Cdc25C在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系*

董倩，葉旭，廖前進(jìn)，周鈺娟，楊锫，楊敬儒，楊松華，朱笑叢，曾娜，師穎瑞

[1.南華大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)系，湖南 衡陽(yáng) 421001；2.湖南省腫瘤醫(yī)院（中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院） 放射治療科，湖南 長(zhǎng)沙 410013]

我國(guó)是食管癌高發(fā)地區(qū)，其發(fā)病率居惡性腫瘤第6 位，病死率居第4 位[1]，對(duì)無法手術(shù)或拒絕手術(shù)的局部晚期食管癌患者，放療是重要的治療手段[2]。然而，因?yàn)椴糠帜[瘤對(duì)放射線抵抗導(dǎo)致局控率降低，放療后約40%～60%食管癌患者治療未控或者復(fù)發(fā)[3]。原發(fā)性及獲得性放療抵抗是影響腫瘤治療效果和患者生存預(yù)后的重要因素，因此，尋找可以預(yù)測(cè)食管鱗狀細(xì)胞癌（以下簡(jiǎn)稱食管鱗癌）放療敏感性的生物標(biāo)志物有重要意義。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)食管鱗癌組織中Cdc25C 的表達(dá)情況，并分析Cdc25C 表達(dá)在食管鱗癌預(yù)后判斷及臨床療效監(jiān)測(cè)中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2011月1月—2016年12月湖南省腫瘤醫(yī)院確診的食管鱗癌患者，最終納入50 例進(jìn)行回顧性研究（實(shí)驗(yàn)組）。其中，男性40 例，女性10 例；年齡32 ～70 歲（中位年齡61 歲）；頸段6 例，胸上段18 例，胸中下段26 例；高分化鱗癌9 例，中分化鱗癌19 例，低分化鱗癌22 例；臨床分期采用2009年美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)（AJCC）第7 版食管鱗癌的分期標(biāo)準(zhǔn)[4]，Ⅱ期18 例，Ⅲ期32 例；根據(jù)增強(qiáng)胸部CT 和其他檢查結(jié)果，診斷淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者35 例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者15 例。所有患者行根治性放射治療，放療方式為三維適形放療或調(diào)強(qiáng)放射治療，計(jì)劃腫瘤靶區(qū)（PGTV）為60 ～64 Gy/30-33 F。本研究同時(shí)選取20 例食管鱗癌旁正常組織作為對(duì)照組。

1.2 主要試劑和方法

兔單克隆抗體抗Cdc25C[E302]購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，免疫組織化學(xué)染色采用SP 法，兔/鼠通用型SP試劑盒購(gòu)自江蘇康為世紀(jì)生物科技有限公司，食管鱗癌組織及食管鱗癌旁正常組織均由湖南省腫瘤醫(yī)院病理科提供。免疫組織化學(xué)所有操作步驟均按試劑盒說明書進(jìn)行，一抗的工作濃度為1 ∶300。用PBS 代替一抗做空白對(duì)照。

1.3 免疫組織化學(xué)結(jié)果判定

表達(dá)結(jié)果按照染色強(qiáng)度和染色范圍綜合計(jì)分。染色強(qiáng)度分為4 級(jí)： 不顯色為0 分；淺黃色為1 分；棕黃色為2 分；棕褐色為3 分。染色范圍（高背景下的陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比）分為4 級(jí)： 無陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)為0 分；陽(yáng)性細(xì)胞1%～20%為1 分；＞20%～75%為2 分；＞75%為3 分。兩分級(jí)相乘，≤4 分定義為Cdc25C 低表達(dá)，＞4 分定義為Cdc25C 高表達(dá)。

1.4 評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

放療結(jié)束后1 ～3 個(gè)月復(fù)查食管鋇餐進(jìn)行近期療效評(píng)價(jià)。近期療效評(píng)價(jià)采用萬均教授食管癌放療后療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[5]。完全緩解（complete response, CR）即腫瘤病灶完全消失，食管邊緣光滑，鋇劑通過順利，管壁可稍顯強(qiáng)直，管腔無明顯狹窄或稍顯狹窄，黏膜基本恢復(fù)正?；蛟龊?；部分緩解（partial response,PR）即病變大部分消失，無明顯扭曲或成角畸影，無向腔外潰瘍，鋇劑通過尚順利，且邊緣欠光滑，有小的充盈缺損或/和小龕影，或邊緣雖光滑，但管腔有明顯狹窄；無緩解（no response, NR）即放療結(jié)束時(shí)，病變看不出明顯好轉(zhuǎn)，或充盈缺損及龕影或狹窄加重。

1.5 隨訪

所有隨訪信息均來自病例系統(tǒng)及電話隨訪，隨訪內(nèi)容包括食管鋇餐以及總生存期（overall survival,OS）。隨訪時(shí)間自治療結(jié)束后1 個(gè)月后開始計(jì)算，截止到2018年10月31日。OS 是指從疾病確診的日期到死亡日期或者隨訪截止日期的時(shí)間，本研究的隨訪終點(diǎn)為OS。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，比較采用χ2檢驗(yàn)；Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，比較用Log-rank χ2檢驗(yàn)；影響因素分析用多因素Cox 風(fēng)險(xiǎn)回歸模型，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Cdc25C 在食管鱗癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)情況

Cdc25C 陽(yáng)性染色主要定位在細(xì)胞核中，呈黃棕色或棕褐色顆粒，背景不著色。對(duì)照組Cdc25C 表達(dá)水平較低，呈現(xiàn)低表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組Cdc25C 表達(dá)水平上調(diào)。Cdc25C 在實(shí)驗(yàn)組中高表達(dá)58%（29/50），在對(duì)照組中低表達(dá)0%（0/20）。見圖1。

圖1 Cdc25C 在食管鱗癌及癌旁組織中的表達(dá)情況 （SP 法×400）

2.2 Cdc25C 表達(dá)水平與患者臨床特征的關(guān)系

Cdc25C 表達(dá)水平與食管鱗癌患者的性別、年齡、部位、T 分期及分化程度無關(guān)（P＞0.05），但與臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜0.05），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率越高、臨床分期越晚，其在食管鱗癌組織中的表達(dá)越強(qiáng)。見表1。

表1 食管鱗癌患者Cdc25C 表達(dá)陽(yáng)性率的比較

2.3 近期療效

Cdc25C 高表達(dá)組29 例，其中CR 7 例，PR 20 例，NR 2 例；Cdc25C 低表達(dá)組21 例，其中CR 14 例，PR 7 例，NR 0 例。將Cdc25C 表達(dá)水平和食管鱗癌患者近期療效采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行關(guān)聯(lián)性檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.557，P=0.008），Cdc25C 高表達(dá)組近期療效較差。

2.4 生存分析

實(shí)驗(yàn)組1、2 及3年總生存率為82%、56%和24%，中位生存時(shí)間是24.5 個(gè)月；Cdc25C 高低表達(dá)兩組1、2 及3年總生存率分別為72%、45%、10%和90%、67%、48%。Cdc25C 高表達(dá)組生存率低于低表達(dá)組（χ2=6.846，P=0.009）。見圖2。

圖2 Cdc25C 高表達(dá)組與低表達(dá)組的生存曲線

2.5 影響食管鱗癌患者預(yù)后的因素

對(duì)患者性別、年齡、腫瘤部位、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移、臨床分期、分化程度、Cdc25C 表達(dá)水平進(jìn)行單因素分析，結(jié)果顯示Cdc25C 高表達(dá)、臨床分期與食管鱗癌不良預(yù)后相關(guān)（P＜0.05）。將單因素分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素納入多因素Cox 風(fēng)險(xiǎn)回歸模型，結(jié)果表明Cdc25C 在食管鱗癌組織中表達(dá)水平是食管鱗癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素[=0.399（95% CI： 0.176，0.906），P=0.028]。見表2、3。

表2 食管鱗癌患者單因素預(yù)后分析

表3 食管鱗癌患者多因素預(yù)后分析參數(shù)

3 討論

食管癌發(fā)病率高，預(yù)后差，嚴(yán)重威脅人類的生命安全。早期食管癌首選手術(shù)切除已成為共識(shí)，并且療效確切，但對(duì)局部晚期食管癌單純手術(shù)切除5年生存率仍較低，而大多數(shù)患者就診時(shí)已處中晚期[6-7]，同步放化療是非手術(shù)局部晚期食管癌標(biāo)準(zhǔn)治療模式[8]。在我國(guó)，鱗癌是食管癌的主要病理類型，約占90%，鱗癌對(duì)放療中度敏感，單純放療時(shí)5年生存率僅10%～15%[9-10]。然而，食管鱗癌細(xì)胞存在放射敏感性差異，增加放射治療的劑量并不一定能改善5年生存率或無病生存[11]，因此，放療之前或者放療期間準(zhǔn)確預(yù)測(cè)食管癌的放療敏感性，采取合理的個(gè)體化治療方案，尋找可以預(yù)測(cè)食管癌放療療效的生物標(biāo)志物顯得尤為重要。

近年來，與食管癌放療敏感性有關(guān)的分子標(biāo)志物陸續(xù)報(bào)道，目前報(bào)道較多的有抑癌基因P53、細(xì)胞周期調(diào)控子（Cdc25C、Cyclin D1）、DNA 損傷修復(fù)相關(guān)因子、凋亡相關(guān)因子（HDAC1、端粒酶）等[12]，其中Cdc25C 是細(xì)胞分裂磷酸化酶25 家族中的一員，參與真核細(xì)胞有絲分裂周期的調(diào)控，在正常的細(xì)胞周期中具有重要作用，若其表達(dá)異常，將會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期紊亂、失常，從而發(fā)生腫瘤[13]。已有眾多研究顯示，Cdc25C 是一種腫瘤相關(guān)抗原[14]，在對(duì)肝癌、結(jié)腸癌、胃癌、前列腺癌等研究中發(fā)現(xiàn)Cdc25C 的表達(dá)較正常組織升高，提示Cdc25C 在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用[15]。

目前，關(guān)于Cdc25C 影響食管癌細(xì)胞放療敏感性機(jī)制可能有多種，但具體機(jī)制仍不清楚。放療主要是電離輻射通過直接作用或間接作用導(dǎo)致細(xì)胞DNA 的損傷，從而引起細(xì)胞死亡[16]。放療效果不佳主要有兩方面的原因： ①細(xì)胞本身原因或其腫瘤細(xì)胞微環(huán)境保護(hù)從而導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)射線不敏感；②電離輻射后DNA損傷修復(fù)；后者是主要因素[17]。在細(xì)胞修復(fù)的過程中，細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)蛋白表達(dá)水平的差異在DNA 損傷修復(fù)方面具有舉足輕重的作用[18]，腫瘤細(xì)胞的高DNA損傷修復(fù)能力將導(dǎo)致對(duì)放射線的抵抗。有文獻(xiàn)報(bào)道，腫瘤細(xì)胞受到輻射損傷后產(chǎn)生的DNA 雙鏈斷裂主要通過激活A(yù)TM-Chk2-Cdc25C 通路修復(fù)，此通路可引起G2/M 期停滯，使腫瘤細(xì)胞有足夠的時(shí)間修復(fù)損傷的DNA[19]。在正常細(xì)胞周期中，Cdc25C 對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控是通過活化Cyclin B/-Cdc2 復(fù)合物使細(xì)胞由G2 期進(jìn)入到M 期來調(diào)控的[11-12]。在分裂間期Cdc2 上的Tyr15和Thr14 存在抑制性磷酸化，該磷酸化狀態(tài)使Cyclin B/-Cdc2 復(fù)合物失活，使細(xì)胞無法分裂，而Cdc25C 則可使Tyr15 和Thr14 去磷酸化后活化，進(jìn)而使細(xì)胞分裂[20]。Cdc25C 作為ATM-Chk2-Cdc25C 信號(hào)通路的下游底物，是G2/M 期檢查點(diǎn)的重要效應(yīng)因子[21]。在細(xì)胞受到輻射損傷后，檢查點(diǎn)感受器ATM 感知DNA 損傷并活化，繼而磷酸化其下游底物Chk2，被磷酸化后的Chk2 使Cdc25C 上絲氨酸第216 位殘基發(fā)生抑制性磷酸化[22-23]，從而失去使Cdc2 去磷酸化后活化的能力，分裂進(jìn)程因此被抑制，受損的細(xì)胞被阻滯在G2 期而獲得足夠的時(shí)間進(jìn)行修復(fù)，從而增加腫瘤細(xì)胞對(duì)放射線的抵抗性[24]。

在前期研究中，構(gòu)建食管癌放療抵抗細(xì)胞（TE13-R），并發(fā)現(xiàn)Cdc25C 蛋白在TE13-R 細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，當(dāng)利用Cdc25C干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染TE13-R細(xì)胞后，可抑制Cdc25C 蛋白的表達(dá)，同時(shí)癌細(xì)胞放射抵抗消失。其結(jié)果提示Cdc25C 的表達(dá)與食管癌的放療抵抗密切相關(guān)，Cdc25C 的高表達(dá)可能增強(qiáng)食管癌對(duì)放射線的抗拒，Cdc25C 可能是食管癌放療敏感性相關(guān)基因。因此，為進(jìn)一步明確Cdc25C 與食管癌放療抵抗的關(guān)系，本文收集臨床病例資料，采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Cdc25C 在食管鱗癌組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示Cdc25C 在食管鱗癌中高表達(dá)且與患者預(yù)后不良有關(guān)。

綜上所述，Cdc25C 表達(dá)水平可能與食管鱗狀細(xì)胞癌放療抵抗相關(guān)，Cdc25C 有望作為食管鱗癌放射治療中的潛在判斷預(yù)后的分子標(biāo)志物，并可能具有預(yù)后判斷、監(jiān)測(cè)臨床療效的作用。但因本研究病例數(shù)較少，仍需開展大規(guī)模的臨床試驗(yàn)及相關(guān)的細(xì)胞分子實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)。