,抑制植物生長與發(fā)育,甚至可能直接造成植物的死亡[7～10]。

為了消除ROS的毒害,植物已進(jìn)化出了一套有效清除ROS的酶和非酶清除機(jī)制。ROS的清除酶類包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化物酶(peroxidase,POD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GPX)。ROS的非酶清除分子,即抗氧化分子,主要為抗壞血酸(ascorbic acid,AsA)、還原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)、生育酚和黃酮類化合物等。這些酶類和非酶類分子協(xié)同作用使ROS保持動(dòng)態(tài)平衡,維持ROS在細(xì)胞信號傳導(dǎo)中所需要的正常水平[11]。CAT是一個(gè)非常重要的抗氧化酶,能夠催化H2O2降解為H2O和O2,在植物非生物逆境響應(yīng)中起著關(guān)鍵作用。有研究表明,植物在逆境條件下產(chǎn)生的過量ROS一般都是由CAT來大量清除的[12]。CAT雖然在細(xì)胞內(nèi)的濃度與親和力偏低,但是清除效率高,反應(yīng)快,在植物處于逆境脅迫時(shí),可及時(shí)為植物減低氧化損傷[13]。水稻中的CAT家族共含有3個(gè)同工酶成員,分別為CatA、CatB和CatC,在擬南芥中也包含3個(gè)成員,即Cat1、Cat2和Cat3[14]。大麥和煙草的遺傳研究顯示,大麥Cat2對葉片的生長發(fā)育很重要,而煙草中的Cat2則可清除由氧化脅迫產(chǎn)生的H2O2[15]。相關(guān)研究對擬南芥Cat2基因的T-DNA插入突變體展開分析發(fā)現(xiàn),Cat2負(fù)責(zé)擬南芥中大部分的葉片過氧化氫酶活性,是光呼吸的重要參與者[16]。在水稻中,CatB屬于第三類過氧化氫酶,大量在非光合組織、愈傷組織、根和種子中表達(dá),其可能與脂肪酸β-氧化合成有關(guān)[17]。但是,關(guān)于CatB基因在水稻抗逆境中的作用尚未有人作出清楚的闡述。

本研究首先建立了OsCatB的CRISPR/Cas9基因敲除體系,并篩選鑒定到純合突變體catb。然后通過模擬鹽、高溫和氧化脅迫,分析了突變體catb的生理和生化表型,發(fā)現(xiàn)在高溫和氧化脅迫下突變體catb的存活率比野生型(wild type,WT)顯著降低,體內(nèi)生理指標(biāo)CAT酶活與野生型相比也顯著降低,同時(shí)突變體在表型上也呈現(xiàn)出一種更容易受損傷的狀態(tài)。研究結(jié)果初步說明,缺失了CatB基因的水稻突變體在氧化和熱脅迫下,其生長狀態(tài)和抗逆境能力都低于野生型,意味著Os-CatB參與了水稻的氧化和熱脅迫響應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

水稻材料為粳稻品種Kitaake(Oryza sativa L．cv．Kitaake),用于水稻轉(zhuǎn)化、克隆、RNA提取等實(shí)驗(yàn)。水稻種子保存于4℃冰箱。

1.2 CRISPR/Cas9載體的構(gòu)建

根據(jù) Liu等[18]的方法,利用 CRISPR-P 2．0(http://crispr．hzau．edu．cn/)在線工具設(shè)計(jì)靶標(biāo)。以O(shè)sCatB的第二個(gè)外顯子作為基因編輯的靶點(diǎn),遵循gRNA設(shè)計(jì)基本原則篩選出單靶標(biāo)CatB-U6a:5′-AACAACTCCGCCCTCACCGT-3′;采用 Primer 5．0軟件設(shè)計(jì)引物 CatB-U6a-F和 CatB-U6a-R(表1),克隆靶標(biāo)片段;將靶標(biāo)連上CRISPR/Cas9中間載體(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉耀光教授提供),隨后利用內(nèi)切酶Nde I和BamH I(ThermoFisher公司,美國)切下含有靶標(biāo)的CRISPR表達(dá)原件片段;將目標(biāo)片段與植物載體pCAMBIA1301-GUS(實(shí)驗(yàn)室保存)連接后轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌(E.coli)DH5α感受態(tài)中,挑選陽性克隆,交由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序確認(rèn)。

1.3 水稻轉(zhuǎn)化

水稻轉(zhuǎn)化方法在文獻(xiàn)[19]的基礎(chǔ)上略有修改,具體如下:將重組質(zhì)粒pCAMBIA1301-GUS經(jīng)電擊法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105(本實(shí)驗(yàn)室保存),再通過農(nóng)桿菌浸染粳稻品種Kitaake愈傷組織,獲得Os-CatB敲除突變體catb。

1.4 PCR鑒定

參照文獻(xiàn)[20]的方法,提取轉(zhuǎn)化株系幼苗(T1)葉片的DNA,根據(jù)表達(dá)載體上的潮霉素篩選標(biāo)記基因(Hyg)設(shè)計(jì)引物Hyg-F和Hyg-R(表1),然后通過PCR擴(kuò)增和電泳檢測進(jìn)行陽性轉(zhuǎn)基因植株的鑒定。提取已鑒定的陽性植株(T1)葉片DNA,根據(jù)基因編輯靶標(biāo)位點(diǎn)附近的序列設(shè)計(jì)引物CatBTC-F和CatB-TC-R(表1),然后通過PCR擴(kuò)增目的片段,交由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序,最后將測序結(jié)果與野生型CatB的序列進(jìn)行比對以確認(rèn)具體編輯方式。

1.5 GUS組織化學(xué)染色

參考Jefferson等[21]的方法配制染色液,將催芽6 d的水稻幼芽(T1)浸泡于GUS染色液中,隨后置于37℃培養(yǎng)箱黑暗處理1～2 d,期間每隔3 h觀察其顏色變化。

1.6 免疫印跡檢測

免疫印跡檢測參照Zhou等[22]的方法進(jìn)行,主要步驟如下:將catb突變體的植物總蛋白質(zhì)上清經(jīng)SDS-PAGE電泳后恒流轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,棄封閉液;然后使用CatB的多克隆抗體(本實(shí)驗(yàn)室制備)室溫孵育1 h(或4℃過夜),TBST洗膜3次;再使用二抗(鼠抗IgG,HRP)室溫孵育1 h,TBST洗膜3次;TBS洗膜1次后顯影。

1.7 苗期的逆境處理

鹽脅迫處理:將生長21 d的突變體和野生型幼苗置于NaCl濃度為140 mmol/L的水培營養(yǎng)液[23]中,處理8 d,隨后用正常的水培營養(yǎng)液恢復(fù)培養(yǎng)20 d,觀察植株表型并統(tǒng)計(jì)野生型和突變體的存活率。

熱脅迫處理:以45℃持續(xù)16 h(光照)和35℃持續(xù)8 h(黑暗)的交替溫度處理生長21 d的突變體和野生型幼苗7 d[24],然后于28℃恢復(fù)培養(yǎng)20 d,觀察植株表型并統(tǒng)計(jì)存活率。

氧化脅迫處理:參考文獻(xiàn)[25]的方法使用甲基紫精(methylviologen,MV)(Sigma公司,美國)對水稻發(fā)芽材料進(jìn)行氧化脅迫處理。略作修改的方法如下:將催芽5 d后的水稻材料分別轉(zhuǎn)移到正常的1/2 MS培養(yǎng)基(對照組)和含有2 μmol/L MV的1/2 MS培養(yǎng)基(實(shí)驗(yàn)組)中處理6 d,然后觀察表型并拍照。

1.8 CAT酶活和H2O2含量的測定

對于高溫和鹽脅迫處理的生長21 d的水稻幼苗,分別取開始處理時(shí)的 0 d、1 d、3 d、5 d、7 d和 0 d、2 d、4 d、6 d、8 d 的樣品,使用 pH 7．5 的0．02 mmol/L磷酸緩沖液作為基本的植物上清蛋白質(zhì)提取液。使用CAT檢測試劑盒(S10051;碧云天公司)和H2O2含量檢測試劑盒(BC3590;索萊寶公司)進(jìn)行測樣,設(shè)置三組平行樣。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 OsCatB敲除突變體catb的獲得及鑒定

CRISPR/Cas9表達(dá)載體的示意圖如圖1A所示,其中含有由35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)的潮霉素篩選標(biāo)記基因(Hyg)和GUS報(bào)告基因(GUS),而單靶點(diǎn)gRNA則由OsU6啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。測序結(jié)果顯示,該CRISPR/Cas9表達(dá)載體構(gòu)建成功。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)水稻轉(zhuǎn)化法,獲得56株T1雜合子。潮霉素抗性基因Hyg的PCR鑒定結(jié)果顯示,陽性植株中目的基因大小與預(yù)期相同,而陰性對照植株中無相應(yīng)條帶,初步確定這些陽性植株為目的轉(zhuǎn)基因植株(圖1B)。由于在T-DNA區(qū)段中含有35S驅(qū)動(dòng)的GUS報(bào)告基因(圖1A),為了進(jìn)一步快速鑒定陽性植株,我們采用GUS染色液對萌發(fā)種子進(jìn)行了染色篩選,發(fā)現(xiàn)凡是含有Hyg標(biāo)記基因的萌發(fā)種子均著色,而不含有Hyg標(biāo)記基因的萌發(fā)種子則無法著色(圖1C)。靶點(diǎn)測序及比對結(jié)果發(fā)現(xiàn),3個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因株系在PAM(protospacer adjacent motif)附近發(fā)生了3種方式的編輯:catb-1在目標(biāo)位置缺失了胞嘧啶(C);catb-2在目標(biāo)位置缺失了52個(gè)堿基;catb-3在目標(biāo)位置插入了鳥嘌呤(G)(圖1D)。為進(jìn)一步了解上述3個(gè)catb突變體中CatB蛋白的表達(dá)情況,我們采用抗CatB的多克隆抗體進(jìn)行了免疫印跡檢測,發(fā)現(xiàn)3個(gè)突變株系中CatB蛋白的積累水平均比野生型顯著降低(圖1E)。需要說明的是,catb突變體在CatB位置仍可檢測到微弱的信號,但是其信號顯著弱于野生型,這可能是由于所用抗CatB的多克隆抗體非特異性地檢測到了部分CatA和CatC。綜上可知,文中所構(gòu)建的catb突變材料為真正的OsCatB基因敲除突變體,可用于后續(xù)的生理和生化等表型分析。

表1 PCR引物序列Table 1 Nucleotide sequences of PCR primers

2.2 突變體catb的耐鹽性分析

選取突變體catb-1和catb-3作為實(shí)驗(yàn)材料,以未轉(zhuǎn)化的Kitaake作為野生型對照,在長日照培養(yǎng)箱培養(yǎng)至3周左右時(shí),用含140 mmol/L NaCl的水培營養(yǎng)液進(jìn)行鹽脅迫處理。表型觀察結(jié)果顯示,野生型和突變體經(jīng)鹽脅迫處理后,表型并無明顯差別(圖2A),說明OsCatB在水稻的鹽響應(yīng)中不起作用或作用不明顯?；謴?fù)培養(yǎng)20 d后進(jìn)行存活率統(tǒng)計(jì),結(jié)果顯示catb-1和catb-3的存活率維持在15%左右,比野生型的存活率(16%左右)略微下降,但是仍沒有顯著差異(圖2B)。已知CAT對于H2O2的消除和氧化還原的維持非常重要[26],為了研究catb突變體在應(yīng)對鹽脅迫時(shí)對體內(nèi)CAT 酶活的影響,分別取鹽處理 0 d、2 d、4 d、6 d和8 d 5個(gè)時(shí)間點(diǎn)下幼苗的根和地上部分,檢測其CAT酶活和H2O2含量。結(jié)果如圖2C～F所示,未受脅迫處理(0 d)時(shí),catb突變體與野生型的CAT酶活和H2O2含量幾乎無明顯變化;在140 mmol/L NaCl處理下,野生型的CAT酶活有所增加,雖然catb中CAT酶活增強(qiáng)的幅度不明顯,但與野生型相比基本無顯著性差異,而H2O2含量變化與之相反,且差異也基本不顯著。該結(jié)果說明,OsCatB的敲除對水稻鹽脅迫響應(yīng)的影響不明顯,猜測CAT家族成員間具有一定的功能冗余,即當(dāng)OsCatB缺失時(shí),其他成員(OsCatA和OsCatB)可能存在一定的補(bǔ)償機(jī)制,以保持體內(nèi)的H2O2含量不變。

2.3 突變體catb的耐高溫分析

21 d大小的突變體和野生型幼苗經(jīng)45℃16 h和35℃8 h循環(huán)處理7 d后,置于28℃光照培養(yǎng)箱恢復(fù)培養(yǎng)20 d。表型觀察發(fā)現(xiàn),catb-1和catb-3與野生型在高溫處理7 d以后的生長狀態(tài)有明顯差異,野生型還尚存一小部分綠色的葉片,但是突變體已經(jīng)全都變黃呈現(xiàn)枯萎狀(圖3A)?；謴?fù)培養(yǎng)20 d后統(tǒng)計(jì)其存活率發(fā)現(xiàn),catb突變體的存活率(5%～8%)顯著低于野生型(15%)(圖3B),說明突變體比野生型更易遭到熱脅迫的損傷和破壞,OsCatB正調(diào)控水稻的熱脅迫響應(yīng)。為了進(jìn)一步探究OsCatB的敲除對植株在熱脅迫下的生理生化的影響,我們測定了熱處理0 d、1 d、3 d、5 d和7 d 5個(gè)時(shí)間點(diǎn)下幼苗根部和地上部分的CAT酶活與H2O2含量。檢測結(jié)果顯示,高溫處理時(shí)catb突變體和野生型的根與地上部分的CAT酶活均有升高的趨勢,但是catb突變體中CAT酶活升高的趨勢顯著低于野生型,這種差異在根中更顯著(圖 3C～D)。該結(jié)果與已有文章的報(bào)道[17]一致,因?yàn)樗綩sCatB主要在非光合組織、愈傷組織、根和種子中表達(dá)。同時(shí)研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn),在正常條件(0 d)下野生型與catb突變體株系的CAT酶活和H2O2含量均無顯著的差異,只有在高溫處理之后,catb突變體的CAT酶活才開始顯著低于野生型,而其H2O2含量則顯著高于野生型(圖3C～F),這些數(shù)據(jù)與圖3A的表型特征相符合。由此我們初步推測,水稻植株受到熱脅迫時(shí)體內(nèi)會積累超量的ROS(主要是H2O2的形式),由于catb突變體中OsCatB的功能缺失而無法及時(shí)清除超量H2O2,最終導(dǎo)致其耐受性下降。同時(shí),該結(jié)果也進(jìn)一步說明,OsCatB基因可以在一定程度上增強(qiáng)熱脅迫的抗性,在加強(qiáng)水稻細(xì)胞對抗熱脅迫中發(fā)揮重要的作用。

2.4 突變體catb的耐氧化脅迫分析

于前所述,當(dāng)catb突變體處于鹽和熱脅迫下時(shí),其CAT酶活和H2O2含量與野生型相比均發(fā)生了變化,而且這種變化幅度在熱脅迫下更大,因此我們猜想水稻OsCatB可能通過及時(shí)清除過量積累的ROS來正調(diào)控水稻的氧化脅迫響應(yīng)。為了證實(shí)該猜想,我們使用甲基紫精(MV)模擬氧化脅迫來處理發(fā)芽5 d的水稻材料,結(jié)果顯示,對照組中野生型和catb突變體在植株高度上無明顯差異,但是在2 μmol/L的MV處理6 d后,突變體的生長受到顯著抑制,與野生型相比呈現(xiàn)出一種更矮小萎黃的狀態(tài)(圖4)。由此,我們初步認(rèn)為OsCatB也正調(diào)控水稻的氧化脅迫響應(yīng)。

圖1 catb突變體的創(chuàng)制與鑒定(A)CRISPR/Cas9表達(dá)載體的構(gòu)建;(B)轉(zhuǎn)化苗中潮霉素抗性基因(Hyg)的PCR檢測。M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn),WT為野生型,1～14為不同轉(zhuǎn)基因株系的T1代幼苗;(C)發(fā)芽種子的GUS染色鑒定;(D)3種突變OsCatB基因的目標(biāo)區(qū)間的測序圖譜和序列;(E)免疫印跡檢測突變體OsCatB蛋白的表達(dá)。Fig.1 Creation and identification of catb mutants(A)Construction of CRISPR/Cas9 expression vector;(B)PCR analysis of the hygromycin resistant gene Hyg in transgenic lines．M represents DNA marker,WT represents wild type plants,and 1～14 represent the T1seedlings of various transgenic lines;(C)GUS staining identification of germinated seeds;(D)Chromatograms and sequences of three mutated OsCatB genes in the desired region;(E)Immunoblot analysis of OsCatB in catb mutants．

圖2 幼苗期catb突變體對鹽脅迫的響應(yīng)分析(A)鹽脅迫下catb和野生型幼苗的表型。生長21 d的水稻幼苗用140 mmol/L的NaCl處理8 d,隨后用常規(guī)營養(yǎng)液恢復(fù)培養(yǎng)20 d;(B)恢復(fù)培養(yǎng)20 d后catb和野生型幼苗的存活率;(C～D)catb和野生型幼苗地上部分和根部在不同鹽處理時(shí)間的CAT酶活性;(E～F)catb和野生型幼苗地上部分和根部在不同鹽處理時(shí)間的H2O2含量。圖B～F中的數(shù)值代表的是平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3,*表示與 WT 相比 P≤0．05,t檢驗(yàn))。Fig.2 Response analysis of catb mutants to salt stress at seedling stage(A)Phenotype of catb and WT seedlings under salt stress．Twenty-one-day-old seedlings were treated with 140 mmol/L NaCl for 8 d,and then recovered for 20 d;(B)Survival rates of catb and WT seedlings after recovery for 20 d;(C～D)CAT activities of shoots and roots of catb and WT seedlings treated with salt stress at the indicated time points;(E～F)H2O2contents of shoots and roots of catb and WT seedlings treated with salt stress at the indicated time points．Data in B～F are presented as mean ± standard deviation(n=3,*P≤0．05 vs．WT,Student’s t-test)．

3 討論

在植物生長與發(fā)育過程中,鹽、高溫和干旱等逆境脅迫條件下產(chǎn)生的離子毒害和滲透脅迫會打破其ROS生成和清除之間的平衡,使體內(nèi)產(chǎn)生的ROS多于代謝的ROS,造成氧化應(yīng)激[27]。過氧化氫酶(CAT)是一類非常重要的抗氧化酶,能夠消除植物中因逆境脅迫而積累的ROS,使之維持合適濃度,因此在植物的非生物逆境響應(yīng)中起著關(guān)鍵作用[28]。為了探究CatB對逆境的響應(yīng)情況,我們建立了OsCatB基因的CRISPR/Cas9基因敲除體系,并成功獲得了OsCatB基因敲除的3個(gè)獨(dú)立純合突變株系catb-1、catb-2和catb-3(圖1)。由于catb-2的種子量不夠,所以在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中我們僅選取catb-1和catb-3用于逆境脅迫的生理及生化分析。

圖3 幼苗期catb突變體對熱脅迫的響應(yīng)分析(A)熱脅迫下catb和野生型幼苗的表型。生長21 d的水稻幼苗用45℃16 h(光照)和35℃8 h(黑暗)循環(huán)處理7 d,然后28℃恢復(fù)培養(yǎng)20 d;(B)恢復(fù)培養(yǎng)20 d后的catb和野生型幼苗的存活率;(C～D)catb和野生型幼苗地上部分和根部在不同熱處理時(shí)間的CAT酶活性;(E～F)catb和野生型幼苗地上部分和根部在不同熱處理時(shí)間的H2O2含量。圖B～F中的數(shù)值代表的是平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3,t檢驗(yàn)),*和 **分別表示與 WT 相比 P≤0．05、P≤0．01。Fig.3 Response analysis of catb mutants to heat stress at seedling stage(A)Phenotype of catb and WT seedlings under heat stress．Twenty-one-day-old seedlings were treated with the temperature cycle of 16 h at 45℃(light)and 8 h at 35℃(dark)for 7 d,and then recovered at 28℃for 20 d;(B)Survival rates of catb and WT seedlings after recovery for 20 d;(C～D)CAT activities of shoots and roots of catb and WT seedlings treated with heat stress at the indicated time points;(E～F)H2O2contents of shoots and roots of catb and WT seedlings treated with heat stress at the indicated time points．Data in B～F are presented as mean ± standard deviation(n=3,Student’s t-test)．*and**represent P≤0．05 and P≤0．01,respectively．

圖4 幼苗期catb突變體對MV的響應(yīng)分析(A)MV處理下catb和野生型材料的表型。催芽5 d的水稻材料用正常的1/2 MS培養(yǎng)液或含有2 μmol/L MV的1/2 MS培養(yǎng)液處理6 d。標(biāo)尺=1 cm;(B)0 μmol/L或2 μmol/L MV處理6 d后catb和野生型幼苗的高度。圖中數(shù)值代表的是平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=20,t檢驗(yàn)),*和 **分別表示與 WT 相比 P≤0．05、P≤0．01。Fig.4 Response analysis of catb mutants to MV at seedling stage(A)Phenotype of catb and WT seedlings treated with MV．Following pre-germination treatment for 5 days,the germinated seeds were transplanted into either 1/2 MS medium or 1/2 MS medium supplemented with 2 μmol/L MV for 6 d．Bar=1 cm;(B)Seedling heights of catb and WT seedlings treated with 0 μmol/L or 2 μmol/L MV for 6 d．Data are presented as mean ± standard deviation(n=20,Student’s t-test)．*and**represent P≤0．05 and P≤0．01,respectively．

CAT家族在水稻中有CatA、CatB和CatC等3個(gè)成員,而在擬南芥中也有Cat1、Cat2和Cat3等3個(gè)成員,各成員在不同逆境響應(yīng)中起著不同的作用[14]。在擬南芥中,Cat3主要正調(diào)控干旱脅迫響應(yīng),其可以被鈣依賴蛋白激酶CPK8磷酸化而激活,進(jìn)而降解因干旱積累的H2O2,以增強(qiáng)植株的抗旱性[29]。近期,Zhou等[23]發(fā)現(xiàn)CatC能正調(diào)控水稻的耐鹽性,在水稻體內(nèi)ROS的清除中起著重要作用。CatC在鹽脅迫條件下被類受體胞質(zhì)激酶STRK1磷酸化而激活,激活的CatC可清除因鹽脅迫誘導(dǎo)積累的過量H2O2,從而提高水稻的耐鹽性。在本研究中,鹽脅迫處理下OsCatB基因敲除突變體catb的表型與野生型對比不明顯,只顯示出微弱的鹽敏感性;同時(shí),CAT酶活和H2O2含量的差異也不顯著(圖2C～F),甚至在5個(gè)時(shí)間點(diǎn)中存在幾個(gè)點(diǎn)的野生型和突變體數(shù)據(jù)很相近。因此,我們猜測在清除因鹽脅迫累積的ROS時(shí),CatB僅起輔助作用,而起主導(dǎo)作用的還是CatC。此外,我們還分析了在高溫與氧化脅迫下野生型和catb突變體的表型、CAT酶活和H2O2含量,發(fā)現(xiàn)與野生型相比,突變體均表現(xiàn)出對高溫和氧化脅迫的超敏感,而且體內(nèi)的CAT酶活顯著降低,H2O2的累積量顯著升高(圖3和圖4)。因此,我們可以推測,水稻體內(nèi)OsCatB基因的敲除,導(dǎo)致了由高溫和氧化脅迫所積累的ROS無法及時(shí)清除,從而造成植物自身的氧化損傷。該結(jié)果也同時(shí)說明,OsCatB具有正調(diào)控水稻耐高溫和耐氧化脅迫的能力,在作物的遺傳改良中具有一定的應(yīng)用潛力,但是與其相關(guān)的分子作用機(jī)理仍需要進(jìn)一步研究。

總之,本研究初步發(fā)現(xiàn)OsCatB對水稻鹽脅迫響應(yīng)的調(diào)控不明顯,主要參與了高溫和氧化脅迫響應(yīng),并正調(diào)控水稻的高溫和氧化脅迫耐受性。同時(shí),該研究為進(jìn)一步探究OsCatB參與逆境響應(yīng)的分子機(jī)制和培育抗逆水稻品種提供了一定的理論指導(dǎo)和遺傳材料。