耐受性樹突狀細胞的研究進展

孫廬云,丁 喆,陳 鵬,劉 鋒,寶福凱*,胡明道*

(昆明醫(yī)科大學(xué)a．第二臨床學(xué)院;b．病原生物學(xué)與免疫學(xué)系,中國云南昆明650500)

樹突狀細胞(dendritic cell,DC)是機體內(nèi)最強的抗原呈遞細胞,在激活適應(yīng)性免疫和促進免疫耐受過程中均發(fā)揮著重要作用,其中能夠誘導(dǎo)免疫耐受的DC群被定義為耐受性樹突狀細胞(tolerogenic dendritic cell,tolDC)。tolDC可誘導(dǎo)移植后同種異體移植物的持久免疫耐受性,抑制移植排斥反應(yīng)與自身免疫疾病的發(fā)展[1]。實施器官移植術(shù)后的病人需終身服用免疫抑制劑,但長期服用免疫抑制劑易產(chǎn)生耐藥性和藥毒性,還可能引起機體更嚴(yán)重的排斥反應(yīng)[2]。機體的免疫耐受性決定了受體對供體器官的接受程度。因此,提高受體免疫耐受性可顯著降低移植術(shù)后的排斥反應(yīng)及相關(guān)并發(fā)癥,增加供體器官存活率,提高患者的生活質(zhì)量。目前,多項研究揭示了tolDC應(yīng)用于移植和自身免疫性疾病治療的機制,這對減少移植排斥后的感染和其他病變的發(fā)生具有重要意義。

1 tolDC誘導(dǎo)免疫耐受

T細胞應(yīng)答是機體對抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié),DC可誘導(dǎo)T細胞的活化與耐受,具有雙重功能。DC在體內(nèi)識別抗原后通過3個階段激活T細胞增殖。首先通過主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex,MHC)和T細胞受體(T cell receptor,TCR)結(jié)合上調(diào)MHCⅡ,然后共刺激因子和共刺激因子受體結(jié)合,上調(diào)CD80和CD86的表達,最后刺激T細胞生長因子,促進T細胞增殖。與免疫刺激相反,進入外周組織定居分化的tolDC向T細胞呈遞抗原后則表現(xiàn)出免疫抑制。

tolDC由未成熟樹突狀細胞(immature dendritic cell,imDC)和半成熟樹突狀細胞(semimature dendritic cell,semiDC)組成,主要介導(dǎo)T細胞的失活、凋亡以及誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cell,Treg)的生成。未成熟的DC低表達CD80、CD86、CD40和MHC,這些因子是激活T細胞所必需的輔助因子。因此,由于缺乏多種共刺激分子,imDC和semiDC不能活化T細胞,這導(dǎo)致抗原提呈后T細胞的無能或低能反應(yīng)。此外,tolDC表達吲哚胺2,3雙加氧酶(indoleamine 2,3 dioxygenase,IDO),IDO可催化色氨酸降解為各種色氨酸衍生的代謝物,進而干擾T細胞生長周期、抑制T細胞增殖和促進T細胞凋亡;tolDC還過度表達抑制性分子,如人類白細胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)、程序性死亡配體-1/2(programmed death ligand-1/2,PD-L1/2),以及增加其致耐受性潛力的半乳凝素[3～5]。另外,tolDC亦可通過表達血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)抑制T細胞、自然殺傷細胞(natural killer cell,NK cell)的活性,與Treg建立抑制性反饋回路,同時HO-1能誘導(dǎo)血紅素的分解代謝,而分解產(chǎn)生的一氧化碳可通過線粒體依賴性機制調(diào)節(jié)DC免疫原性。當(dāng)用特異性HO-1誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)tolDC后,IL-12p70表達降低,IL-10表達升高,tolDC耐受性增加;若阻斷HO-1,tolDC的免疫調(diào)節(jié)能力將會喪失[6]。研究證明,在小鼠心臟移植中應(yīng)用特異性的HO-1誘導(dǎo)劑可抑制DC成熟和同種異體T細胞增殖,從而延長同種異體移植物存活時間和延緩移植物排斥反應(yīng)[7]。

Treg是維持機體免疫耐受的重要因素。tolDC通過細胞-細胞接觸依賴信號、分泌靶向蛋白和細胞因子等機制來誘導(dǎo)Treg生成[8]。在器官周圍的淋巴管中,tolDC分泌的IL-10可調(diào)節(jié)CD4+CD25+Foxp3+T細胞(Treg)的分化和增殖[9];PD-L1與PD-1(programmed cell death-1)在T細胞上相互作用后加強Foxp3蛋白的表達,誘導(dǎo)T細胞失活,促進Treg生成[10]。而Treg通過分泌IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子-β (transforming growth factor-β,TGF-β)下調(diào)DC表面MHCⅡ類分子和共刺激分子的水平,當(dāng)DC成熟度下降,不能有效刺激T細胞的增殖反應(yīng)時,則通過負反饋機制激活更多Treg細胞的生成[11]。此外,Treg對DC具有較強的粘附性,導(dǎo)致FasCIN(actin bundling protein)不能與DC有效結(jié)合,FasCIN是免疫突觸形成中的一種重要肌動蛋白[12],對維持DC未成熟狀態(tài)和耐受性具有重要意義。由此可見,tolDC能誘導(dǎo)機體生成Treg,Treg亦能調(diào)節(jié)tolDC的耐受性,tolDC和Treg的相互作用對誘導(dǎo)免疫耐受起了重要作用。

2 tolDC的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)

tolDC主要由人血單核細胞(如CD14+細胞)、嚙齒類動物骨髓細胞、非人靈長類動物CD34+細胞產(chǎn)生。不同的免疫抑制劑應(yīng)用于自身免疫性疾病和移植后,也可通過不同的生物學(xué)機制促進tolDC生成。

2.1 地塞米松誘導(dǎo)培養(yǎng)

研究表明地塞米松(dexamethasone,DEX)可以阻礙DC分化、成熟和誘導(dǎo)凋亡,當(dāng)聯(lián)合使用DEX、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)和IL-4后可在小鼠骨髓細胞、人類單核細胞中誘導(dǎo)培養(yǎng)產(chǎn)生高效耐受的tolDC[13]。不僅如此,DEX誘導(dǎo)產(chǎn)生的tolDC在脫離DEX刺激后仍能保持?jǐn)?shù)天,甚至一周的耐受性[14]。然而,用DEX單一誘導(dǎo)產(chǎn)生tolDC時分化生成的細胞較少,這可能與DEX濃度和暴露于外界的時長有關(guān)[13,15]。Lee等[13]研究發(fā)現(xiàn),聯(lián)合使用DEX和米諾環(huán)素(minocycline,MIN)能有效增加細胞分化的數(shù)量;與DEX單一誘導(dǎo)相比,向DEX處理的培養(yǎng)物中加入MIN可使DC的產(chǎn)生增加至約220%,且MIN和DEX聯(lián)合誘導(dǎo)產(chǎn)生的tolDC表現(xiàn)出的免疫耐受性至少等于或優(yōu)于單一誘導(dǎo)產(chǎn)生的耐受性。

2.2 維生素D3誘導(dǎo)培養(yǎng)

維生素D3(vitamin D3,VitD3)是一種多效性激素,可調(diào)節(jié)機體鈣的平衡,促進固有免疫的同時抑制適應(yīng)性免疫,其誘導(dǎo)生成的tolDC會分泌大量IL-10,這一方面可促進調(diào)節(jié)性B細胞(regula tory B cell,Breg)的生成,抑制炎癥反應(yīng),降低共刺激因子和MHCⅡ的表達,另一方面還能抑制T細胞活性、遷移和促進Treg生成[16～17]。研究顯示,與其他培養(yǎng)方式相比,VitD3和DEX聯(lián)合誘導(dǎo)培養(yǎng)的tolDC更能在營養(yǎng)不良(或缺乏)的內(nèi)環(huán)境中生存,且具有較強的抗氧化能力,同時對同種異體T細胞增殖的抑制作用也要強于單一誘導(dǎo)培養(yǎng)產(chǎn)生的tolDC[18]。

2.3 雷帕霉素誘導(dǎo)培養(yǎng)

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)常被用作抗癌藥物和免疫抑制劑,其中復(fù)合物mTORC1(mammalian target of rapamycin complex 1)和mTORC2主要作用于DC。雷帕霉素(rapamycin,RAPA)通過抑制mTORC1減少DC自噬和內(nèi)源性抗原呈遞功能,降低MHCⅡ和共刺激因子的表達,從而抑制DC成熟,調(diào)節(jié)DC功能[19]。研究表明,RAPA通過抑制絲氨酸/蘇氨酸(serine/threonine,Ser/Thr)蛋白激酶途徑來抑制T細胞活性并促進Foxp3+Treg細胞分泌,其誘導(dǎo)分化的tolDC應(yīng)用于小鼠心臟移植模型時能延長移植物的存活時間,間接促進外周免疫耐受和減少移植后的排斥反應(yīng)[20]。

2.4 細胞因子誘導(dǎo)培養(yǎng)

具有免疫抑制作用的細胞因子具有誘導(dǎo)tolDC生成的功能,如γ干擾素(interferon-γ,IFN-γ)、肝細胞因子和IL-12[21]。本實驗室前期通過在體外恒河猴骨髓CD34+細胞中加入重組GMCSF、IL-4和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)得到了高純度且典型的 tolDC[22]。不同的細胞因子所誘導(dǎo)培養(yǎng)的DC在功能上有一定差異。IL-10和TGF-β誘導(dǎo)培養(yǎng)的tolDC已廣泛應(yīng)用于動物實驗和人類自身免疫性疾病的試驗中。研究表明,IL-10和TGF-β誘導(dǎo)培養(yǎng)的tolDC具有更強的免疫耐受表型和促腫瘤逃逸作用[23];IL-10誘導(dǎo)生成的tolDC可以高表達CCR7,具有較強的遷移能力,且能誘導(dǎo)CD4+和CD8+T細胞抗原特異性失活及Treg生成[24]。另外,Boks等[25]發(fā)現(xiàn)IL-10誘導(dǎo)培養(yǎng)的tolDC在免疫耐受性和抑制 T細胞活性方面優(yōu)于 VitD3、DEX、RAPA和TGF-β誘導(dǎo)培養(yǎng)的tolDC。因此,在免疫耐受治療中IL-10誘導(dǎo)培養(yǎng)的tolDC被認為是最佳選擇。最新研究發(fā)現(xiàn),CD141和CD163可穩(wěn)定地高表達于IL-10體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的tolDC表面,這對篩選tolDC具有重要意義[26]。TGF-β誘導(dǎo)的tolDC一方面提供上調(diào)PD-L1,促進T細胞失活;另一方面通過下調(diào)MHC和共刺激因子的表達,抑制DC抗原呈遞能力,從而維持DC的未成熟狀態(tài)[12]。不同誘導(dǎo)劑量的IFN-γ對DC成熟度有一定影響,通常低劑量IFN-γ可誘導(dǎo)生成tolDC。Li等[27]發(fā)現(xiàn)IFN-γ通過犬尿氨酸-AhR途徑維持IDO在tolDC中的表達,而受此影響生成的Treg對腫瘤細胞識別具有較強的敏感性。

除了上述幾種誘導(dǎo)方法外,其他一些免疫抑制劑也可促進tolDC生成,例如:麥考酚嗎乙酯[28]在嚙齒類動物實驗?zāi)Ｐ椭斜蛔C實具有延長移植物存活時間、抑制T細胞增殖和DC成熟的功能;維甲酸[29]通過干擾NF-κB通路,抑制DC成熟和IL-12p70分泌?？偟膩碇v,不同免疫抑制劑具有不同的細胞毒性,誘導(dǎo)分化和生成的tolDC的特征也各不相同(表1),因此,針對不同情況,應(yīng)選擇合適的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)方法。

表1 不同體外誘導(dǎo)方法培養(yǎng)的tolDC的特征Table 1 The characteristics of tolDC cultured with different methods in vitro

3 tolDC相關(guān)的miRNA調(diào)控機制

miRNA是一種微小的調(diào)控性非編碼RNA,它通過抑制轉(zhuǎn)錄或加速目標(biāo)mRNA的降解,最終導(dǎo)致靶蛋白的合成受到抑制[30]。DC是啟動、調(diào)控并維持免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)。目前越來越多的研究表明,miRNA參與調(diào)控了DC的發(fā)育分化、成熟、抗原提呈、活化T細胞功能及細胞因子的釋放[31]。當(dāng)機體受到外界刺激時,體內(nèi)miRNA的表達會受到影響,其通過介導(dǎo)對DC功能的調(diào)控,進而影響機體免疫應(yīng)答的過程。

miR-let-7i是最早發(fā)現(xiàn)的miRNA之一,當(dāng)抑制miR-let-7i表達時,DC表面共刺激因子CD80、CD86的表達下調(diào),同時促炎因子的表達下降,活化T細胞的能力降低,導(dǎo)致DC耐受性增加;此外,miR-let-7i的低表達還可以促進Treg生成[32]。相關(guān)研究報道,miR-let-7i通過結(jié)合SOCS1(suppressor of cytokine signaling 1)和BLIMP(B lympho cyte-induced maturation protein-1)的 3′非翻譯區(qū)(3′-untranslated region,3′-UTR)影響 DC 的分化成熟,誘導(dǎo)T細胞低反應(yīng)性[33]。另有研究表明,miR-203在tolDC中的表達顯著上調(diào),而miR-135a的表達則顯著下調(diào),前者的作用靶點是SOCS3,SOCS3表達下調(diào)會持續(xù)激活STAT3信號通路,引起白細胞浸潤,促炎因子IL-6分泌增多,最終影響tolDC的耐受性[34～35];后者會引起GATA-3(GATA binding protein-3)表達升高,IFN-γ表達減少,從而干預(yù)機體Th1/Th2平衡的調(diào)節(jié)過程,影響tolDC生成[36]。影響DC分化過程中很重要的一條通路便是Notch/Wnt信號通路。研究報道,miR-125a和miR-99b能共同調(diào)控Wnt1和JAG1(Notch 的配體)的表達,促進 DC 的分化[37～38]。miR-23b亦可抑制Notch/Wnt信號通路,除此之外,它還能抑制NF-κB信號通路,進而促進DC耐受性增加和Treg生成[39];miR-214促進Treg生成則是通過β-catenin信號通路[40]。另一方面,當(dāng)DC受到Toll樣受體和非Toll樣受體刺激后能分泌一些細胞因子,這些細胞因子可參與T細胞分化過程,如IL-10和IL-17;其中,IL-17的表達受到miR-133b的調(diào)控,且miR-133b特異性表達于TH17細胞[41]。以上miRNA調(diào)節(jié)DC耐受性的主要過程如圖1所示。另外,miRNA調(diào)控tolDC的具體靶標(biāo)及相關(guān)研究可見表2。綜上可知,一種miRNA可以調(diào)控多種信號通路,其通過不止一種機制調(diào)控DC以影響其耐受性,且同一靶標(biāo)可能受多種miRNA調(diào)控。

miRNA廣泛分布于動物體內(nèi),通過轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)節(jié),參與細胞的生命活動,間接在固有免疫和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[31]。一種miRNA可以調(diào)控的mRNA不止一種,不同的靶基因通過不同的途徑影響著DC的耐受性,通過增加DC的耐受性,間接增強了移植物的耐受性、延緩了免疫排斥反應(yīng)和自身免疫性疾病的發(fā)展,體現(xiàn)了基因靶向治療在移植和自身免疫性疾病中的潛在應(yīng)用價值。本課題組在前期培養(yǎng)、鑒定恒河猴骨髓來源的imDC[22]基礎(chǔ)上,建立了恒河猴肝移植模型,著重研究抑制DC細胞miR-let-7i和miR-155后,恒河猴肝移植免疫耐受發(fā)生的機制。然而,復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)之間關(guān)系錯綜復(fù)雜,不同的調(diào)控之間是否有聯(lián)系還值得進一步探索。近年來,研究者對于miRNA調(diào)控機制的研究取得了較大進展,這有助于為進一步尋找依賴于tolDC的免疫治療提供新思路。

表2 miRNA通過特定靶點調(diào)控tolDCTable 2 tolDCs regulated by miRNAs through specific targets

4 tolDC的應(yīng)用

4.1 tolDC在移植中的應(yīng)用

圖1 miRNA介導(dǎo)的DC耐受性調(diào)節(jié)不同顏色的miRNA代表不同的狀態(tài),其中紅色表示miRNA上調(diào),綠色表示miRNA下調(diào)。miRNA介導(dǎo)DC耐受性增加的機制亦用不同顏色標(biāo)識,其中紅色表示生成增多,綠色表示生成減少或受抑制。Fig.1 Regulation of DC tolerance through miRNAsDifferent colors represent different states of miRNAs．Red represents the upregulated miRNAs,and green represents the downregulated miRNAs．Mechanisms which mediate increased tolerance of DCs by miRNAs are marked in different colors,with red indicating increased production and green indicating decreased production or suppressed state．

當(dāng)患者對免疫抑制劑敏感或耐藥時,tolDC注射已成為一種新型輔助治療方式,其可通過改變DC和T細胞的反應(yīng)來減少排斥反應(yīng)。在嚙齒類動物模型中,移植前一周向受體體內(nèi)輸注供體tolDC可延長移植物存活時間[42]。Peng等[43]用半乳凝素-1誘導(dǎo)的供體源性tolDC聯(lián)合凋亡淋巴細胞注射后提高了Treg的反應(yīng)性,促進了T細胞凋亡,從而延長了肝移植物的存活時間。在恒河猴的腎移植模型中,研究人員分別采用靜脈注射和脈沖式靜脈注射的方式向受體猴輸入由VitD3和IL-10刺激產(chǎn)生的供體源性tolDC,結(jié)果顯示:采用靜脈輸注方式輸入供體源性tolDC后,移植物中供體的反應(yīng)性記憶T細胞選擇性減弱,同時CTLA4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4)和PD-1的表達上調(diào),腎移植物存活時間延長[44];采用脈沖式靜脈輸注方式輸入供體源性tolDC后,受體中IL-17的表達降低,T細胞反應(yīng)性下降,腎移植物存活時間延長[45]。Zahorchak等[46]通過人血分離模擬實驗證實VitD3和IL-10誘導(dǎo)分化的tolDC在抗成熟性方面優(yōu)于其他誘導(dǎo)劑產(chǎn)生的tolDC;在tolDC中PD-L1/CD86比例越高,細胞效能則越好。目前,匹茲堡大學(xué)醫(yī)學(xué)中心已將供體源性的由VitD3和IL-10誘導(dǎo)分化的tolDC聯(lián)合霉酚酸應(yīng)用于肝移植的臨床Ⅰ期試驗[47]。就tolDC的來源而言,在促進移植物存活方面,供體源性tolDC由于缺乏MHC、共刺激因子和促炎性因子的表達,更能促進特異性免疫耐受;從治療價值考慮,供體源性tolDC也要優(yōu)于受體源性tolDC[48]。當(dāng)然,在移植中,炎癥反應(yīng)和某些免疫抑制劑的應(yīng)用也可能引起細胞壞死或應(yīng)激細胞的吞噬,刺激DC分化為成熟的免疫原性細胞,干擾tolDC免疫表型的穩(wěn)定,影響tolDC的耐受性;盡管如此,已有臨床研究表明,免疫抑制劑聯(lián)合應(yīng)用比單一應(yīng)用療效好,且不會干擾tolDC的活性[49]。綜上所述,對于移植的細胞治療而言,tolDC的來源、誘導(dǎo)方法、輸注方式等均可能與其治療效果息息相關(guān)。

4.2 tolDC在自身免疫性疾病中的應(yīng)用

tolDC治療已廣泛應(yīng)用于自身免疫性疾病的臨床試驗中,對某些疾病治療的可行性已得到證實,如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、克羅恩病、Ⅰ型糖尿病等[50]。在多發(fā)性硬化癥和視神經(jīng)脊髓炎的1b期臨床試驗中,Nafarrate等[51]將體外誘導(dǎo)培養(yǎng)出的tolDC使用致病性自身抗原負載,再重新輸入人體內(nèi)實施治療,結(jié)果顯示:患者體內(nèi)IL-10增加,IFN-γ減少,且Th0細胞向Th2細胞分化。抗原負載的tolDC治療是一種特異性的治療方法,不僅可模擬抗原和DC結(jié)合,直接刺激效應(yīng)細胞,還能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗原特異性效應(yīng)T細胞。在Ⅰ型糖尿病的臨床Ⅰ期試驗中,Giannoukakis等[52]用針對CD40、CD80和CD86的反義寡核苷酸誘導(dǎo)培養(yǎng)的免疫抑制性tolDC治療后發(fā)現(xiàn),皮內(nèi)給藥較靜脈給藥更易產(chǎn)生免疫耐受性,且患者無明顯不良反應(yīng);同時,應(yīng)用自體tolDC治療的患者其體內(nèi)B220+CD11c-B細胞有效增加,但tolDC的療效暫未得到證實。在大多數(shù)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者中人們檢測出了抗瓜氨酸抗體,瓜氨酸是合成L-精氨酸的前體,L-精氨酸具有抗排斥和增強免疫耐受的功能,Benham等[53]采取瓜氨酸抗原負載的tolDC對患者實施治療后發(fā)現(xiàn),Treg/T細胞比值增加,DAS28下降,且未誘發(fā)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)作。此外,在治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡方面,有研究者提出通過靶向患者體內(nèi)的DC并改變細胞表型促使其轉(zhuǎn)換為tolDC,或通過基因工程技術(shù)改造tolDC,誘導(dǎo)患者體內(nèi)生成特異的Treg[54]。由于各種自身免疫性疾病的發(fā)病機制不同,且患者的遺傳背景也不同,因此tolDC的免疫療法需視具體情況選擇。隨著二代測序技術(shù)的普及,tolDC轉(zhuǎn)錄譜特征[26,55]的分析對研究tolDC細胞表型、生物標(biāo)記物具有重要意義,可為tolDC的免疫療法奠定基礎(chǔ)。

5 結(jié)語與展望

tolDC在抑制器官移植排斥和防止自身免疫疾病中有著廣泛的應(yīng)用前景,受到越來越多學(xué)者的重視。tolDC是適應(yīng)性免疫反應(yīng)的基礎(chǔ),可由多種藥物誘導(dǎo)產(chǎn)生,且不同藥物誘導(dǎo)的tolDC具有其獨特的功能,這在不同的移植物、自身免疫性疾病實驗?zāi)Ｐ秃团R床應(yīng)用中已得到相應(yīng)證實。值得注意的是,器官存在其獨特的免疫耐受性,如肝移植術(shù)后,受體可在不服用任何抗排斥藥的情況下對移植物不產(chǎn)生排斥反應(yīng)。這可能與tolDC通過不同的外周免疫耐受途徑介導(dǎo)移植免疫耐受和延長移植物存活時間有關(guān),而tolDC具體如何識別相應(yīng)途徑和調(diào)節(jié)細胞因子,部分機制仍未清楚。另外,為了防止使用tolDC時對機體造成其他不良的免疫反應(yīng),應(yīng)用于人體治療的tolDC在功能穩(wěn)定性、抗成熟性、純度和數(shù)量等方面都具有較高的要求。因此,仍需要通過更多動物模型、體內(nèi)實驗尤其是臨床試驗來探索tolDC發(fā)揮免疫耐受的機制,這對將來移植免疫耐受和自體免疫性疾病的防治具有重大意義。