地熊蜂基因組中具有潛在活性的轉(zhuǎn)座子鑒定

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京 100093）

轉(zhuǎn)座子（TEs）是能夠從基因組一個(gè)位點(diǎn)轉(zhuǎn)移到另一個(gè)位點(diǎn)，在此過程中通常會(huì)發(fā)生自我復(fù)制的DNA 片段[1]。轉(zhuǎn)座子可分為逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子和DNA 轉(zhuǎn)座子兩大類。逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子借助轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生的mRNA 而完成轉(zhuǎn)座過程，轉(zhuǎn)座后逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的拷貝數(shù)增加；而DNA 轉(zhuǎn)座子是借助自身的DNA 序列發(fā)生轉(zhuǎn)座，可以是復(fù)制或非復(fù)制型的轉(zhuǎn)座[2,3]。在幾乎所有生物的基因組中都發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)座子，通常數(shù)量很多。例如在脊椎動(dòng)物基因組中，轉(zhuǎn)座子含量的變化范圍從綠河豚的6%到斑馬魚的55%以上[4]。在植物中，轉(zhuǎn)座子更為普遍，轉(zhuǎn)座子覆蓋了多達(dá)90%的玉米基因組[5]。在昆蟲中，轉(zhuǎn)座子的基因組部分從南極蠓中的低至1%[6]到蝗蟲中的高達(dá)65%[7]。由于轉(zhuǎn)座子可以在一個(gè)生物的基因組中發(fā)生跳動(dòng)，這一方面可能破壞基因的編碼序列或調(diào)控序列，造成個(gè)體的表型發(fā)生變異；還可能為染色體的異位重組提供熱點(diǎn)，從而導(dǎo)致宿主基因組中的染色體發(fā)生缺失、重復(fù)、倒位和易位等變異[8,9]。目前科學(xué)家利用活躍的轉(zhuǎn)座子可以破壞基因組中功能基因的這一特點(diǎn)，為許多種生物創(chuàng)制了突變體，并利用這些突變體鑒定出了許多功能基因。例如，利用Sleeping Beauty轉(zhuǎn)座子誘變小鼠，鑒定出涉及膠質(zhì)瘤產(chǎn)生的候選基因[10]；在逆轉(zhuǎn)座子Tos17誘導(dǎo)產(chǎn)生的水稻胎生突變體中捕獲了影響水稻脫落酸合成的OsABA1和OsTATC基因[11]；根據(jù)P轉(zhuǎn)座子創(chuàng)造的果蠅突變體的表型特征，發(fā)現(xiàn)了與睡眠調(diào)節(jié)有關(guān)的SLEEPLESS基因[12]等。鑒定出的功能基因在生物的遺傳育種和品質(zhì)改良中發(fā)揮了重要作用。

熊蜂是植物重要的傳粉者，具有重要經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價(jià)值[13]。在世界范圍內(nèi)，熊蜂為超過4 萬公頃的溫室作物授粉，產(chǎn)生的經(jīng)濟(jì)價(jià)值約為120 億歐元/年[14]。但目前只有少數(shù)幾種熊蜂能夠提供授粉服務(wù)，其余大多數(shù)熊蜂由于繁育或授粉性能差而不能被很好地使用。近年來，隨著全球環(huán)境變化的加劇，野外生存的熊蜂正在遭受自然界中各種生物和非生物因素的影響，導(dǎo)致一些熊蜂的數(shù)量顯著減少[15]。鑒于熊蜂在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的重要性及它們?cè)谝巴猸h(huán)境中受到的威脅，挖掘出與熊蜂繁育、授粉及環(huán)境抗性等性狀相關(guān)的基因，對(duì)于促進(jìn)熊蜂更好地服務(wù)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、更好地提供生態(tài)服務(wù)非常重要。但是目前熊蜂中尚無高效的功能基因挖掘系統(tǒng)。

近年來，科學(xué)家成功地在昆蟲中應(yīng)用轉(zhuǎn)座子進(jìn)行了功能基因的挖掘，但相關(guān)研究主要集中于雙翅目的果蠅中[16-18]。本研究旨在對(duì)地熊蜂基因組中的轉(zhuǎn)座子進(jìn)行全面的鑒定、分類和注釋，并鑒定出具有潛在轉(zhuǎn)座活性的轉(zhuǎn)座子，以用于熊蜂功能基因的挖掘。

1 材料與方法

1.1 基因組與已知重復(fù)序列數(shù)據(jù)庫的來源

地熊蜂的基因組序列從NCBIGenebank 數(shù)據(jù)庫下載獲得（www.ncbi.nlm.nih.gov/），assembly accession:GCF_000214255.1。

1.2 轉(zhuǎn)座子數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建

RepeatModeler[19]是一個(gè)從頭（de novo） 鑒定和分類轉(zhuǎn)座子的軟件，其中包括RECON[20]和RepeatScout 兩個(gè)程序[21]，用于轉(zhuǎn)座子家族的從頭鑒定并構(gòu)建全基因組轉(zhuǎn)座子的非冗余數(shù)據(jù)庫。此外，除了重復(fù)序列組裝的一般方法外，我們還采用基于結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)座子預(yù)測(cè)方法，使用兩個(gè)專門的軟件來檢測(cè)小的非自主性轉(zhuǎn)座子，這是因?yàn)樗鼈內(nèi)鄙倬幋a區(qū)，因此更難通過與同源物的分類來進(jìn)行區(qū)分。MITE-Hunter[22]用于鑒定一種屬于DNA 轉(zhuǎn)座子的微型反向重復(fù)轉(zhuǎn)座元件（MITEs）。SINE_scan[23]鑒定非自主型的非LTR逆轉(zhuǎn)座子，稱為短散在元件（SINE）。SINE_scan 是基于SINE-Finder[24]的從頭識(shí)別SINE 的軟件，不同于SINE-Finder 僅能鑒定tRNA 來源的SINE，SINE_scan 可以識(shí)別所有三種已知的SINE 類型，即tRNA、7SLRNA 和5SRNA。

將RepeatModerler、MITE-Hunter 和SINE_scan產(chǎn)生的一致性序列（consensus sequence）合并，并使用cd-hit[25]軟件去冗余（-n 5-d 0-aL 0.99-c 0.8-s 0.8），進(jìn)而得到整個(gè)基因組中非冗余的轉(zhuǎn)座子數(shù)據(jù)庫。

1.3 基因組轉(zhuǎn)座子注釋

使用RepeatMasker 軟件對(duì)得到的轉(zhuǎn)座子一致性序列進(jìn)行注釋和分類（使用-a、-lib 參數(shù)），并使用軟件內(nèi)置的buildSummary.pl 腳本總結(jié)轉(zhuǎn)座子超家族估計(jì)的拷貝數(shù)和基因組比例（基于每個(gè)轉(zhuǎn)座子被屏蔽的堿基數(shù)）。

1.4 轉(zhuǎn)座子間序列差異分析

一致性序列與不同拷貝之間的差異可以用K 值（kimura distance）[26]來表示。把buildSummary.pl 腳本的結(jié)果文件用作createrepeatlandscape.pl和calcdivergencefromalign.pl 腳本的輸入，以計(jì)算Kimura 距離，我們對(duì)createrepeatlandscape.pl 做出更改，對(duì)轉(zhuǎn)座子家族一致性的序列與拷貝之間的差異合并到類，并用編寫的R 腳本繪制差異分布統(tǒng)計(jì)圖。三個(gè)腳本都是RepeatMasker 軟件包中的Perl腳本。

1.5 潛在活性轉(zhuǎn)座子的鑒定

使用編寫的shell 腳本對(duì)RepeatMasker 的結(jié)果.out文件進(jìn)行進(jìn)一步篩選，對(duì)于每個(gè)與其轉(zhuǎn)座子家族的一致性序列（推測(cè)的祖先序列）差異度小于等于2%、覆蓋度大于98%的轉(zhuǎn)座子，我們提取出它們的序列，并手動(dòng)驗(yàn)證其是否具有活躍轉(zhuǎn)座子的序列特征。對(duì)于滿足上述所有條件的轉(zhuǎn)座子，認(rèn)為它們是具有潛在活性的轉(zhuǎn)座子。

2 結(jié)果

2.1 地熊蜂基因組轉(zhuǎn)座子鑒定結(jié)果

表1 地熊蜂全基因組轉(zhuǎn)座子統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

經(jīng)過RepeatMasker 的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，我們?cè)诘匦芊浠蚪M中一共鑒定出了167 條一致性序列，被劃分到22 個(gè)超家族中（表1）。DNA 轉(zhuǎn)座子和逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子占比幾乎相同，TcMar、Jockey 和Maverick 是含量最豐富的轉(zhuǎn)座子，代表了基因組中超過50%的轉(zhuǎn)座子，P 轉(zhuǎn)座子含量最低。LTR 主要的類別都存在于地熊蜂基因組中，其中Gypsy 和Pao 類別最多。與DNA、LINE、LTR 轉(zhuǎn)座子相比，SINE 轉(zhuǎn)座子所占比例最小。

2.2 轉(zhuǎn)座子差異分布分析結(jié)果

圖1 基于Kimura distance計(jì)算的地熊蜂轉(zhuǎn)座子拷貝之間的差異性

我們通過計(jì)算K 值來估算轉(zhuǎn)座子的年齡和轉(zhuǎn)座歷史，其中每一個(gè)波峰可以代表物種在進(jìn)化過程中發(fā)生了轉(zhuǎn)座子拷貝數(shù)迅速增加（爆發(fā)）。從結(jié)果可以看出，在地熊蜂的基因組中發(fā)生了兩次爆發(fā)事件（圖1）。在第一次爆發(fā)事件中，DNA 轉(zhuǎn)座子是最主要的成分，顯示出DNA 轉(zhuǎn)座子在此階段極為活躍。轉(zhuǎn)座子的第二次也就是最近的一次爆發(fā)中，DNA、MITE以及LINE 都出現(xiàn)了拷貝數(shù)的增加。對(duì)于地熊蜂基因組來說，DNA 轉(zhuǎn)座子的活躍轉(zhuǎn)座貫穿了兩次爆發(fā)事件。

2.3 潛在的活躍轉(zhuǎn)座子

在地熊蜂基因組中，我們鑒定出兩條MITE 轉(zhuǎn)座子，它們與祖先序列的分化程度小于2%并且具有完整的轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)，我們認(rèn)為它們是具有潛在活性的轉(zhuǎn)座子。序列如下：

3 討論

在基因組中對(duì)轉(zhuǎn)座子進(jìn)行全面注釋與研究至關(guān)重要，但是大多數(shù)測(cè)序項(xiàng)目都對(duì)與表型特征相關(guān)的基因組成分感興趣，通常會(huì)忽略基因組的重復(fù)序列或僅給予很少關(guān)注。轉(zhuǎn)座子是一大類在生物基因組中廣泛存在的序列。轉(zhuǎn)座子是挖掘功能基因的有力工具，果蠅中人們已經(jīng)成功地利用活躍的轉(zhuǎn)座子來創(chuàng)制果蠅的突變體，進(jìn)行功能基因的挖掘[27-29]。本研究在地熊蜂基因組鑒定出2 條潛在活躍的MITE 轉(zhuǎn)座子，若能進(jìn)一步通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其活性，將對(duì)熊蜂功能基因挖掘及優(yōu)良品種培育具有重要意義。