重金屬鉛、鎘及其互作脅迫下油菜種子萌發(fā)差異分析及篩選

肖 雪，張秀俠，陳玉琳，章潔瓊，張 超，常莉麗

(1.貴州師范大學(xué)，貴陽 550025；2.貴州省農(nóng)作物技術(shù)推廣總站，貴陽 550001)

貴州省礦產(chǎn)資源豐富，土壤中蘊(yùn)含著較高濃度的Pb、Cd、Hg、As等離子，全省土壤環(huán)境污染嚴(yán)重。其中Pb為灰白色質(zhì)軟金屬，對人體神經(jīng)系統(tǒng)、血液血管都有毒害作用；Cd為人體非必須元素，對人體有極大危害。研究發(fā)現(xiàn)，曾在日本發(fā)生的“痛痛病”與患者體內(nèi)的Cd含量有關(guān)。重金屬離子不僅對人體有嚴(yán)重?fù)p害，也不利于植物的生長發(fā)育，當(dāng)其濃度超過一定值時，對植物生長有著極大的影響[1]。植物體內(nèi)的重金屬含量超過一定閾值后，將會抑制植物細(xì)胞的光合作用和酶活性、并促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的ATP分解，改變細(xì)胞膜的通透性，甚至可干擾植物體內(nèi)已存在的細(xì)胞間及整株水平上的水分及離子穩(wěn)態(tài)平衡，甚至造成植物DNA損傷，最終導(dǎo)致植物生長量、產(chǎn)量及品質(zhì)的下降[2-5]。高濃度的Cu2+、Na2CO3處理油菜種子，其萌發(fā)及根的生長均受到不同程度的抑制[6-7]。Gurpreet等[8]用250 μmol/L的Pb2+溶液處理小麥根尖細(xì)胞時發(fā)現(xiàn)，小麥根尖細(xì)胞核內(nèi)的核仁變小，并且細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)了腫塊狀的結(jié)構(gòu)，當(dāng)Pb的量上升為500 μmol/L后細(xì)胞核解體。Hu等[9]用Pb2+溶液處理菹草，發(fā)現(xiàn)其葉片細(xì)胞核中的核仁分散，染色質(zhì)凝集，核膜遭到了嚴(yán)重的破壞。

油菜(BrassicanapusL.)是世界上三大油料作物之一，原產(chǎn)于中國，屬十字花科蕓薹屬一年生草本長日照作物，作為重要的種植蔬菜和食用植物油供給作物，其產(chǎn)量和種植面積都居世界首位，在農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)上也發(fā)揮著重要作用[10-12]。油菜生長發(fā)育過程中，水分需求量為60%～85%；自身具有強(qiáng)抗寒力，但是抗旱性較差；對土壤要求不及其他作物嚴(yán)格，沙土、粘土、紅黃土壤均能正常生長[13]。劉銀鳳研究表明，干旱脅迫對油菜種子萌發(fā)及生長的抑制作用極其明顯，直接導(dǎo)致種子不萌發(fā)或植株矮小[14]。油菜種子的萌發(fā)受諸多因素的影響，為適應(yīng)目前土壤環(huán)境而正常生長發(fā)育，篩選能夠抗逆境生長的油菜品系尤為重要。

本研究以124份油菜種質(zhì)為材料，在重金屬脅迫下，篩選對鉛、鎘具有耐性的油菜種質(zhì)，旨在為油菜育種提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料來源于貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，共計124份油菜種質(zhì)。

1.2 試驗方法

1.2.1試驗設(shè)計

試驗采用無水氯化鉛和氯化鎘配置鉛、鎘離子溶液，濃度設(shè)置為Pb：90 mg/L，Cd：40 mg/L，F(xiàn)(Pb 90+Cd 40)mg/L。4種不同離子配比處理(含ck超純水)，每重復(fù)50粒種子，每處理重復(fù)2次。

1.2.2種子萌發(fā)試驗

挑選大小一致、健康飽滿的油菜種子，用濃度為1%的次氯酸鈉消毒，蒸餾水清洗3～4次后置于鋪有2層濾紙的培養(yǎng)皿(直徑為9 cm)中，每皿50粒；將處理后的種子置于人工培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(溫度：25 ℃，光照：16 h、黑暗：8 h)；24 h后記錄種子的萌發(fā)數(shù)(以胚根突破種皮為標(biāo)準(zhǔn)，記錄露白粒數(shù))；每天觀察情況，直到種子萌發(fā)完全(每天補(bǔ)充適量蒸餾水至第1天刻度線)。

1.2.3種子萌發(fā)參數(shù)的統(tǒng)計

依據(jù)油菜種子萌發(fā)特點，借助種子萌發(fā)特性分析軟件包GERMINATOR[15]中的方法，推算出6個與種子萌發(fā)相關(guān)指標(biāo)發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、T 50、U 7525和AUC，來衡量種子發(fā)芽特性。其中：

發(fā)芽勢(%)=(2 d內(nèi)正常發(fā)芽的種子數(shù)/每皿總種子數(shù))×100%；

發(fā)芽率(%)=(4 d內(nèi)正常發(fā)芽的種子數(shù)/每皿總種子數(shù))×100%；

發(fā)芽指數(shù)=∑(Gt/Dt)，Dt是發(fā)芽日數(shù)，Gt為第t天的發(fā)芽種子數(shù)；

AUC(發(fā)芽曲線下面積)：將1～4 d的值連接起來，看覆蓋的面積，作為生活力指標(biāo)；

T 50：發(fā)芽率達(dá)到50%所需要的時間；

U 7525：發(fā)芽率從25%～75%所用的時間。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗采用Microsoft Excel 2016軟件和SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析。運用R 3.6.3統(tǒng)計軟件(https://www.R-project.org/)基于離差平方和法(Ward)的聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鉛、鎘及其復(fù)合脅迫對油菜萌發(fā)的影響

單一和復(fù)合脅迫下，發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和AUC均表現(xiàn)為降低趨勢(表1)，說明鉛、鎘脅迫對油菜的萌發(fā)起抑制作用，但抑制程度存在一定差異。在Cd 40 mg/L離子脅迫下，發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、T 50、U 7525、AUC分別降低0.55%、0.73%、1.21%、2.16 h、3.91 h、1.76%，在Pb 90 mg/L離子脅迫下，發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、T 50、U 7525、AUC分別降低1.58%、0.93%、1.32%、2.60 h、3.89 h、2.05%，綜合說明，Pb 90 mg/L對油菜萌發(fā)的抑制作用強(qiáng)于Cd 40 mg/L。復(fù)合脅迫時，相比單一脅迫萌發(fā)性狀參數(shù)的變化趨勢不盡相同，相比Cd 40 mg/L脅迫，發(fā)芽勢、AUC、發(fā)芽率呈下降趨勢，發(fā)芽指數(shù)呈升高趨勢，T 50數(shù)值減小，說明所用萌發(fā)時間縮短，U 7525數(shù)值增大，所用萌發(fā)時間增長；相比Pb 90 mg/L單一脅迫，發(fā)芽率呈下降趨勢，發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、AUC呈升高趨勢，而T 50所用時間均減少，U 7525所用時間均增加。綜上所述，說明單一和復(fù)合脅迫都能加快油菜種子的萌發(fā)速率，但是并不能促進(jìn)種子發(fā)芽，反而起著抑制作用，總體上，降低了種子活力。

表1 鉛、鎘及其復(fù)合脅迫下油菜萌發(fā)參數(shù)及影響

表2 無脅迫(ck)油菜萌發(fā)參數(shù)相關(guān)性分析

表3 Cd 40離子脅迫下油菜種子萌發(fā)參數(shù)相關(guān)性分析

表4 Pb 90離子脅迫下油菜種子萌發(fā)參數(shù)相關(guān)性分析

2.2 油菜種子萌發(fā)參數(shù)相關(guān)性分析

由表2～表5可知，脅迫處理前后，6個萌發(fā)參數(shù)之間均呈極顯著或顯著相關(guān)，其中發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)與T 50呈極顯著負(fù)相關(guān)，與U 7525呈顯著負(fù)相關(guān)，與AUC呈極顯著正相關(guān)。T 50與U 7525呈顯著正相關(guān)，與AUC呈極顯著負(fù)相關(guān)，而AUC與U 7525呈顯著負(fù)相關(guān)。但在不同脅迫條件下，相關(guān)系數(shù)之間存在差異。

表5 復(fù)合脅迫下油菜種子萌發(fā)參數(shù)相關(guān)性分析

2.3 油菜鉛、鎘耐性種質(zhì)的初步篩選

綜合萌發(fā)參數(shù)對124份油菜種質(zhì)進(jìn)行聚類分析，并針對不同類群進(jìn)行萌發(fā)參數(shù)方差分析(表6)。

表6 不同離子處理下油菜種質(zhì)聚類分析和萌發(fā)參數(shù)方差分析

ck處理下，油菜種質(zhì)劃分為三大類群，類群之間發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、T 50、U 7525和AUC存在明顯差異(圖1)。Cd 40 mg/L離子脅迫時，油菜種質(zhì)劃分為三大類群，類群之間發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、T 50、U 7525和AUC存在差異。其中Cd-Ⅰ群種質(zhì)對高濃度鎘離子響應(yīng)靈敏，相應(yīng)的萌發(fā)參數(shù)相比ck均有提升(圖2)。Pb 90 mg/L離子脅迫時，油菜種質(zhì)劃分為三大類群，類群之間發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、T 50、U 7525和AUC存在差異。其中Pb-Ⅱ群種質(zhì)對高濃度鉛離子響應(yīng)較靈敏，相應(yīng)的萌發(fā)參數(shù)相比ck均有顯著提升(圖3)。F脅迫時，油菜種質(zhì)劃分為三大類群，類群之間發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、T 50、U 7525和AUC存在差異。其中F-Ⅰ群種質(zhì)萌發(fā)參數(shù)與ck趨于相同，差異較小(圖4)。綜上所述，說明在不同重金屬離子的一定濃度脅迫下，油菜種子對不同重金屬離子響應(yīng)靈敏不一，但總體萌發(fā)參數(shù)表現(xiàn)良好。

3 討 論

油菜作為貴州省傳統(tǒng)油料大作物,在貴州各地均有種植。宋春然等對貴州全省采集1 014個土壤樣品檢測分析數(shù)據(jù)表明[16]，貴州省重金屬污染最為嚴(yán)重的是Cd離子污染，其次是Hg離子、Pb離子污染。唐啟琳等[17]研究發(fā)現(xiàn)，貴州喀斯特區(qū)耕地土壤Cd樣點超標(biāo)率分別為90%和22%,非喀斯特區(qū)耕地土壤Cd樣點超標(biāo)率分別為30%和12%，土壤環(huán)境遭到嚴(yán)重污染，影響了油菜的產(chǎn)量。

3.1 Cd、Pb離子對油菜種子萌發(fā)的影響

本研究表明，在Cd、Pb離子單一脅迫及復(fù)合脅迫都會使得油菜種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和AUC降低。對重金屬逆境響應(yīng)敏感度不是很高，一般表現(xiàn)為低濃度促進(jìn)其萌發(fā)，反之高濃度則抑制，而隨濃度的不斷升高，抑制作用逐漸上升。魯先文和丁時和[18]研究發(fā)現(xiàn)，Cd2+單一處理濃度≤5 mg/kg、Pb2+單一處理濃度≤10 mg/kg時，對油菜種子萌發(fā)的發(fā)芽率、發(fā)芽勢均為促進(jìn)作用，高濃度抑制，而當(dāng)Cd、Pb離子復(fù)合處理時，抑制作用更強(qiáng)。紀(jì)永[19]研究表明，0.25 mmol/L是Pb2+影響香蒲種子萌發(fā)的敏感濃度，3 mmol/L則是Pb2+影響香蒲種子萌發(fā)的最大致死濃度。孫杰等研究發(fā)現(xiàn)，Pb離子對油菜種子萌發(fā)影響不大，但對油菜苗的生長發(fā)育起著強(qiáng)抑制作用[20]。

3.2 基于萌發(fā)參數(shù)對油菜鉛、鎘耐性種子選育

為降低油菜種子萌發(fā)遺傳差異，篩選適合貴州高濃度Cd、Pb離子生長的油菜種質(zhì)?；?個萌發(fā)參數(shù)，將124份油菜種子聚類分析，群體間方差分析揭示：ck脅迫時，油菜ck-Ⅰ群體115份具有較高的發(fā)芽指數(shù)，T 50和U 7525數(shù)值較小，表明該群體種質(zhì)高發(fā)芽率和較一致的發(fā)芽整齊度；Cd 40 mg/L離子脅迫時，油菜Cd-Ⅰ群體94份具有較高的發(fā)芽指數(shù)和較一致的發(fā)芽整齊度；Pb 90 mg/L離子脅迫時，油菜Pb-Ⅱ群體67份具有較高的發(fā)芽指數(shù)和較一致的發(fā)芽整齊度；F處理時，油菜F-Ⅰ群體111份具有較高的發(fā)芽指數(shù)和較一致的發(fā)芽整齊度。由此可篩選油菜ck-Ⅰ、Cd-Ⅰ、Pb-Ⅱ和F-Ⅰ群體為本次研究的推薦群體。