長鏈非編碼RNA HSALNT0000015對結直腸癌細胞生物學行為的影響

張正衛(wèi)，楊一君

（南京醫(yī)科大學附屬淮安第一醫(yī)院 1.病理科，2.婦產科，江蘇 淮安 223001）

結直腸癌是目前世界上常見的惡性腫瘤之一，每年約有120 萬新發(fā)病例，同時約有60 萬患者死于該病[1]。及時診斷和治療雖然降低了結直腸癌患者的病死率，但是患者的5年生存率仍然停留在60%～70%[2]，一大部分結直腸癌患者被確診時已經處于進展期，局部侵襲和遠處轉移是結直腸癌患者死亡的重要原因，因此預防和緩解結直腸癌的進展和轉移對改善患者的預后意義重大。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNAs, lncRNA）屬于長度＞200 個核苷酸的非編碼RNA，越來越多的研究報道lncRNAs 與細胞凋亡、增殖、遷移、侵襲等密切相關，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用也愈發(fā)受到關注[3-5]，LncRNA 在多種類型腫瘤中異常表達，通過多種途徑影響腫瘤進展和轉移[6-8]。lncRNA HSALNT0000015 是一個編碼289 個核苷酸的lncRNA，本研究通過檢測lncRNA HSALNT0000015 在結直腸癌組織和人結直腸癌細胞中的表達，分析其對結直腸癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響，探討lncRNA HSALNT0000015 與結直腸癌進展、轉移及預后的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

DMEM 培養(yǎng)基和胎牛血清（FBS）購自美國Gibco公司，人結直腸癌細胞Lovo、SW480、HT-29、HCT 116 和正常人腸黏膜上皮細胞HIEC 購自上海中國科學院細胞庫，敲減lncRNA HSALNT0000015 的質粒和空載質粒購自上海吉凱生物有限公司，Lipofectamine 2000脂質體、MTT 試劑盒和實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time PCR, qRT-PCR）試劑盒和引物購自上海生工生物工程股份有限公司，Transwell 小室和Matrige 基質購自美國Corning 公司，抗轉錄因子Slug、上皮鈣黏素（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）及GAPDH 抗體購自美國CST 公司，生存期結腸癌cDNAHColA095Su02 芯片購自上海芯超生物有限公司，手術標本取自南京醫(yī)科大學附屬淮安第一醫(yī)院結直腸癌患者，包括癌組織80 例，癌旁組織15 例。手術時間2006年2月—2010年2月，隨訪時間截至2015年9月。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和轉染人結直腸癌細胞Lovo、SW480、HT-29、HCT116 和正常人腸黏膜上皮細胞HIEC 培養(yǎng)于含5% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基，置于5%二氧化碳、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，由于結直腸癌細胞系HCT116 中l(wèi)ncRNA HSALNT0000015 表達最高，選取對數生長期的HCT116 細胞進行轉染，參照轉染說明書進行操作，將HCT116 細胞以2×105個/孔接種于6 孔板，當融合度達50%～60%時，分別將空白對照、陰性對照質粒、siRNA 轉染HCT116 細胞設為空白組、對照組及實驗組，繼續(xù)培養(yǎng)12 h 后更換培養(yǎng)基。

1.2.2 qRT-PCR 檢測lncRNA HSALNT0000015 水平使用Trizol 試劑提取細胞RNA，將RNA 逆轉錄為cDNA 后進行檢測，以GAPDH 為內參，檢測lncRNA HSALNT0000015 相對表達水平，lncRNA HSALNT00 00015 表達量取中位數，高于中位數定義為lncRNA HSALNT0000015 高表達，低于中位數定義為lncRNA HSALNT0000015 低表達。qRT-PCR反應體系為： cDNA 模板2 μl，正、反向引物各1 μl，10×混合試劑2 μl，雙蒸水15 μl，反應條件為94℃預變性3 min，94℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃ 延伸30 s，共30 個循環(huán)。見表1。

1.2.3 MTT 法檢測細胞增殖能力取轉染后狀態(tài)良好的空白組、對照組及實驗組HCT116 細胞，消化收集細胞后將密度調整為0.5×104個/ml，以3×103個/孔接種于96 孔板。使用MTT 試劑盒檢測細胞的增殖能力，每孔加入MTT 溶液10 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，酶標儀檢測490 nm 波長處的光密度（OD）值，檢測第0、12、24、36 及72 小時的細胞增殖能力。實驗重復5 次。

1.2.4 Transwell 遷移/侵襲實驗檢測細胞遷移/侵襲能力取轉染后狀態(tài)良好的空白組、對照組及實驗組HCT116 細胞，消化收集細胞，使用無血清培養(yǎng)基調整細胞密度為2×104個/ml，以0.4×103個/孔加入Transwell 小室，在下室中加入10% FBS 的500 μl 培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)12 h 后，使用甲醇固定，0.2%結晶紫染色，倒置顯微鏡下觀察，取4 個視野（100 倍）計數，實驗重復4 次。侵襲實驗： 在遷移實驗的基礎上在上室鋪Matrige 基質，其余操作同遷移實驗。

表1 qRT-PCR 引物及siRNA 寡核苷酸序列

1.2.5 免疫印跡法檢測細胞遷移相關蛋白表達水平取轉染后狀態(tài)良好的空白組、對照組及實驗組HCT116細胞，提取蛋白后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE），一抗孵育過夜，二抗孵育1 h 后顯影。GAPDH為內參，檢測E-cadherin、Slug 和Vimentin 蛋白。實驗重復4 次。

1.3 統(tǒng)計學方法

數據分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示。比較采用成組t檢驗、單因素方差分析或重復測量設計的方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數資料以例表示，比較用χ2檢驗；生存分析采用Kaplan-Meier 生存曲線，組間比較采用Log-rank χ2檢驗；多因素分析采用Cox 回歸模型，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 結直腸癌組織和癌旁組織中l(wèi)ncRNA HSALNT0000015 的表達及與臨床病理特征的關系

lncRNA HSALNT0000015 在結直腸癌組織中相對表達量（6.890±0.180）與癌旁組織（2.127±0.242）比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=11.062，P=0.000）；結直腸癌組織中l(wèi)ncRNA HSALNT0000015 高、低表達的淋巴結轉移和臨床分期比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），表達越高，腫瘤越趨于淋巴結轉移，臨床分期越高；而年齡、性別及T 分期比較，差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。見表2。

2.2 腫瘤組織中l(wèi)ncRNA HSALNT0000015 的表達與結直腸癌患者預后的關系

結直腸癌患者術后隨訪5 ～9年，死亡43 例，生存分析結果顯示，在Ⅰ、Ⅱ期（42 例）、Ⅲ、Ⅳ期（38 例）和Ⅰ～Ⅳ期（80 例）的結直腸癌患者中，lncRNA HSALNT0000015 高表達患者的總體生存率均低于lncRNA HSALNT0000015 低表達患者（χ2=60.241、14.820 和65.232，均P=0.000）。多因素Cox回歸分析結果表明，結直腸癌組織中l(wèi)ncRNA HSALNT 0000015 高表達是結直腸癌患者預后不良的危險因素[=16.289（95% CI： 6.950，38.179），P=0.000]。見圖1和表3、4。

2.3 空白組、對照組及實驗組細胞增殖能力比較

結直腸癌細胞Lovo、SW480、HT-29、HCT116中l(wèi)ncRNA HSALNT0000015 表達高于正常人腸黏膜上皮細胞HIEC（F=153.942，P=0.000），選擇HCT116細胞作為實驗細胞敲減lncRNA HSALNT0000015 的表達（見圖2A）。由于si-1 敲減效率最高（F=40.760，P=0.000），因此選擇si-1 作為實驗組細胞（見圖2B）。第0、12、24、48 和72 小時，空白組HCT116細胞的OD 值分別為（0.221±0.011）、（0.423±0.032）、（0.615±0.041）、（1.021±0.092）和（1.434±0.124），對照組HCT116 細胞的OD 值分別為（0.223±0.022）、（0.434±0.042）、（0.652±0.033）、（0.963±0.122）、（1.432±0.114），實驗組HCT116 細胞的OD 值分別為（0.201±0.032）、（0.184±0.022）、（0.291±0.062）、（0.383±0.032）、（0.501±0.042）。3 組不同時間點OD 值比較，采用重復測量設計的方差分析，結果： ①不同時間點OD 值有差異（F=589.198，P=0.001）；②組間OD 值比較有差異（F=790.000，P=0.001），實驗組低于空白組和對照組；③3 組OD 值變化趨勢有差異（F=168.913，P=0.000）。見圖2C。

表2 結直腸癌組織中l(wèi)ncRNA HSALNT0000015 表達與臨床病理特征的關系 例

圖1 lncRNA HSALNT0000015 不同表達水平結直腸癌患者的Kaplan-Meier 生存曲線

表3 結直腸癌患者預后因素的單因素分析參數

表4 結直腸癌患者預后因素的多因素分析參數

圖2 敲減HSALNT0000015 后抑制HCT116 細胞的增殖能力

2.4 空白組、對照組及實驗組細胞遷移和侵襲能力比較

遷移實驗中，HCT116 細胞穿膜細胞數，實驗組為（40.442±7.481）個/視野、空白組為（133.812±7.473）個/ 視野、對照組為（132.442±8.623）個/ 視野，3 組比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=737.991，P=0.000）。侵襲實驗中，HCT116 細胞穿膜細胞數，實驗組為（18.562±2.941）個/視野、空白組為（55.942±7.683）個/視野和對照組為（54.313±7.684）個/視野，3 組比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=191.223，P=0.000）。見圖3。

2.5 空白組、對照組及實驗組細胞轉移相關蛋白比較

3 組E-cadherin、Slug 和Vimentin 蛋白相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。實驗組HCT116 細胞E-cadherin 蛋白相對表達量高于空白組和對照組（P＜0.05），而Slug 和Vimentin 蛋白相對表達量低于空白組和對照組（P＜0.05）。見表5和圖4。

圖3 敲減HSALNT0000015 后抑制HCT116 細胞遷移和侵襲能力 （×100）

表5 3 組Slug、E-cadherin 和Vimentin 蛋白相對表達量的比較 （±s）

表5 3 組Slug、E-cadherin 和Vimentin 蛋白相對表達量的比較 （±s）

組別 Slug E-cadherin Vimentin空白組 0.693±0.035 0.550±0.030 0.997±0.180對照組 0.600±0.062 0.427±0.031 0.897±0.045實驗組 0.267±0.055 1.377±0.172 0.260±0.046 F 值 55.445 76.812 39.514 P 值 0.000 0.000 0.000

圖4 在HCT116 細胞中敲減lncRNA HSALNT0000015后對相關蛋白的影響

3 討論

lncRNA 可以作為miRNA 海綿結合并調控miRNA的功能，除此之外，lncRNA 也可以與蛋白質相互作用增強或削弱其功能[4]，lncRNA 在腫瘤早期診斷和治療方面的潛力越來越受到關注[9-11]，lncRNA 可能在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起到重要作用。許多l(xiāng)ncRNA 如LINC01354、CPS1-IT1、RP11 在結直腸癌組織中異常高表達或低表達，發(fā)揮促癌作用或抑癌作用[6，12-13]。HSALNT0000015 是一種新發(fā)現的尚不清楚功能的lncRNA。

本研究結果表明，lncRNA HSALNT0000015 在結直腸癌組織和結直腸癌細胞中的表達水平高于癌旁組織和正常人腸上皮細胞，且隨著TNM 分期越高相對表達更高；此外，lncRNA HSALNT0000015 在有淋巴結轉移結直腸癌組織中較無淋巴結轉移結直腸癌組織中相對表達更高。敲減結直腸癌HCT116 細胞中l(wèi)ncRNA HSALNT0000015 的表達水平后，細胞增殖、遷移和侵襲能力均被抑制，以上結果提示lncRNA HSALNT0000015 可能參與調控結直腸癌的進展和轉移。

上皮間質轉化過程將上皮細胞重新編程使其具有間充質表型，是增強腫瘤細胞侵襲和轉移的關鍵步驟[14]。已有許多研究報道lncRNA 通過上皮間質轉化過程促進結直腸癌遷移和侵襲[15-17]，上皮間質轉化過程由一系列轉錄因子介導，如Slug、Snail、Twist和Zed1/2 等，轉錄因子可以抑制E-cadherin 并誘導間充質標志物如N 型鈣黏蛋白、Vimentin 和纖連蛋白的表達[18-20]。本研究敲減結直腸癌細胞HCT116 細胞中l(wèi)ncRNA HSALNT0000015 的表達后，轉化因子Slug 和Vimentin 表達下調，E-cadherin 表達上升，表明lncRNA HSALNT0000015 可能是通過上皮間質轉化過程促進結直腸癌細胞的遷移和侵襲。

生存分析發(fā)現，lncRNA HSALNT0000015 與結直腸癌患者的不良預后呈正相關，Cox 回歸分析結果顯示，腫瘤組織中l(wèi)ncRNA HSALNT0000015 的異常高表達是結直腸癌患者總體生存時間的危險因素，以上結果表明lncRNA HSALNT0000015 可以作為判斷結直腸癌患者的不良預后標志物。

綜上所述，HSALNT0000015 在結直腸癌組織和細胞中異常高表達，且其高表達可能與腫瘤增殖、淋巴結轉移、TNM 分期相關，敲減lncRNA HSALNT0000015 的表達可以抑制結直腸癌細胞系HCT116 的增殖、遷移和侵襲能力，其作用機制可能為lncRNA HSALNT0000015 通過上皮間質轉化過程促進結直腸癌細胞的遷移和侵襲，lncRNA HSALNT0000015 可能會為結直腸癌患者預后判斷和治療提供新的方向。