櫛孔扇貝LTR逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的基因組分布特征及時(shí)空表達(dá)模式分析*

劉盼盼，李語(yǔ)麗,2**，劉福云，于洪偉，包振民,3，王 師,2

(1.中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266003；2.海洋生物學(xué)與生物技術(shù)功能實(shí)驗(yàn)室，青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室，山東 青島266237；3.海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室，青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室，山東 青島266237)

轉(zhuǎn)座子又被稱為跳躍因子(Mobile genetic elements)，最早是由Mc Clintock在玉米中發(fā)現(xiàn)[1]的。近幾十年的研究表明，轉(zhuǎn)座子存在于所有真核生物的基因組中，并對(duì)基因組的進(jìn)化起著重要的作用[2]。根據(jù)轉(zhuǎn)座方式的不同，轉(zhuǎn)座子主要被分為兩大類，第一類是過“剪切-黏貼”的方式進(jìn)行移動(dòng)的DNA類型的轉(zhuǎn)座子，這種轉(zhuǎn)座的方式并不會(huì)影響基因組的大小；第二大類是通過“復(fù)制-黏貼”的方式，以RNA為中介插入基因組的其它位置，這類轉(zhuǎn)座子又被稱為逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，這種轉(zhuǎn)座方式會(huì)直接影響基因組的大小。逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子根據(jù)結(jié)構(gòu)的不同分為L(zhǎng)TR逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子和非常末端重復(fù)序列(non-LTR)逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。LTR逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子是真核生物基因組最為豐富的組成成分之一[3]。LTR逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子一般包括五個(gè)不同的亞家族——Ty1-copia、PAO、DIRS、Ty-3 Gypsy和ERV(vertebrate retrovirus)，它們廣泛分布于動(dòng)物和植物基因組中[4]。LTR逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)與逆轉(zhuǎn)錄病毒十分相似[5]，通常翻譯抗原蛋白(gag)和多聚蛋白(pol)的基因，包含在一個(gè)開放閱讀框或者兩個(gè)開放閱讀框中[6]，pol基因翻譯與轉(zhuǎn)座相關(guān)的酶，包括整合酶(INT)、逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)以及內(nèi)切酶(RNaseH)。DIRS、Ngaro與其它幾類逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的區(qū)別比較大，這兩類逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子屬于YR(酪氨酸重組酶)類型的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子[7]，YR(酪氨酸重組酶)代替了INT整合酶的功能。

動(dòng)物中LTR逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子超家族的分布情況是不一樣的，通過對(duì)昆蟲、線蟲、脊索動(dòng)物、真菌[3，8-9]基因組中的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Gypsy和Copia的研究發(fā)現(xiàn)，這兩類逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在分布、拷貝數(shù)量、多樣性上是顯著不同的。Gypsy在各類后生動(dòng)物物種都廣泛存在，占有重要的比例，尤其在無脊椎動(dòng)物中Gypsy是分布最為豐富的一類LTR；Copia在植物中報(bào)道的較多，而在動(dòng)物中分布較少[10]，研究發(fā)現(xiàn)近1/3的后生動(dòng)物不存在這類轉(zhuǎn)座子[11]；Copia和BEL在拷貝數(shù)量以及多樣性上都低于Gypsy[12]；Ngaro與DIRS都屬于YR類型的轉(zhuǎn)座子，研究發(fā)現(xiàn)DIRS和Ngaro逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在鳥類以及哺乳類中是缺失的，但普遍存在于昆蟲、魚類、海洋生物以及爬行類動(dòng)物中[13]。

逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座與擴(kuò)張是基因組擴(kuò)增的主要因素，作為逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子重要成分之一的LTR逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，除了能夠影響基因組的大小之外，還能夠通過拷貝之間的同源重組對(duì)基因組不穩(wěn)定性產(chǎn)生顯著的影響，也可能對(duì)基因組進(jìn)化產(chǎn)生長(zhǎng)期影響[14-15]。轉(zhuǎn)座子在基因組中并非是隨機(jī)分布的，它們與一些功能元件之間有密切的聯(lián)系[16-17]，轉(zhuǎn)座子不僅影響基因組的結(jié)構(gòu)，還在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要的作用，有些轉(zhuǎn)座子偏好插入基因或接近基因側(cè)翼區(qū)域，導(dǎo)致影響基因功能的突變。一些轉(zhuǎn)座子如果插入到基因的啟動(dòng)子區(qū)，該轉(zhuǎn)座子的調(diào)控元件會(huì)對(duì)基因的表達(dá)產(chǎn)生影響[18]。

軟體動(dòng)物門是僅次于節(jié)肢動(dòng)物門的第二大后生動(dòng)物門類，具有豐富的形態(tài)多樣性和廣泛的環(huán)境適應(yīng)性(海水、淡水、陸地等)，是研究轉(zhuǎn)座子的一類較好的生物模型。軟體動(dòng)物轉(zhuǎn)座子的研究已經(jīng)取得了一些進(jìn)展，比如對(duì)牡蠣(Craistostreavirginica)中的MITE Pearl[19]、濱螺(Littorinasaxatilis)中的Tc1 / mariner[20]、腹足動(dòng)物和雙殼類中新的SINE超家族[21-22]的鑒定和功能分析；在緬甸軟蛤(Myaarenaria)及在深海雙殼類中的細(xì)胞中檢測(cè)到活躍的Gypsy元件Steamer[23-24]。近期，Thomas 等則對(duì)九種軟體動(dòng)物的Gypsy、Copia、BEL逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子進(jìn)行了鑒定和比較分析，發(fā)現(xiàn)Gypsy亞家族占有明顯主導(dǎo)地位[25]。由于貝類基因組學(xué)研究起步較晚，相對(duì)于模式動(dòng)物來說，貝類的轉(zhuǎn)座子研究相對(duì)匱乏，此前軟體動(dòng)物中多是針對(duì)單個(gè)逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子或某個(gè)/些亞家族進(jìn)行研究，缺乏對(duì)轉(zhuǎn)座子起源進(jìn)化、功能機(jī)制的系統(tǒng)認(rèn)知。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)和表觀基因組學(xué)最近的研究表明，LTR提供了許多新的基因調(diào)節(jié)元件，包括組織特異性啟動(dòng)子和增強(qiáng)子[26]，革新了人們對(duì)LTR的傳統(tǒng)認(rèn)知。本文利用已發(fā)表的櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)基因組信息[26]，對(duì)櫛孔扇貝LTR逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子各個(gè)亞家族拷貝數(shù)量及長(zhǎng)度進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，對(duì)LTR在染色體上的分布特征進(jìn)行了分析，并對(duì)櫛孔扇貝Gypsy、Ngaro、DIRS三類主要LTR與基因的關(guān)系做了初步的探討，同時(shí)對(duì)LTR逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子各個(gè)亞家族在胚胎發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式進(jìn)行了分析。這些結(jié)果為進(jìn)一步理解轉(zhuǎn)座子對(duì)基因組進(jìn)化的作用提供有益參考。

1 數(shù)據(jù)來源與分析方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

本研究使用的數(shù)據(jù)來源于已發(fā)表的櫛孔扇貝基因組重復(fù)序列的注釋信息，其重復(fù)序列的鑒定是通過以下流程實(shí)現(xiàn)的：使用RepeatModeler[27]，RepeatScout，Piler[28]和 LTR_FINDER[29]軟件預(yù)測(cè)出來的數(shù)據(jù)結(jié)合RepBase核酸庫(kù)，通過Uclust[30]軟件按照 80-80-80 原則進(jìn)行整合，最后利用RepeatMasker[29]軟件進(jìn)行注釋得到denovo從頭預(yù)測(cè)以及homology-based的轉(zhuǎn)座子元件；TE proteins則是基于RepBase蛋白庫(kù)分別通過RepeatProteinMask[27]軟件注釋基因組得到的轉(zhuǎn)座子元件；將上述兩種方法鑒定的轉(zhuǎn)座子合并、去冗余后獲得用于后續(xù)分析的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子[31]。櫛孔扇貝胚胎時(shí)期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)同樣來源于已發(fā)表的數(shù)據(jù)[31]。

1.2 分析方法

1.2.1 櫛孔扇貝LTR逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的分類統(tǒng)計(jì)及分布特征 利用櫛孔扇貝轉(zhuǎn)座子的注釋文件統(tǒng)計(jì)每條染色體上分布的LTR逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的拷貝數(shù)量、長(zhǎng)度，計(jì)算LTR逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在每條染色體上的分布密度及皮爾森相關(guān)系數(shù)，探究染色體長(zhǎng)度與LTR逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子拷貝數(shù)以及染色體長(zhǎng)度與LTR逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的分布密度之間的相關(guān)性；利用櫛孔扇貝基因結(jié)構(gòu)注釋文件統(tǒng)計(jì)基因在染色體上的數(shù)量及位置信息；通過櫛孔扇貝轉(zhuǎn)座子的注釋文件統(tǒng)計(jì)LTR逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子各個(gè)亞家族在染色體上的位置信息，并利用bedtools[32]來統(tǒng)計(jì)每10 kb染色體上分布的LTR逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子各個(gè)亞家族的數(shù)量;最后繪制Circos[33]圖展示LTR逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子各個(gè)亞家族及基因在染色體上的分布特征。

利用bedtools[34]統(tǒng)計(jì)了Gypsy、Ngaro及DIRS分別分布在基因間區(qū)、基因組上游3 kb、下游3 kb的數(shù)量，進(jìn)而統(tǒng)計(jì)了分布在基因編碼區(qū)(CDS)區(qū)、5’UTR區(qū)、3’UTR區(qū)、內(nèi)含子區(qū)域分布的三類逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的數(shù)量。

1.2.2 櫛孔扇貝LTR逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在胚胎發(fā)育各個(gè)時(shí)期及在成體各個(gè)組織中的表達(dá) 將LTR逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子中分布最多的Ngaro、DIRS、Gypsy、Copia和ERV1在胚胎各個(gè)發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量以及在成體各個(gè)組織中的表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，數(shù)據(jù)處理具體流程：

1.TPM 的計(jì)算，首先利用將櫛孔扇貝轉(zhuǎn)座子注釋文件中的 LTR 逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子 的注釋信息根據(jù) Perl 腳本單獨(dú)提出為 CF.LTR.all。利用 Cufflinks 軟件將 CF.LTR.all 的格式轉(zhuǎn)換為 gtf 的格式；將櫛孔扇貝胚胎幼蟲各個(gè)時(shí)期的數(shù)據(jù)以及 成體各個(gè)組織的數(shù)據(jù)(已經(jīng)進(jìn)行了 reads 的過濾)以 櫛孔扇貝的基因結(jié)構(gòu)文件為參考序列,利用STAR進(jìn)行比對(duì)命令行得到比對(duì)好的 SAM文件將得到的 SAM 文件轉(zhuǎn)換為 BAM 格式得到 BAM 文件，然后將 BAM 文件進(jìn)行排序，將排序好的文件 通過 featureCounts 進(jìn)行 counts 統(tǒng)計(jì)得到 count 文件。將得到的櫛孔胚胎各個(gè)時(shí)期以及成體各個(gè)組織的表達(dá)進(jìn)行 count 統(tǒng)計(jì)。以 raw count (RC)為標(biāo)準(zhǔn)，利用 Perl 腳本計(jì)算各個(gè) LTR 轉(zhuǎn)座子在 各個(gè)胚胎發(fā)育時(shí)期以及各個(gè)成體組織的 TPKM 值。各個(gè)發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量以及在成體各個(gè)組織中的表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，繪制柱狀圖。

2.計(jì)算各個(gè)轉(zhuǎn)座子在胚胎發(fā)育各個(gè)時(shí)期以及成體各組織表達(dá)量的標(biāo)準(zhǔn)差，規(guī)定 標(biāo)準(zhǔn)差在≥10時(shí)認(rèn)為是差異表達(dá)的，利用篩選出來的這些轉(zhuǎn)座子以及其 TPM 值，利用軟件 R 包進(jìn)行熱圖的繪制。得到各個(gè)時(shí)期各個(gè)轉(zhuǎn)座子表達(dá)的熱圖以及成體各個(gè)組織轉(zhuǎn)座子的表達(dá)熱圖。

2 結(jié)果

2.1 櫛孔扇貝LTR逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的分類統(tǒng)計(jì)及分布特征分析

櫛孔扇貝中逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子拷貝數(shù)量最多的是LTR逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，有42萬(wàn)個(gè)拷貝。LTR逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子主要包含6個(gè)亞家族，其中拷貝數(shù)量最多的是Gypsy、Ngaro和DIRS(見表1)。通過LTR逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子各個(gè)亞家族的長(zhǎng)度分布可以看出，Gypsy、Ngaro、DIRS三類逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在基因組中總的堿基數(shù)目上也占有較大的比例(見圖1)。

圖1 LTR逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子各個(gè)亞家族的長(zhǎng)度分布Fig.1 Length distribution of various LTR retrotransposons

櫛孔扇貝LTR逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在不同染色體上的分布是不同的。不同染色體上LTR的拷貝數(shù)是不同的(見表2)，染色體長(zhǎng)度與LTR逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子總長(zhǎng)度之間具有正相關(guān)性(皮爾森相關(guān)系數(shù)r=0.906 6)，即染色體長(zhǎng)度越長(zhǎng)，分布的LTR逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的總長(zhǎng)度越長(zhǎng)，同時(shí)LTR逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的拷貝數(shù)量也越多。染色體長(zhǎng)度與每Mb拷貝數(shù)之間具有負(fù)相關(guān)性(皮爾森相關(guān)系數(shù)r=-0.919 9)，即染色體越長(zhǎng)，LTR逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的分布密度越小。

表2 櫛孔扇貝LTR逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在各條染色體上的分布數(shù)量以及密度Table 2 Distribution number and density of LTR retrotransposon on each chromosome of scallop

為了進(jìn)一步調(diào)查轉(zhuǎn)座子的分布與基因的關(guān)系，本研究統(tǒng)計(jì)了Gypsy、Ngaro、DIRS三大類拷貝數(shù)量較多的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在基因上下游3 kb及基因內(nèi)部的分布情況。三類逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子均表現(xiàn)為在基因間區(qū)的分布最多，Gypsy、DIRS分布在基因間區(qū)的轉(zhuǎn)座子占比都在50%以上，Ngaro分布在基因間區(qū)的比例是三類LTR中最低的，而Ngaro在基因區(qū)分布的比例較其它兩類偏高(見圖2)。三類逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座在基因區(qū)有相似的分布規(guī)律，絕大部分分布在內(nèi)含子區(qū)域，分布在CDS區(qū)域的轉(zhuǎn)座子數(shù)量較少(見圖3)。

(A:Gypsy；B:Ngaro；C:DIRS)圖2 Gypsy，Ngaro，DIRS逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在基因上、下游，內(nèi)部和間區(qū)的分布統(tǒng)計(jì)Fig.2 Distribution of Gypsy,Ngaro and DIRS in upstream,downstream，internal and IG regions of gene

圖3 Gypsy、Ngaro、DIRS逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在基因區(qū)的分布Fig.3 Distribution of Gypsy,Ngaro and DIRS in gene region

2.2 LTR逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在胚胎發(fā)育各個(gè)時(shí)期的表達(dá)模式

為了了解不同類型的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在櫛孔扇貝胚胎發(fā)育時(shí)期的活躍情況，本研究繪制了Gypsy、Ngaro、DIRS、Pao、Copia和ERV1六類主要LTR的表達(dá)模式(見圖4)。在胚胎發(fā)育的各個(gè)時(shí)期六類主要的LTR逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子都有表達(dá)，其中Gypsy和Ngaro這兩類逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在胚胎發(fā)育各個(gè)時(shí)期的表達(dá)量都遠(yuǎn)高于其它四類，表明Gypsy和Ngaro這兩類逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在整個(gè)胚胎發(fā)育時(shí)期都處于較活躍狀態(tài)。Gypsy及Ngaro類型轉(zhuǎn)座子呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)表達(dá)，表現(xiàn)為從受精卵時(shí)期到殼頂幼蟲時(shí)期呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，到了殼頂期整體又有下降的趨勢(shì)，表達(dá)量的峰值出現(xiàn)在擔(dān)輪幼蟲時(shí)期。其它四類LTR的表達(dá)量整體偏低。

根據(jù)LTR逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在胚胎發(fā)育各個(gè)時(shí)期的整體表達(dá)情況，對(duì)表達(dá)量較高的Gypsy和Ngaro中具有差異表達(dá)的LTR繪制了胚胎發(fā)育各個(gè)時(shí)期的表達(dá)模式圖(見圖5)，從圖中可以看出這兩類逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在胚胎發(fā)育過程中不是恒定表達(dá)的，而是在不同時(shí)期有不同特異高表達(dá)的轉(zhuǎn)座子種類，而且相鄰的時(shí)期表達(dá)模式往往比較接近。高表達(dá)的LTR即處于活躍狀態(tài)的LTR，在胚胎發(fā)育早期(原腸胚時(shí)期之前)和發(fā)育后期(稚貝時(shí)期)要明顯多于殼頂幼蟲時(shí)期，這與圖4中兩類LTR的總表達(dá)模式是一致的。

(Zygote:受精卵；2～8 cells:多細(xì)胞期；Blastula:囊胚期；Gastrula:原腸胚；Trochophore:擔(dān)輪幼蟲；Dstage veliger:D形幼蟲期；Umbo early/middle/post:殼頂幼蟲前期/中期/后期；Pedi veliger:匍匐幼蟲；Juvenile:稚貝)圖4 LTR逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的六個(gè)主要亞家族胚胎發(fā)育過程的表達(dá)模式Fig.4 Expression profiles of the six major subfamilies of LTR retrotransposonsduring embryonic stages

2.3 LTR逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在各成體組織器官中的表達(dá)模式

為了了解不同類型的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在櫛孔扇貝各組織器官中的活躍情況，本研究繪制了Gypsy、Ngaro、DIRS、Pao、Copia和ERV1六類主要LTR的組織器官表達(dá)模式圖(見圖6)。不同種類逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的表達(dá)具有組織的差異性。與胚胎發(fā)育過程的表達(dá)模式類似，Gypsy和Ngaro兩種類型的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在大部分組織器官中占據(jù)表達(dá)優(yōu)勢(shì)。與胚胎發(fā)育時(shí)期略有不同的是，在成體組織器官中Gyspy的表達(dá)優(yōu)勢(shì)更明顯，體現(xiàn)為在絕大部分組織器官中Gypsy的表達(dá)量都高于Ngaro。唯一例外的組織是肝胰腺，肝胰腺中表達(dá)量最高的LTR類型為ERV1，是其它組織器官中表達(dá)量的4～5倍，而在其它組織器官中占表達(dá)優(yōu)勢(shì)的Gypsy和Ngaro在肝胰腺中表達(dá)量非常低。

通過繪制Gypsy和Ngaro兩類高表達(dá)的LTR轉(zhuǎn)座子在成體各組織器官的差異表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)LTR較活躍的組織器官主要有鰓、腎、性腺、血淋巴(見圖7)。作為組織類型接近的雄性性腺和雌性性腺，其LTR的表達(dá)模式差別非常大，其中Gypsy類型的LTR主要在雄性性腺中發(fā)揮作用，而Ngaro類型的LTR在雌雄性腺中高表達(dá)的模塊幾乎沒有交集，表明高表達(dá)的Ngaro在這兩種組織中是不同的。在組成閉殼肌的兩種肌肉類型——橫紋肌和平滑肌中，高表達(dá)的LTR種類也是不同的，橫紋肌中活躍的Gypsy和Ngaro類型的LTR明顯多于平滑肌。

(Zygote:受精卵；2～8 cells:多細(xì)胞期；Blastula:囊胚期；Gastrula:原腸胚；Trochophore:擔(dān)輪幼蟲；Dstage veliger:D形幼蟲期；Umbo early/middle/post:殼頂幼蟲前期/中期/后期；Pedi veliger:匍匐幼蟲；Juvenile:稚貝)圖5 差異表達(dá)的Gypsy及Ngaro逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在胚胎發(fā)育各個(gè)時(shí)期的表達(dá)模式Fig.5 Expression patterns of differentially expressed Gypsy and Ngaro retrotransposons at various stages during embryo development

(Gill:鰓；Mantle:外套膜；Kidney:腎；Mgonad:雄性性腺；Fgonad:雌性性腺；Eye:眼；Foot:足；Hepatopancreas:肝胰腺；Hemolymph:血淋巴；Adductor muscle:橫紋?。籗mooth muscle:平滑肌)圖6 LTR逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的六個(gè)主要亞家族在成體各個(gè)組織的表達(dá)柱形圖Fig.6 Histogram of expression of six major subfamilies of LTR retrotransposons in adult tissues

(Gill:鰓；Mantle:外套膜；Kidney:腎；Mgonad:雄性性腺；Fgonad:雌性性腺；Eye:眼；Foot:足；Hepatopancreas:肝胰腺；Hemolymph:血淋巴；Adductor muscle:橫紋??；Smooth muscle:平滑肌)圖7 差異表達(dá)的Gypsy及Ngaro逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在成體各個(gè)組織中的表達(dá)模式(a:Gypsy;b:Ngaro)Fig.7 Expression pattern of differentially expressed Gypsy and Ngaro retrotransposons in adult tissues(a:Gypsy;b:Ngaro)

3 討論

LTR逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子是真核生物基因組的重要組成成分，是影響基因組進(jìn)化的一個(gè)重要因素。在不同種類的后生動(dòng)物中，LTR逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子亞家族的分布情況是不一樣的，Gypsy在無脊椎動(dòng)物中是分布最為廣泛的一類LTR逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子[35]；而對(duì)于YR類型的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，研究發(fā)現(xiàn)DIRS和Ngaro在鳥類以及哺乳類中是缺失的，而主要分布在昆蟲、魚類、海洋生物以及爬行類動(dòng)物中[8]。在櫛孔扇貝轉(zhuǎn)座子中，LTR逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子各個(gè)亞家族在染色體上的總長(zhǎng)度與染色體的長(zhǎng)度呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)，染色體越長(zhǎng)分布的轉(zhuǎn)座子總長(zhǎng)度越長(zhǎng)，而分布密度與染色體長(zhǎng)度之間是顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，染色體越長(zhǎng)每Mb包含的轉(zhuǎn)座子的數(shù)量越少。在建鯉中則發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座子是彌散分布的，但基本都分布在染色體的頂端[34]；Takahashi等[36]的研究表明轉(zhuǎn)座子在染色體上的分布位置并沒有規(guī)律性；在植物中發(fā)現(xiàn)的Gypsy分布多的地方基因明顯分布少，Gypsy主要集中在著絲點(diǎn)附近分布[37]；由此可見在不同的物種內(nèi)轉(zhuǎn)座子在染色體上的分布特征存在著很大的差異性。通過對(duì)三類轉(zhuǎn)座子在基因上下游、基因內(nèi)部、基因間區(qū)的統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)三類逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子都有50%左右的LTR分布在基因的間區(qū)，分布在基因間區(qū)的轉(zhuǎn)座子可能會(huì)導(dǎo)致復(fù)雜的重排過程從而影響基因的調(diào)控[38-39]。分布在基因區(qū)的三類逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在內(nèi)含子區(qū)分布的數(shù)量是最多的，遠(yuǎn)高于在CDS區(qū)的分布數(shù)量，產(chǎn)生這種結(jié)果的原因可能是：內(nèi)含子區(qū)域相比編碼區(qū)域受到更小的選擇壓力，因而插入內(nèi)含子區(qū)域的轉(zhuǎn)座子往往會(huì)有更大的存活機(jī)會(huì)[40]。

目前關(guān)于轉(zhuǎn)座子在胚胎發(fā)育時(shí)期的表達(dá)與功能的研究還較少，有研究報(bào)道在人、小鼠以及綿羊的胎盤中檢測(cè)到了很多ERV編碼的Env蛋白，這種蛋白能夠促進(jìn)細(xì)胞融合以及合胞體的形成[41]，敲掉特定的ERV之后早期胚胎發(fā)育會(huì)受阻。斑馬魚中通過qPCR發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在腦與心臟中的表達(dá)量明顯的高于其他組織中的表達(dá)量[42]。在建鯉中鑒定到的Gypsy逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子JRE，在建鯉的各個(gè)組織中都有表達(dá)而在肝以及心臟中的表達(dá)量略高于其他組織[43]。本研究通過生物信息學(xué)的手段，分析了LTR逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在胚胎發(fā)育各個(gè)時(shí)期以及成體各個(gè)組織中的表達(dá)量及表達(dá)模式。Gypsy及Ngaro在胚胎發(fā)育的各個(gè)時(shí)期及成體各個(gè)組織中都具有較高的表達(dá)量，表明這兩類逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子處于較為活躍的狀態(tài)。本研究也在在扇貝胚胎發(fā)育時(shí)期也鑒定到了大量表達(dá)的ERV1轉(zhuǎn)座子，為后續(xù)研究其在扇貝胚胎發(fā)育中的作用提供了重要的線索,同時(shí)發(fā)現(xiàn)肝臟中ERV的表達(dá)量明顯高于其他組織，而在肝臟中Gypsy及Ngaro表達(dá)量明顯低于其他組織。在胚胎發(fā)育的不同時(shí)期以及成體各個(gè)組織，Gypsy、Ngaro都有各自特異性高表達(dá)的轉(zhuǎn)座子，這些特異高表達(dá)的轉(zhuǎn)座子具體生物學(xué)功能還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

本研究通過對(duì)櫛孔扇貝逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在基因組的分布特征和時(shí)空表達(dá)模式進(jìn)行系統(tǒng)分析，為系統(tǒng)認(rèn)知逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子并深入理解逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子對(duì)基因組進(jìn)化的作用提供了新的線索。