東方百合轉(zhuǎn)化探究

馮慧敏 張 偉 洪 波

（大興安嶺職業(yè)學(xué)院 黑龍江大興安嶺 165099）

百合花姿優(yōu)美，色彩豐富，位列四大鮮切花，深受人們的喜愛(ài)。百合花粉顏色較深，附著性強(qiáng)，一般使用前需要人工摘除，以防止污染花瓣和衣物等。如何解決花粉污染問(wèn)題一直是百合育種的研究熱點(diǎn)之一。文章應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，對(duì)東方百合進(jìn)行轉(zhuǎn)化改造，將外源基因ZM401 導(dǎo)入東方百合基因組，促使花藥特異性表達(dá)，花藥不能正常發(fā)育形成，也就不能形成花粉，從而解決花粉污染問(wèn)題，為培育百合無(wú)花粉新品種進(jìn)行探索研究。

1 實(shí)驗(yàn)材料

應(yīng)用東方百合的組培苗生長(zhǎng)的小鱗莖鱗片為植物實(shí)驗(yàn)材料。目標(biāo)基因借助根癌農(nóng)桿菌菌株LBA4404 進(jìn)行轉(zhuǎn)化，菌株含攜帶ZOM401 基因的質(zhì)粒pBI121，目標(biāo)片斷大小為702 個(gè)bp。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 建立東方百合鱗片外植體的高頻再生體系

取組培苗直徑約1.5 cm 小鱗莖的鱗片，切成四周都有傷口約0.5 cm2的小塊，注意切掉鱗片基部可能存在潛伏芽的部位，將處理好的外植體接種在含生長(zhǎng)素0.2 mg/L NAA的基礎(chǔ)培養(yǎng)基（單位符號(hào)為mg/L，以下無(wú)特殊說(shuō)明均省略），細(xì)胞分裂素BA 設(shè)5 個(gè)濃度梯度，依次為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5。每種濃度處理接種30 個(gè)外植體，30 d 繼代一次。45 d 后統(tǒng)計(jì)鱗片分化情況。

再生苗生長(zhǎng)至2～3 cm 高時(shí)轉(zhuǎn)入1/2MS 生根培養(yǎng)基，設(shè)2 個(gè)NAA 濃度梯度，分別為NAA0.2 和NAA0.5。生根培養(yǎng)45 d 統(tǒng)計(jì)生根結(jié)果。苗高5～6 cm、根長(zhǎng)3～5 cm 時(shí)進(jìn)行移栽馴化，最后栽植到蛭石∶草炭土=1∶1 的基質(zhì)中。

2.2 潮霉素選擇濃度試驗(yàn)

鱗片高頻再生培養(yǎng)基（MS + NAA 0.2 + BA 1.5）中添加潮霉素，濃度梯度為0、10、20、30、40、50，每種濃度接種鱗片40 個(gè)，培養(yǎng)一個(gè)月后統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

2.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化

2.3.1 培養(yǎng)基組成

通過(guò)再生實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，確定東方百合鱗片再生培養(yǎng)基為MS + NAA0.2 + BA1.5。選擇培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上添加Hy40 和Cb300。為了促進(jìn)鱗片芽的形態(tài)建成降低BA濃度，即發(fā)育培養(yǎng)基為MS + NAA0.2 + BA0.5 + Hy40 + Cb300。生根培養(yǎng)基為1/2MS + NAA0.5+ Hy40 + Cb300。

2.3.2 轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)步驟

把東方百合鱗片外植體接入分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)3 d 后放入OD600 =0.4～0.6 的菌液中侵染5 min，取出后用無(wú)菌濾紙吸干菌液，接種在預(yù)培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)2～4 d，溫度控制在26 左右。然后將鱗片外植體轉(zhuǎn)入選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)，30 d 繼代轉(zhuǎn)接一次，培養(yǎng)60 d 后轉(zhuǎn)入發(fā)育培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)抗性再生苗高約2 cm 時(shí)轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基。

3 結(jié)果與分析

3.1 東方百合鱗片外植體高頻再生體系的建立

3.1.1 不同濃度BA 對(duì)鱗片不定芽誘導(dǎo)的影響

鱗片接種7 d 左右顏色加深，體積膨大，10 d 后開(kāi)始出現(xiàn)淡黃色或白色芽點(diǎn)，14 d 后開(kāi)始分化不定芽。30 d 后除含BA2.0 的培養(yǎng)基外其他各BA 濃度培養(yǎng)基誘導(dǎo)的鱗片外植體都分化出芽，并形成小植株。培養(yǎng)45 d，含BA1.5 的培養(yǎng)基中再生芽長(zhǎng)1.2 cm 左右。不同BA 濃度梯度培養(yǎng)基中，再生芽增殖系數(shù)分別為2.25、2.41、3.08、2.25、1.58，所有鱗片外植體都可分化出芽，其中含BA1.5培養(yǎng)基中的外植體分化芽數(shù)最多，增殖系數(shù)最高，可作為鱗片外植體誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

3.1.2 不同濃度NAA 和MS 或1/2MS 組合對(duì)東方百合再生苗生根的影響

再生苗高2～3 cm 時(shí)轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，生根培養(yǎng)基為MS 和1/2MS 培養(yǎng)基中添加NAA（0.2 和0.5），培養(yǎng)8 d 左右再生苗開(kāi)始生根，根黃綠色，生長(zhǎng)健壯，并有大量白色根毛。

生根培養(yǎng)45 d 結(jié)果如下：1/2MS+NAA0.5 培養(yǎng)基中的幼苗葉叢基部多數(shù)形成小鱗莖，每株葉4～6 片，具長(zhǎng)柄，葉披針形，綠色。根黃綠色，根毛長(zhǎng)約2 mm，根徑約1.5 mm以上根長(zhǎng)3～4 cm，平均每株生根11.2 根。該培養(yǎng)基誘導(dǎo)根的質(zhì)量最高，根較長(zhǎng)且粗壯，而且平均每株生根數(shù)量11條以上，能夠保證正常的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，盆栽成活率和大田移栽成活率都是最高的。

表1 鱗片外植體不定芽誘導(dǎo)分化的情況

3.2 潮霉素對(duì)鱗片外植體再生的影響

將百合鱗片外植體接種到含潮霉素的再生培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d 后，鱗片褪綠變白，潮霉素濃度越高白化現(xiàn)象愈嚴(yán)重。接種Hy40 中的鱗片外植體87.5%褐化死亡，可選擇Hy40 為亞致死濃度。當(dāng)Hy 濃度達(dá)到50，所有外植體都死亡，為致死濃度。選擇鱗片潮霉素抗選擇壓為40 mg/L，能抑制或殺死非轉(zhuǎn)化細(xì)胞，又不抑制轉(zhuǎn)化細(xì)胞正常生長(zhǎng)。

3.3 鱗片遺傳轉(zhuǎn)化的結(jié)果

東方百合鱗片外植體侵染培養(yǎng)4 d 后轉(zhuǎn)接到選擇培養(yǎng)基中繼續(xù)誘導(dǎo)，生長(zhǎng)13 d 后多數(shù)外植體切口出現(xiàn)褐化的現(xiàn)象，培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，外植體褐化死亡越多，僅有少數(shù)的外植體膨脹變大。培養(yǎng)30 d 后有3～7 個(gè)的外植體（接種100個(gè)/重復(fù)）出現(xiàn)淡黃色芽點(diǎn)，大部分外植體死亡或失去再生能力。培養(yǎng)50 d 獲得2～4 抗性芽，培養(yǎng)60 d 抗性芽1 cm左右，轉(zhuǎn)入發(fā)育培養(yǎng)基。再培養(yǎng)至芽長(zhǎng)2 cm 左右，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基。18 d 后抗性芽生根，（對(duì)照10 d 開(kāi)始生根），培養(yǎng)45 d 根長(zhǎng)1～3 cm（對(duì)照2～5 cm），再生芽葉片伸長(zhǎng)，植株基部開(kāi)始形成小鱗莖。

東方百合鱗片外植體遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)共獲得23 個(gè)抗性芽，占侵染總數(shù)3 000 塊的0.76%。

3.4 轉(zhuǎn)基因植株的PCR 檢測(cè)

對(duì)東方百合轉(zhuǎn)化篩選出的23 株苗進(jìn)行PCR檢測(cè)，其中9 株顯示為陽(yáng)性，初步確認(rèn)ZM401 基因整合到東方百合基因組中。東方百合共侵染3000 塊鱗片外植體，獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因株系9 個(gè)，遺傳轉(zhuǎn)化率0.3%。

4 討論

百合鱗片培養(yǎng)可直接形成不定芽和愈傷組織，是良好的遺傳轉(zhuǎn)化材料[4]。用組培無(wú)菌苗作轉(zhuǎn)化受體材料，取材不受季節(jié)的限制，還能避免消毒劑的影響，較適合作為受體外植體材料。而且直接分化成苗，變異率小，分化率較高。鱗片外植體再生苗主要分布在鱗片的傷口處，鱗片的底部較多，上部稍少，兩側(cè)切口形成的最少，有可能是鱗片內(nèi)部的激素分布不均造成的。所以外植體材料應(yīng)盡可能選擇鱗片底部部位。而且再生芽多是從切口處誘導(dǎo)形成的，有利于農(nóng)桿菌侵染，可提高轉(zhuǎn)化率。[5～7]菌液侵染濃度對(duì)百合轉(zhuǎn)化效率影響較大，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中菌液稀釋20 倍以上時(shí)進(jìn)行侵染實(shí)驗(yàn)，侵染幾百個(gè)鱗片外植體，僅獲得1 個(gè)抗性芽，經(jīng)PCR 檢測(cè)還是假陽(yáng)性的。雖然侵染菌液濃度低，抗生素應(yīng)用量少，對(duì)外植體影響小，但是極難成功轉(zhuǎn)化，可見(jiàn)菌液濃度不能太低。