基于AMPK/Foxo3a軸研究健脾化濕、清熱通絡(luò)法改善佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠氧化應(yīng)激狀態(tài)的機(jī)制

周巧 劉健 朱艷 潘喻珍 楊佳 周婧 吳云 王振亞 尹志勇

【摘 要】目的：探討佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠氧化應(yīng)激與AMPK/Foxo3a軸的關(guān)系及健脾化濕、清熱通絡(luò)法對其影響。方法：將70只大鼠隨機(jī)分為空白對照組，模型對照組，黃芩清熱除痹膠囊（HQC）低、中、高劑量組，來氟米特組，黃芪甲苷組，每組10只。除空白對照組外，其余各組采用足跖皮內(nèi)注射完全佐劑致炎制成佐劑性關(guān)節(jié)炎模型。致炎后第19天始用藥，連續(xù)給藥30 d，每日1次。空白對照組與模型對照組以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的氯化鈉溶液灌胃，HQC各劑量組、來氟米特組、黃芪甲苷組分別給予相應(yīng)劑量的藥物。觀察各組大鼠足跖腫脹度、關(guān)節(jié)炎指數(shù);酶聯(lián)免疫吸附法檢測白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-4、過氧化脂質(zhì)（LPO）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、總抗氧化能力（TAOC）的表達(dá);Western blot檢測各組AMPKα1、p-AMPKα1、FoxO3a、p-FoxO3a、MnSOD蛋白的表達(dá)。結(jié)果：與其他各組比較，HQC中劑量組體質(zhì)量較高，關(guān)節(jié)炎指數(shù)降低明顯（P < 0.05）; IL-4水平升高明顯，IL-1β下降明顯，且顯著優(yōu)于黃芪甲苷組（P < 0.05）。來氟米特組SOD、TAOC水平明顯低于HQC中劑量組，來氟米特組、黃芪甲苷組MDA、LPO水平高于HQC中劑量組（P < 0.05）。HQC中劑量組AMPKα1、p-AMPKα1、FoxO3a、p-FoxO3a、MnSOD蛋白表達(dá)水平較黃芪甲苷組、來氟米特組明顯升高（P < 0.01或P < 0.05）。結(jié)論：健脾化濕、清熱通絡(luò)法可以通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激介導(dǎo)的AMPK/Foxo3a通路，提高抗氧化能力，進(jìn)而恢復(fù)機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)。

【關(guān)鍵詞】 佐劑性關(guān)節(jié)炎;健脾化濕、清熱通絡(luò)法;氧化應(yīng)激;AMPK/Foxo3a軸;大鼠

Study on the Mechanism of Jianpi Huashi，Qingre Tongluo Method in Improving Oxidative Stress State of Adjuvant Arthritis Rats Based on AMPK / FOXO3a Axis

ZHOU Qiao，LIU Jian，ZHU Yan，PAN Yu-zhen，YANG Jia，ZHOU Jing，WU Yun，WANG Zhen-ya，YIN Zhi-yong

【ABSTRACT】Objective：To investigate the relationship between oxidative stress and AMPK/FOXO3a axis in rats with adjuvant arthritis and the effect of Jianpi Huashi Qingre Tongluo method（a method of invigorating spleen，resolving dampness，clearing heat and dredging collaterals） on it.Methods：Seventy rats were randomly divided into a blank control group，a model control group，low，medium and high dose groups of Huangqin Qingre Chubi Jiaonang（黃芩清熱除痹膠囊，HQC），a leflunomide group，an astragaloside group，ten rats in each group.Except the blank control group，the other groups were made into adjuvant arthritis models by intradermal injection of complete adjuvant.On the 19th day after inflammation，the drug was administered continuously for 30 days，once a day.The blank control group and model control group were intragastrically administered with 0.9% sodium chloride solution.The corresponding doses of drugs were given to each dose group of HQC，the

leflunomide group and the astragaloside group.The swelling degree and arthritis index of each group were observed.The expressions

of IL-1β，IL-4，LPO，MDA，SOD and TAOC

were detected by enzyme linked immunosorbent assay.Western blot was used to detect the expressions of AMPKα1，p-AMPKα1，F(xiàn)oxO3a，p-FoxO3a and MnSOD.Results：Compared with other groups，the medium dose group of HQC had higher body weight and lower arthritis index（P < 0.05）;IL-4 level increased and IL-1β decreased significantly，which was significantly better than the astragaloside group（P < 0.05）.The levels of SOD and TAOC in the leflunomide group were significantly lower than those in the middle dose group of HQC，while MDA and LPO levels in the leflunomide group and the astragaloside group were higher than those in the middle dose group of HQC（P < 0.05）.The protein expression levels of AMPKα1，p-AMPKα1，F(xiàn)oxO3a，p-FoxO3a and MnSOD in the medium dose group of HQC were significantly higher than those in the astragaloside group and the leflunomide group（P < 0.01

or P < 0.05）.Conclusion：Jianpi Huashi Qingre Tongluo method can improve antioxidant capacity and restore immune homeostasis by regulating the AMPK/Foxo3a pathway mediated by oxidative stress.

【Keywords】 adjuvant arthritis;Jianpi Huashi，Qingre Tongluo method;oxidative stress;AMPK/Foxo3a axis;rats

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種臨床表現(xiàn)多樣化的系統(tǒng)性自身免疫性疾病[1]。自由基參與RA關(guān)節(jié)滑膜的炎性病變和骨質(zhì)的破壞。過量的氧自由基抑制軟骨細(xì)胞增殖，促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡[2]。AMPK/FoxO3a途徑是其中一條抗氧化通路[3]。本課題組在長期理論研究與臨床實(shí)踐基礎(chǔ)上提出了RA“從脾論治”觀點(diǎn)[4]。黃芩清熱除痹膠囊（HQC）由黃芩、梔子、威靈仙、薏苡仁、桃仁組成，具有清熱利濕、健脾益氣、祛風(fēng)通絡(luò)的功效。本研究通過觀察HQC干預(yù)后對佐劑性關(guān)節(jié)炎（AA）大鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）中氧化應(yīng)激指標(biāo)、細(xì)胞因子以及AMPK/FoxO3a通路表達(dá)水平的影響，探討HQC的作用及可能的機(jī)制，為健脾化濕、清熱通絡(luò)法治療RA提供實(shí)驗(yàn)

依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級健康雄性6周齡SD大鼠70只，體質(zhì)量（150±20）g。實(shí)驗(yàn)動物來源于安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號SCXK（皖）2019-001。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 藥品：HQC（每粒膠囊含生藥浸出物0.4 g，安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑中心生產(chǎn)，專利號ZL201110095718.X）;來氟米特（美羅藥業(yè)股份有限公司，生產(chǎn)批號1702011，規(guī)格

10 mg）;黃芪甲苷（每瓶20 mg，純度≥98%）。

試劑：弗氏完全佐劑（美國Sigma公司）;白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-4、過氧化脂質(zhì)（LPO）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、總抗氧化能力（TAOC）的ELISA檢測試劑盒及其配套試劑（美國R&D公司）;兔抗AMPKα1、兔抗p-AMPKα1、兔抗FoxO3a、兔抗p-FoxO3a、兔抗MnSOD（Abcam公司），HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠免疫球蛋白G（IgG）、山羊抗兔IgG、β-Actin（北京中杉公司）。足趾容積測量儀（成都泰盟軟件有限公司，PV-200型）;MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒（Beyotime公司）;淋巴細(xì)胞分離液（天津市灝洋生物科技公司）;體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清（FBS）DMEM完全培養(yǎng)基：50 mL的FBS加入450 mL DMEM培養(yǎng)基，再加入青鏈霉素5 mL，置4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 研究方法

1.3.1 動物模型復(fù)制及給藥 將70只大鼠隨機(jī)分為空白對照組，模型對照組，HQC低、中、高劑量組，來氟米特組，黃芪甲苷組，每組10只。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，除空白對照組外，向每只動物右足跖皮內(nèi)注射佐劑致炎，注射量為0.1 mL·（100 g）-1，制成佐劑性關(guān)節(jié)炎模型。造模前每只大鼠右后足趾容積，作為致炎前足趾基礎(chǔ)容積。模型成功判定標(biāo)準(zhǔn)：進(jìn)行關(guān)節(jié)炎指數(shù)（AI）評分，在首次注射弗氏完全佐劑后16 d，AI評分 > 4分，單側(cè)右足外踝以下隆起的體積 > 1.6 mL者為造模成功。

1.3.2 給藥及PBMC的分離 致炎后第19天開始給藥，劑量相當(dāng)于臨床用量的10倍?？瞻讓φ战M和模型對照組：給予生理鹽水灌胃1 mL·（100 g）-1，

每日1次。將HQC去除膠囊殼，加生理鹽水，配制成混懸液（每毫升含藥量0.04 g，即0.4 g·kg-1）。

按1 mL·（100 g）-1的比例，HQC低、中、高劑量組分別給予混懸液200，400，800 mg·kg-1·d-1灌胃。來氟米特組：每毫升含來氟米特1 mg，給藥劑量為10 mg·kg-1·d-1。黃芪甲苷組：每毫升含黃芪甲苷6 mg，給藥劑量為60 mg·kg-1·d-1。各組均連續(xù)給藥30 d。于末次服藥1 h后，上述各組大鼠予以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的水合氯醛麻醉，無菌操作下腹主動脈采血，用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）按1∶1稀釋全血，輕輕混勻;將稀釋好的樣本沿管壁緩慢加至含有5 mL淋巴細(xì)胞分離液的離心管（出現(xiàn)分層，勿混勻），放入水平離心儀中，以1500 r·min-1離心15 min，離心半徑13.5 cm;離心后管內(nèi)見分層后，滴管吸取白色霧狀單個(gè)核細(xì)胞，移至干凈離心管中;含單個(gè)核細(xì)胞的培養(yǎng)管中加入PBS混勻（1∶1），以800 r·min-1離心8 min，離心半徑13.5 cm，清洗2次;用體積分?jǐn)?shù)為10%的FBS DMEM完全培養(yǎng)基懸浮沉淀細(xì)胞，吸管吹打混勻，放入37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2孵箱中孵育備用。

1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞傳代培養(yǎng)：倒置顯微鏡下觀察各組PBMC，當(dāng)匯合成片（約90%、95%）時(shí)，便可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。棄舊培養(yǎng)液，用PBS沖洗細(xì)胞

3次，加入胰蛋白酶l mL，37 ℃靜置0.5～2 min，

倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞變圓、漂浮，輕輕搖晃細(xì)胞瓶壁兩側(cè)，使細(xì)胞全部消化，立即加入等量的對應(yīng)各組的培養(yǎng)基終止消化。倒入15 mL離心管中，1000 r·min-1離心5 min，離心半徑13.5 cm，重新加入新培養(yǎng)液，吹打細(xì)胞，形成細(xì)胞懸液，使其散開，可傳代分瓶培養(yǎng)或凍存?zhèn)溆?。?xì)胞計(jì)數(shù)：取細(xì)胞混懸液10 μL，移液槍打勻，2～3 min后在計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，并計(jì)數(shù)。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 大鼠足跖腫脹度、AI評分的測算 于造模

前1 d、致炎后給藥前1 d、第49天（即給藥后第30天）測量各組大鼠右后足跖容積，計(jì)算各組大鼠足跖腫脹度[5]。足跖腫脹度=（Vt-Vn）/Vn×100%（Vn、Vt分別代表致炎前后足跖容積）。AI評分計(jì)算：致炎后開始觀察并記錄全身關(guān)節(jié)病變程度。全身關(guān)節(jié)病變按5級評分法評價(jià)，根據(jù)未注射佐劑的其余3只肢體病變程度累積積分，計(jì)算AI評分[5]，各個(gè)關(guān)節(jié)的積分累計(jì)，即為每只大鼠的AI評分。

1.4.2 四甲基偶氮唑鹽（MTT）實(shí)驗(yàn) 設(shè)空白對照組（無細(xì)胞），陰性對照組（即體積分?jǐn)?shù)為10%的FBS，HQC低、中、高劑量組的培養(yǎng)基）。取對數(shù)生長期細(xì)胞以1×105 個(gè)·mL-1密度接種于96孔

培養(yǎng)板中，使每孔的終體積為100 μL，每組設(shè)

6個(gè)復(fù)孔，常規(guī)培養(yǎng)于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2氣體的培養(yǎng)箱中。孵育12，24，48 h后，每孔加入MTT（5 mg·mL-1）20 μL，37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄上清再加入DMSO 150 μL，酶標(biāo)儀49 nm波長測定各孔的吸光度（OD490），每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。按照下列公式計(jì)算細(xì)胞抑制率，細(xì)胞抑制率（%） = （Ac-As）/（Ac-Ab） × 100%。其中As為實(shí)驗(yàn)孔（含有細(xì)胞、DMSO、含藥血清），Ac為陰性對照孔（含有細(xì)胞、DMSO、胎牛血清），Ab為空白對照孔（不含細(xì)胞，含DMSO）。

1.4.3 ELISA檢測各組IL-1β、IL-4、SOD、TAOC、

MDA、LPO表達(dá) 取對數(shù)生長的細(xì)胞，按105個(gè)·mL-1

濃度接種于96孔板細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加100 μL細(xì)胞液。24 h后取上清液移入消毒的EP管中，標(biāo)記設(shè)孔?？瞻卓准?00 μL，設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔10孔，依次加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，每孔加液量100 μL。

待測樣品孔中加樣品稀釋液40 μL，再加待測樣品10 μL（樣品最終稀釋度為5倍）。再將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，酶標(biāo)板加上覆膜，37 ℃溫育30 min;棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，重復(fù)5次;每孔加入酶標(biāo)試劑50 μL，空白孔除外。重復(fù)上述溫育、洗滌步驟;每孔先加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50 μL，37 ℃避光顯色15 min;每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）;450 nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。

1.4.4 Western blot檢測各組AMPKα1、p-AMPKα1、

FoxO3a、p-FoxO3a、MnSOD蛋白的表達(dá) 取對數(shù)生長的細(xì)胞，按105個(gè)·mL-1濃度接種于6孔板細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加2 mL細(xì)胞懸液。加入細(xì)胞裂解液，BCA法測定總蛋白含量。按照1∶4加入5X SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，室溫封閉2 h后，按照合適的比例用一抗稀釋液進(jìn)行稀釋（MnSOD抗體屬性為兔抗1∶300稀釋，AMPKα1抗體屬性為兔抗1∶2000稀釋，p-AMPKα1抗體屬性為兔抗1∶1000稀釋，F(xiàn)oxO3a抗體屬性為兔抗1∶500稀釋，p-FoxO3a抗體屬性為兔抗1∶500稀釋，體積分?jǐn)?shù)為10%的分離膠）。二抗孵育參考二抗說明書，按照相應(yīng)比例1∶10 000（p-FoxO3a、FoxO3a）;1∶2000（p-AMPKα1、AMPKα1）;1∶5000（MnSOD）用二抗稀釋液稀釋辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗。使用ECL超敏發(fā)光試劑盒檢測蛋白。用Image J軟件分析條帶灰度值。以β-actin為內(nèi)參，以目的蛋白的相對表達(dá)量為參數(shù)進(jìn)行半定量統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，治療前后比較采用配對t檢驗(yàn);不符合

正態(tài)分布資料采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。以P < 0.05

為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同劑量HQC含藥血清在不同時(shí)間點(diǎn)對PBMC的影響 MTT結(jié)果表明，與空白對照組同期比較，HQC中、高劑量組OD值下降，且中劑量組OD值降低明顯（P < 0.01或P < 0.05）。各組濃度含藥血清對PBMC的抑制作用在培養(yǎng)24 h最強(qiáng)。故本實(shí)驗(yàn)取HQC中劑量含藥血清為最佳含藥血清，24 h為最佳作用時(shí)間。見表1。

2.2 各組大鼠體質(zhì)量、足趾腫脹度和AI評分比較 致炎后第19天起給藥。給藥前與空白對照組比較，模型對照組和各治療組大鼠足趾腫脹度和AI評分均升高（P < 0.01或P < 0.05），模型對照組與各治療組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。連續(xù)給藥30 d后，與空白對照組比較，模型對照組大鼠足趾腫脹度和AI評分升高（P < 0.01）;與模型對照組比較，各治療組大鼠足跖腫脹度和AI評分明顯降低（P < 0.01）;各治療組比較，HQC中劑量組體質(zhì)量較高，AI評分降低明顯（P < 0.05）;與HQC中劑量組比較，來氟米特組大鼠體質(zhì)量較低（P < 0.01），AI評分較高（P < 0.05），足趾腫脹度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）;黃芪甲苷組體質(zhì)量、腫脹度和AI評分高于其余各組（P < 0.01或P < 0.05）。見表2。

2.3 各組大鼠細(xì)胞因子IL-1β、IL-4水平比較 致炎后第49天，檢測各組AA大鼠血清細(xì)胞因子的變化，與空白對照組比較，模型對照組和各治療組IL-1β水平升高，IL-4水平下降（P < 0.01）。與模型對照組比較，各治療組IL-1β水平降低，IL-4水平升高（P < 0.01或P < 0.05）。HQC中劑量組IL-4水平升高明顯，IL-1β下降明顯，且顯著優(yōu)于黃芪甲苷組（P < 0.05）。見表3。

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收稿日期：2020-04-17;修回日期：2020-05-19