聯(lián)合TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫構(gòu)建和分析胃癌中circRNA相關(guān)的ceRNA網(wǎng)絡(luò)

李 讓,廖苑君,孫勝南,藍(lán)樹金,趙小蕾,覃繼恒,饒紹奇*

(廣東醫(yī)科大學(xué)a．公共衛(wèi)生學(xué)院;b．醫(yī)學(xué)系統(tǒng)生物學(xué)研究所,中國廣東東莞523808)

作為嚴(yán)重危害人類健康的消化道惡性腫瘤之一,胃癌的發(fā)病率和死亡率在惡性腫瘤中分別處于第5位和第3位[1]。各種治療手段的應(yīng)用使得胃癌患者的5年生存率有所上升,但胃癌晚期患者的預(yù)后仍然較差。目前,胃癌仍是威脅人類健康的復(fù)雜疾病,其發(fā)生、發(fā)展機(jī)制尚未完全明確。

競爭性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)的概念由哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院Poliseno等[2]首先提出,其并非一種全新的RNA,而是代表了一種新的基因表達(dá)調(diào)控模式。既往研究表明,微RNA(microRNA,miRNA)通過與靶mRNA的3′非翻譯區(qū)(3′-untranslated region,3′-UTR)結(jié)合抑制靶mRNA的翻譯,實現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá),從而調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長、發(fā)育[3]。在ce-RNA的理論假說中,任何擁有miRNA反應(yīng)元件(miRNA response element,MRE)結(jié)構(gòu)的RNA都可以作為ceRNA,包括環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)、長鏈非編碼 RNA(long noncoding RNA,lncRNA)、mRNA和假基因轉(zhuǎn)錄物等。作為ceRNA家族的一員,circRNA同樣能夠通過競爭性地結(jié)合miRNA來調(diào)控基因的表達(dá)[4]。circRNA因5′和3′端通過共價鍵相連而呈封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu)[5],相對于線性RNA,特殊的結(jié)構(gòu)使得circRNA擁有更強(qiáng)的穩(wěn)定性和更高的保守性[6]。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展,大量潛在的circRNA被發(fā)現(xiàn),并且被證實作為腫瘤的重要調(diào)節(jié)因子與癌癥的發(fā)生密切相關(guān)[7～9]。近年來,越來越多的研究表明circRNA在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用[10～11]。此外,circ-RNA具有的分布范圍廣、保守性高、組織表達(dá)特異性高等特點,也預(yù)示著其有望成為胃癌診斷的生物標(biāo)志物或胃癌治療的靶點[12～13]。

基于生物信息學(xué)分析和多數(shù)據(jù)庫的聯(lián)合應(yīng)用,本研究挖掘了胃癌中差異表達(dá)的circRNA、miRNA和mRNA并構(gòu)建了ceRNA網(wǎng)絡(luò);隨后,利用網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵傩苑治鍪侄?鑒定了核心的circ-RNA并提取了circRNA介導(dǎo)的ceRNA子網(wǎng);最后,以ceRNA機(jī)制為切入點研究了核心circRNA在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制,這為胃癌的診斷與治療提供了潛在靶點,同時也為研究circRNA在胃癌中的作用機(jī)制提供了新的思路。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

從GEO(Gene Expression Omnibus)數(shù)據(jù)庫[14]中按照以下標(biāo)準(zhǔn)獲取胃癌的circRNA基因芯片數(shù)據(jù):以“gastric cancer”&“circRNA”為關(guān)鍵詞檢索與胃癌相關(guān)的circRNA基因芯片;選擇物種為“Homo sapiens”、研究類型為“expression profiling by array”兩個過濾條件進(jìn)一步篩選數(shù)據(jù);最后選定實驗設(shè)計符合病例對照研究類型并且病例與對照的組織樣本數(shù)均大于或等于3的芯片。根據(jù)篩選結(jié)果,我們下載了兩套胃癌的circRNA基因芯片:GSE13-1414(包含3個胃癌組織和3個非癌組織)和GSE100170(包含5個胃癌組織和5個非癌組織)。

作為目前最權(quán)威的癌癥基因信息數(shù)據(jù)庫,TCGA(The Cancer Genome Atlas)數(shù)據(jù)庫[15]覆蓋 33 種癌癥類型,含有超過30 000例的腫瘤樣本以及20 000個基因的表達(dá)信息。本研究利用gdc-client工具從TCGA數(shù)據(jù)庫下載了胃癌的RNA-seq和miRNA-seq數(shù)據(jù),其中RNA-seq數(shù)據(jù)包括30個正常樣本和343個腫瘤樣本,miRNA-seq數(shù)據(jù)包括45個正常樣本、446個腫瘤樣本及406個病人的生存數(shù)據(jù)。

1.2 差異表達(dá)RNA的篩選

利用 R 語言(版本 3．5．0)和 Bioconductor平臺中的limma包對芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析[16],篩選差異表達(dá)的circRNA(DE-circRNA),納入標(biāo)準(zhǔn)為:P value＜0．05,|log2fold change(log2FC)|＞1。取 GSE1-31414和GSE100170芯片中差異表達(dá)的circRNA的交集作為最終篩選出來的DE-circRNA。

對于從TCGA數(shù)據(jù)庫下載的RNA-seq和miRNA-seq數(shù)據(jù),首先去除平均表達(dá)值低于1的mRNA和miRNA,隨后利用edgeR包進(jìn)行差異分析[17],最后通過錯誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate,FDR)校正,以 FDR＜0．05 同時|log2FC|＞1 為標(biāo)準(zhǔn)篩選出差異表達(dá)的miRNA(DE-miRNA)和mRNA(DE-mRNA)。

1.3 ceRNA網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

首先,采用CircInteractome數(shù)據(jù)庫預(yù)測DE-circRNA和DE-miRNA的調(diào)控關(guān)系[18],構(gòu)建circ-RNA-miRNA關(guān)系對。隨后,利用miRDB、miRTarBase和TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測DE-miRNA和DE-mRNA的調(diào)控關(guān)系[19],將同時在任意兩個或兩個以上數(shù)據(jù)庫都被預(yù)測到的miRNA-mRNA調(diào)控關(guān)系納入后續(xù)的分析中。最后,基于共享的miRNA構(gòu)建circRNA-miRNA-mRNA ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò),并利用 Cytoscape 軟件(版本 3．6．1)對調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化[20]。

1.4 關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)的提取

研究表明網(wǎng)絡(luò)中的核心節(jié)點(拓?fù)鋵傩郧?0%～20%)在疾病網(wǎng)絡(luò)中扮演者關(guān)鍵角色[21～22],而這些核心節(jié)點一旦受到破壞,將會影響網(wǎng)絡(luò)的功能,進(jìn)而影響疾病的發(fā)生發(fā)展[22]。本研究利用Cytoscape軟件的NetworkAnalyzer工具對構(gòu)建的ceRNA網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵傩苑治鯷23],合并度數(shù)(degree)、中介中心性(betweenness centrality)、輻射力(radiality)3種指標(biāo),取網(wǎng)絡(luò)中處于前10%的節(jié)點作為核心節(jié)點,并根據(jù)這些核心節(jié)點從原始的ceRNA網(wǎng)絡(luò)中提取子網(wǎng)。

1.5 功能富集分析和生存分析

通過在線網(wǎng)站KOBAS對子網(wǎng)進(jìn)行KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析[24],分析子網(wǎng)行使的生物學(xué)功能。整合來自TCGA數(shù)據(jù)庫中胃癌的RNA表達(dá)數(shù)據(jù)和生存數(shù)據(jù),使用R語言的survival包對子網(wǎng)進(jìn)行生存分析,以挖掘預(yù)后相關(guān)的基因。

本研究遵循上述流程開展,技術(shù)路線見圖1。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)的RNA

圖1 數(shù)據(jù)獲取及分析流程圖Fig.1 The flow chart of data acquisition and analysis

芯片數(shù)據(jù)的差異表達(dá)分析結(jié)果顯示,在GSE131414與GSE100170芯片中分別獲得了1 522個和713個差異表達(dá)的circRNA,兩者取交集后得到45個circRNA(圖2A～C)。對于RNA-seq數(shù)據(jù)和miRNA-seq數(shù)據(jù),差異分析后分別獲得了4 610個差異表達(dá)的mRNA和276個差異表達(dá)的miRNA(圖 2D,E)。．

2.2 原始ceRNA網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通過數(shù)據(jù)庫的預(yù)測構(gòu)建了1 538對circ-RNA-miRNA和2 029個miRNA-mRNA關(guān)系對。隨后,基于共享miRNA構(gòu)建了一個包含153對circRNA-miRNA和2 029個miRNA-mRNA關(guān)系對的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(圖3),其中包含39個circ-RNA、30個miRNA和1 303個mRNA。

2.3 circRNA介導(dǎo)的ceRNA子網(wǎng)絡(luò)

對原始ceRNA網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵傩赃M(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn),3個 circRNA節(jié)點(hsa_circ_0008468、hsa_circ_0005822、hsa_circ_0025842)和 3 個 mi-RNA 節(jié)點(hsa-miR-940、hsa-miR-944、hsa-miR-515-5p)在3種拓?fù)鋵W(xué)指標(biāo)排名中都處于前10%,提示它們?yōu)榫W(wǎng)絡(luò)的核心節(jié)點。根據(jù)3種指標(biāo)對節(jié)點進(jìn)行排序,前10個核心節(jié)點的拓?fù)鋮?shù)見表1。基于鑒定到的6個核心節(jié)點,我們從原始的ceRNA網(wǎng)絡(luò)中提取了子網(wǎng)絡(luò),其中包括3個circ-RNA、3個 miRNA和 501個 mRNA,共有 8對circRNA-miRNA和539個miRNA-mRNA關(guān)系對(圖 4)。

2.4 子網(wǎng)的功能富集分析

KEGG通路富集分析結(jié)果顯示,子網(wǎng)富集于代謝途徑(hsa01100)、cAMP 信號通路(hsa04024)、神經(jīng)活性配體-受體相互作用(hsa04080)、pathways in cancer(hsa05200)等多個有統(tǒng)計學(xué)意義的信號通路(圖 5)。

2.5 子網(wǎng)的生存分析

圖2 胃癌中差異表達(dá)的RNA(A)GSE100170芯片中差異表達(dá)的circRNA;(B)GSE131414芯片中差異表達(dá)的circRNA;(C)芯片中差異表達(dá)circRNA的韋恩圖;(D)TCGA數(shù)據(jù)庫中差異表達(dá)的mRNA;(E)TCGA數(shù)據(jù)庫中差異表達(dá)的miRNA。紅色和綠色的點分別代表上調(diào)和下調(diào)的RNA;黑色的點代表變化不顯著或變化倍數(shù)小的RNA。Fig.2 The differentially expressed RNAs in gastric cancer(A)Differentially expressed circRNAs in the GSE100170 chip;(B)Differentially expressed circRNAs in the GSE131414 chip;(C)Venn diagram of differentially expressed circRNAs;(D)Differentially expressed mRNAs in the TCGA database;(E)Differentially expressed miRNAs in the TCGA database．The red and green dots represent up-and down-regulated RNAs,respectively,and black dots represent the RNAs that do not reach the threshold for screening differentially expressed RNAs．

圖3 胃癌中circRNA介導(dǎo)的ceRNA網(wǎng)絡(luò)三角形、倒三角和圓形分別代表差異表達(dá)的circRNA、miRNA和mRNA;紅色代表上調(diào),綠色代表下調(diào)。Fig.3 The circRNA-mediated ceRNA network in gastric cancerTriangles,inverted triangles and circles represent DE-circRNA,DE-miRNA and DE-mRNA,respectively．The colors red and green represent up-regulation and down-regulation,respectively．

表1 原始ceRNA網(wǎng)絡(luò)中排名前10的circRNA和miRNA的拓?fù)鋵傩訲able 1 Topological properties of the top 10 circRNAs and miRNAs in the primary ceRNA network

生存分析發(fā)現(xiàn)子網(wǎng)中有14個基因與胃癌的預(yù)后顯著相關(guān)(P＜0．01)。其中,ACO2、E2F8 的高表達(dá)組相對于低表達(dá)組預(yù)后較好;而GHR、ITIH5、KLHDC8A、NPAS3、PDE2A、PDGFD、PNMA2、RAB9B、RECK、SLC24A2、TMEM55A、TMTC1 的高表達(dá)組相對于低表達(dá)組預(yù)后較差,結(jié)果見圖6。

3 討論

圖4 競爭性內(nèi)源RNA子網(wǎng)三角形、倒三角和圓形分別代表差異表達(dá)的circRNA、miRNA和mRNA;紅色代表上調(diào),綠色代表下調(diào)。Fig.4 The ceRNA subnetworkTriangles,inverted triangles and circles represent DE-circRNA,DE-miRNA and DE-mRNA,respectively．The colors red and green represent up-regulation and down-regulation,respectively．

圖5 KEGG功能富集圖Fig.5 The KEGG functional enrichment diagram

ceRNA概念的提出將傳統(tǒng)的相互作用模式由“miRNAs→mRNAs”網(wǎng)絡(luò)變成更加多元的“RNAs→miRNAs→mRNAs”復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[25]。在“miRNAs→mRNAs”互作網(wǎng)絡(luò)中,miRNA通過以單個miRNA調(diào)節(jié)多個不同mRNA或以多個不同的miRNA調(diào)節(jié)單個mRNA的方式作用于靶基因3′-UTR區(qū)域,實現(xiàn)對mRNA的降解或功能抑制。ceRNA概念的提出賦予了circRNA等非編碼RNA新的生物學(xué)功能[26],極大地豐富了轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。ceRNA競爭性結(jié)合miRNA,降低miRNA對靶基因mRNA的抑制作用,多種ceRNA、miRNA與mRNA之間的相互作用形成復(fù)雜的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[27],從而參與包括腫瘤發(fā)生發(fā)展在內(nèi)的一系列生物學(xué)過程[28～29]。隨著對circRNA認(rèn)識的不斷加深,circRNA被證實在腫瘤基因表達(dá)中扮演著不可或缺的調(diào)控作用[30],并且在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[31]。本研究通過GEO和TCGA數(shù)據(jù)庫的聯(lián)合應(yīng)用構(gòu)建了胃癌中由circRNA介導(dǎo)的原始ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò),并進(jìn)一步通過網(wǎng)絡(luò)分析挖掘了緊密聯(lián)系的核心節(jié)點,提取了關(guān)鍵子網(wǎng)。最后,對關(guān)鍵子網(wǎng)進(jìn)行了功能富集分析,以判斷網(wǎng)絡(luò)行使的生物學(xué)功能;同時,通過生存分析挖掘了與胃癌預(yù)后相關(guān)的基因。

圖6 ceRNA子網(wǎng)中14個預(yù)后基因的生存曲線Fig.6 The survival curves of 14 prognostic genes in ceRNA subnetwork

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),miRNA通過調(diào)控靶基因表達(dá)參與細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲等多種生物學(xué)行為[26]。利用網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩苑治?本研究挖掘了3個核心miRNA,分別為 hsa-miR-940、hsa-miR-944、hsamiR-515-5p。通過文獻(xiàn)搜索發(fā)現(xiàn),這3個核心節(jié)點已被報道與胃癌密切相關(guān),例如:Fan等[32]研究表明,hsa-miR-940通過hsa-miR-940/Cbl-b/STAT5a軸上調(diào)PD-L1(programmed death ligand-1)的表達(dá),從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和遷移;Pan等[33]研究證實,hsa-miR-944通過與MACC1(metastasis-associated in colon cancer 1)的 3′-UTR 序列結(jié)合下調(diào)MACC1在胃癌細(xì)胞中的表達(dá),從而抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和胃癌的轉(zhuǎn)移;Wang等[34]報道,hsa-miR-515-5p表達(dá)水平的上升抑制了胃癌的發(fā)生,并與胃癌細(xì)胞的生長和侵襲密切相關(guān)。文獻(xiàn)檢索的結(jié)果不僅證實了從原始ceRNA網(wǎng)絡(luò)中鑒定的3個核心miRNA在胃癌發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色,同時也印證了本文分析方法在網(wǎng)絡(luò)核心節(jié)點的識別方面擁有較高的準(zhǔn)確性。

通過對ceRNA子網(wǎng)進(jìn)行KEGG信號通路的富集分析,我們發(fā)現(xiàn)子網(wǎng)顯著富集到代謝途徑(hsa01100)、cAMP 信號通路(hsa04024)、神經(jīng)活性配體-受體相互作用(hsa04080)、pathways in cancer(hsa05200)等多個有統(tǒng)計學(xué)意義的信號通路(圖5)。其中,大部分通路已有文獻(xiàn)支持與腫瘤發(fā)生機(jī)制密切相關(guān),如經(jīng)典的PI3K-Akt信號通路,當(dāng)其被酪氨酸激酶受體激活后,磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)催化磷脂酰肌醇4,5-雙磷酸磷酸化為磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸,導(dǎo)致3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1(3-phosphoinositide dependent protein kinase 1,PDK1)和蛋白激酶B(protein kinase B,PKB;也稱作Akt)募集到質(zhì)膜并被激活,而后Akt作用于多個下游效應(yīng)因子,影響腫瘤細(xì)胞的生長、增殖和凋亡[35]。另外,Yin等[36]研究表明,嘌呤核苷酸是腫瘤細(xì)胞增殖的基礎(chǔ)和必要條件,在腫瘤細(xì)胞中嘌呤合成途徑的酶代謝得到了增強(qiáng),而且嘌呤代謝受損與癌癥的發(fā)展有關(guān)。Boroughs等[37]研究報道,癌細(xì)胞的生長和繁殖增加了其對營養(yǎng)物質(zhì)的攝取,而各種代謝途徑可為癌細(xì)胞的生長和增殖提供必要的物質(zhì)支持,其中代謝重編程被認(rèn)為是癌癥的標(biāo)志[38]。以上信息提示,hsa_circ_0008468、hsa_circ_000-5822和hsa_circ_0025842介導(dǎo)的ceRNA網(wǎng)絡(luò)參與了胃癌發(fā)生發(fā)展的多個生物學(xué)過程。

在生存分析中我們發(fā)現(xiàn)circRNA介導(dǎo)的子網(wǎng)中存在多個與胃癌預(yù)后相關(guān)的基因(圖6)。而3個核心的circRNA(hsa_circ_0008468、hsa_circ_000-5822、hsa_circ_0025842)可能通過 circRNA-mi-RNA-mRNA調(diào)控軸調(diào)節(jié)這些預(yù)后基因的表達(dá),從而影響胃癌病人的預(yù)后。例如:在hsa_circ_002-5842-hsa-miR-940-ACO2調(diào)控軸中,hsa_circ_002-5842 下調(diào)、hsa-miR-940 上調(diào)、ACO2 下調(diào)(圖 4)。hsa_circ_0025842的低表達(dá)會減弱其對hsa-miR-940的競爭性吸附,使得過量的hsa-miR-940與ACO2結(jié)合,從而使ACO2表達(dá)水平降低。本研究的生存分析結(jié)果(圖6)以及相關(guān)研究[39]都表明,ACO2低表達(dá)的胃癌患者相對于ACO2高表達(dá)的患者擁有較低的生存率。因此,我們推測hsa_circ_0025842的低表達(dá)可能與胃癌病人的不良預(yù)后相關(guān)。又如:在hsa_circ_0005822-hsa-miR-944-SLC24A2調(diào)控軸中,hsa_circ_0005822上調(diào)、hsamiR-944下調(diào)、SLC24A2上調(diào)(圖4)。這說明hsa_circ_0005822的上調(diào)可促進(jìn)SLC24A2的表達(dá),而本文的生存分析結(jié)果顯示SLC24A2高表達(dá)的胃癌患者擁有較低生存率(圖6),提示hsa_circ_000-5822的高表達(dá)與胃癌患者不良預(yù)后相關(guān)。另外,在hsa_circ_0008468-hsa-miR-940-PDE2A調(diào)控軸中,hsa_circ_0008468下調(diào)、hsa-miR-940上調(diào)、PDE2A下調(diào)(圖4),提示hsa_circ_0008468的下調(diào)抑制了PDE2A的表達(dá)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)PDE2A的低表達(dá)會抑制腫瘤細(xì)胞的生長與侵襲[40],同時本研究的生存分析表明PDE2A低表達(dá)的胃癌患者擁有更佳的預(yù)后。因此,我們推測hsa_circ_0008468的低表達(dá)可改善胃癌患者的預(yù)后。綜上所述,在ceRNA網(wǎng)絡(luò)中,3個核心的circRNA可能通過競爭性地結(jié)合miRNA實現(xiàn)對預(yù)后基因的調(diào)控,從而影響胃癌患者的預(yù)后。

總的來講,本研究通過生物信息學(xué)的方法挖掘了原始ceRNA網(wǎng)絡(luò)中核心的circRNA,并提取了核心circRNA介導(dǎo)的ceRNA子網(wǎng),為circRNA的ceRNA機(jī)制研究提供了參考方向,同時也為胃癌的診斷、治療提供了新的分子靶點。研究過程采用的方法具有普適性和創(chuàng)新性,為后續(xù)深入的實驗性研究提供了基礎(chǔ)。