丙泊酚通過上調(diào)miR-133a抑制乳腺癌細(xì)胞增殖和侵襲的機(jī)制研究

文放放 李熊剛 梁紅濤

丙泊酚是一種用于麻醉誘導(dǎo)和維持的靜脈麻醉藥，因其起效短，恢復(fù)快而廣泛應(yīng)用于各種腫瘤切除手術(shù)中。多項研究表明，丙泊酚除了作為麻醉劑起作用外，還有許多非麻醉作用，如丙泊酚可抑制胰腺癌細(xì)胞生長和侵襲[1]，抑制胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[2]，抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞生長和侵襲[3]，可能對腫瘤患者預(yù)后起積極作用。乳腺癌是最常見的女性惡性腫瘤，易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，死亡率較高[4]。另有研究表明，丙泊酚具有抑制體外乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移的重要作用[5]。但目前有關(guān)丙泊酚影響乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的分子作用機(jī)制尚未完全闡明。miRNA參與細(xì)胞增生、分化、凋亡等多種生理病理過程，已證實miR-133a在乳腺癌、腎癌、結(jié)直腸癌等多種腫瘤異常表達(dá)，與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為有關(guān)[6]。本研究分析丙泊酚對乳腺癌MCF-7細(xì)胞中miR-133a表達(dá)的影響，探討其抑制乳腺癌增殖和侵襲的可能分子作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心提供。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及實驗設(shè)計分組

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：取凍存的MCF-7細(xì)胞，室溫下解凍，加入含有10%胎牛血清(Gibco公司)的DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)中，置于37℃，5%CO2的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)2～3 d后進(jìn)行傳代。吸出培養(yǎng)基，加入2 ml 0.25%胰酶靜置消化2～5 min，待細(xì)胞縮起變圓，將胰酶吸出，加入無血清DMEM培養(yǎng)基3 ml 反復(fù)吸打成單細(xì)胞懸液，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 實驗設(shè)計分組：首先將細(xì)胞分為空白對照組(正常培養(yǎng)，不做任何處理)和丙泊酚(廠家：北京世橋生物制藥有限公司)處理組(分別用5 μmol/L、10 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L丙泊酚處理)，采用CCK-8法檢測不同濃度丙泊酚對細(xì)胞增殖活性的影響，以選擇合適的丙泊酚濃度進(jìn)行后續(xù)實驗。確定丙泊酚濃度后，將細(xì)胞分為空白對照組(正常培養(yǎng)，不做任何處理)，丙泊酚組(丙泊酚處理)，丙泊酚+NC inhibitor組[即丙泊酚處理，并轉(zhuǎn)染陰性對照抑制劑(inhibitor)]，丙泊酚+miR-133a inhibitor組[即丙泊酚處理，并轉(zhuǎn)染miR-133a特異性抑制劑(miR-133a inhibitor)]。

1.3 方法

1.3.1 CCK-8法檢測丙泊酚對細(xì)胞增殖的影響：收集對數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞，用DMEM完全培養(yǎng)液重懸，將細(xì)胞以1×104個/孔的密度接種于96孔板中，分組分別加入0 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L丙泊酚，放入37℃，5%CO2的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)0 h、6 h、12 h、24 h、48 h時，每孔加入1∶10稀釋的CCK-8試劑(北京英格恩生物科技有限公司)10 μl，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后。放入HBS-1096A酶標(biāo)分析儀(南京德鐵實驗設(shè)備有限公司)中，測定細(xì)胞450 nm處吸光度(absorbancy，OD)，繪制細(xì)胞生長曲線。每組細(xì)胞設(shè)置6個重復(fù)孔。

1.3.2 qRT-PCR檢測丙泊酚對細(xì)胞中miR-133a表達(dá)的影響:收集培養(yǎng)48 h后的對照組、丙泊酚組、丙泊酚+NC inhibitor組、丙泊酚+miR-133a inhibitor組細(xì)胞，使用Trizol RNA提取試劑盒(Invitrogen公司)提取細(xì)胞總RNA，UV759型紫外分光光度計(青島智匯谷信息技術(shù)有限公司)測定細(xì)胞總RNA在260 nm、280 nm處吸光度比值1.8～2.0，濃度100～200 μg/μl。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen公司)合成cDNA，采用SYBR Green染料法進(jìn)行qRT-PCR，檢測各組細(xì)胞中miR-133a表達(dá)水平。qRT-PCR程序：95℃預(yù)變性2 min；94℃變性15 s，60℃退火30 s，68℃延伸30 s，共40個循環(huán)。結(jié)果以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算細(xì)胞中miR-133a相對表達(dá)量。

1.3.3 Transwell實驗檢測丙泊酚對細(xì)胞侵襲能力的影響:收集培養(yǎng)48 h后對照組、丙泊酚組、丙泊酚+NC inhibitor組、丙泊酚+miR-133a inhibitor組細(xì)胞，使用無血清DMEM培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個/ml。使用無血清DMEM培養(yǎng)液按1∶10的比例稀釋Mateigel基底膠(美國BD公司)，然后取稀釋后Mateigel基底膠100 μl加入Transwell小室并鋪滿上室底部，37℃放置30 min，然后在下室加入700 μl含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，同時取100 μl上述細(xì)胞懸液接種于上室，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。取出Transwell小室，棄培養(yǎng)液，用棉簽輕擦去上層細(xì)胞，在下室中加入甲醇至浸沒上室，室溫固定30 min后，PBS沖洗2次，加入0.1%結(jié)晶紫染色液，37℃下染色30 min，PBS沖洗。在IX53倒置顯微鏡(Olympus Corporation)下隨機(jī)觀察5個不同視野，計算透膜細(xì)胞數(shù)。每組設(shè)置6次重復(fù)。

1.3.4 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot)檢測細(xì)胞中EGFR、CD147、MMP-9、MMP-2蛋白表達(dá):收集培養(yǎng)48 h后的對照組、丙泊酚組、丙泊酚+NC inhibitor組、丙泊酚+miR-133a inhibitor組細(xì)胞，加入RIPA裂解液(北京碧云天公司)提取細(xì)胞總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。取50 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，并轉(zhuǎn)膜至PVDF膜。加入5%脫脂奶粉中封閉1 h，加入稀釋后的EGFR、CD147、MMP-9、MMP-2抗體一抗(Abcam公司)，4℃反應(yīng)過夜，分別加入辣根過氧化酶標(biāo)記二抗，37℃孵育1 h。TBST溶液沖洗3次，每次5 min。加入超敏ECL發(fā)光液反應(yīng)5 min，放入Alpha凝膠成像系統(tǒng)(New Discovery公司)中曝光、拍照，以β-antin為內(nèi)參，使用ImageJ軟件分析EGFR、CD147、MMP-9、MMP-2蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 丙泊酚作用濃度篩選 CCK-8細(xì)胞增殖實驗結(jié)果，丙泊酚處理抑制MCF-7細(xì)胞增殖，表現(xiàn)出濃度依賴性，根據(jù)細(xì)胞增殖實驗結(jié)果，選擇對細(xì)胞增殖抑制率50%左右的丙泊酚濃度10 μmol/L作為最佳濃度，進(jìn)行后續(xù)實驗。見表1。

表1 丙泊酚作用濃度篩選

2.2 丙泊酚促進(jìn)MCF-7細(xì)胞中miR-133a的表達(dá) RT-PCR結(jié)果顯示，丙泊酚組和丙泊酚+NC inhibitor組細(xì)胞中miR-133a相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但與對照組比較均明顯升高(P<0.05)；丙泊酚+miR-133a inhibitor組細(xì)胞中miR-133a相對表達(dá)量高于對照組但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但與丙泊酚組、丙泊酚+NC inhibitor組比較明顯降低(P<0.05)。說明丙泊酚處理促進(jìn)MCF-7細(xì)胞中miR-133a的表達(dá)。見表2。

表2 丙泊酚對MCF-7細(xì)胞中miR-133a表達(dá)的影響

2.3 丙泊酚上調(diào)miR-133a抑制MCF-7細(xì)胞增殖 CCK-8實驗結(jié)果顯示，丙泊酚組細(xì)胞增殖百分比[(50.09±4.21)%]與丙泊酚+NC inhibitor組細(xì)胞增殖百分比[(51.01±4.03)%]比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但均明顯低于對照組細(xì)胞增殖百分比[(98.26±8.37)%](P<0.05)；丙泊酚+miR-133a inhibitor組細(xì)胞增值百分比[(91.26±7.76)%]與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但明顯高于丙泊酚組和丙泊酚+NC inhibitor組(P<0.05)。說明丙泊酚抑制MCF-7細(xì)胞增殖，而抑制miR-133a表達(dá)后可逆轉(zhuǎn)丙泊酚對MCF-7細(xì)胞增殖的抑制作用。見表3。

表3 丙泊酚上調(diào)miR-133a抑制MCF-7細(xì)胞增殖

2.4 丙泊酚上調(diào)miR-133a抑制MCF-7細(xì)胞侵襲能力 Transwell實驗結(jié)果，丙泊酚組和丙泊酚+NC inhibitor組細(xì)胞侵襲數(shù)目比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但明顯低于對照組；丙泊酚+miR-133a inhibitor組細(xì)胞侵襲數(shù)目與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但明顯高于丙泊酚組和丙泊酚+NC inhibitor組(P<0.05)。說明丙泊酚抑制MCF-7細(xì)胞侵襲，而抑制miR-133a表達(dá)后可逆轉(zhuǎn)丙泊酚對MCF-7細(xì)胞侵襲的抑制作用。見圖1，表4。

表4 4組MCF-7細(xì)胞侵襲數(shù)目比較 個,

2.5 丙泊酚上調(diào)miR-133a抑制MCF-7細(xì)胞中EGFR、CD147、MMP-9、MMP-2蛋白表達(dá) 丙泊酚組和丙泊酚+NC inhibitor組細(xì)胞中EGFR、CD147、MMP-9、MMP-2蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但均低于對照組(P<0.05)；丙泊酚+miR-133a inhibitor組細(xì)胞中EGFR、CD147、MMP-9、MMP-2蛋白表達(dá)與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但均高于丙泊酚組和丙泊酚+NC inhibitor組(P<0.05)。見圖2，表5。

圖2 4組MCF-7細(xì)胞中EGFR、CD147、MMP-9、MMP-2蛋白表達(dá)

表5 4組MCF-7細(xì)胞中EGFR、CD147、MMP-9、MMP-2蛋白表達(dá)

3 討論

腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲等惡性生物學(xué)行為是導(dǎo)致腫瘤患者死亡的重要因素[7]。探討麻醉藥物與腫瘤細(xì)胞行為的關(guān)系，不僅能夠為腫瘤手術(shù)中選擇合理的麻醉藥物以降低圍手術(shù)期風(fēng)險提供依據(jù)，也可能有助于改善腫瘤患者預(yù)后。本研究結(jié)果表明，丙泊酚作用于乳腺癌MCF-7細(xì)胞，具有抑制細(xì)胞增殖和侵襲的作用，且對MCF-7細(xì)胞增殖的抑制作用呈劑量依賴性。多項研究表明，丙泊酚具有抗腫瘤作用，但其抗腫瘤作用機(jī)制復(fù)雜，且在不同腫瘤中存在一定差異。Yang等[8]研究報道，丙泊酚通過上調(diào)miR-486表達(dá)抑制肺癌細(xì)胞生長并促進(jìn)其凋亡。Yu等[9]研究表明，丙泊酚通過調(diào)控miR-24/p27信號通路失活誘導(dǎo)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞凋亡。此外，Bai等研究表明，丙泊酚可通過下調(diào)H19抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的遷移和侵襲[10]。

miR-133a是腫瘤早期診斷、預(yù)后監(jiān)測的重要生物學(xué)指標(biāo)[11,12]。本研究結(jié)果，丙泊酚能夠上調(diào)乳腺癌MCF-7細(xì)胞中miR-133a的表達(dá)，而抑制miR-133a表達(dá)可逆轉(zhuǎn)丙泊酚對MCF-7細(xì)胞增殖和侵襲的抑制作用，說明其抑制MCF-7細(xì)胞增殖和侵襲的作用機(jī)制可能與上調(diào)miR-133a表達(dá)有關(guān)。miR-133a的抗腫瘤作用與其功能多樣的靶基因有關(guān)，Cui等[13]研究表明，過表達(dá)miR-133a可能通過靶向表皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor，EGFR)，抑制EGFR/Akt信號通路，進(jìn)而抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖，提示EGFR可能是miR-133a的靶向基因。EGFR具有絡(luò)氨酸激酶活性，在促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖中起關(guān)鍵作用[14]。杜璟等[15,16]研究表明，EGFR在乳腺癌中高表達(dá)，與乳腺癌生長和侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。體外研究證實，抑制EGFR信號通路可能是臨床干預(yù)治療乳腺癌的重要靶點[17]。本研究結(jié)果，丙泊酚處理后MCF-7細(xì)胞中EGFR蛋白表達(dá)降低，而抑制miR-133a后細(xì)胞中EGFR蛋白表達(dá)升高，說明丙泊酚上調(diào)MCF-7細(xì)胞中miR-133a表達(dá)靶向抑制EGFR，可能與丙泊酚抑制MCF-7細(xì)胞增殖和侵襲有關(guān)。CD147是細(xì)胞表面高度糖基化的跨膜蛋白，屬于免疫球蛋白家族，能夠刺激MMP-2和MMP-9產(chǎn)生，誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)降解，在腫瘤細(xì)胞侵襲中起關(guān)鍵作用[18,19]。本研究結(jié)果，丙泊酚組細(xì)胞中CD147、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)明顯升高，而抑制miR-133a表達(dá)后細(xì)胞中CD147、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)明顯降低，提示丙泊酚上調(diào)MCF-7細(xì)胞中miR-133a表達(dá)可能靶向抑制CD147、MMP-2、MMP-9表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞侵襲。

綜上所述，丙泊酚對乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖和侵襲具有抑制作用，且該作用呈劑量依賴性。其作用機(jī)制可能與上調(diào)miR-133a表達(dá)，進(jìn)而靶向抑制EGFR和CD147-MMPs信號途徑有關(guān)。本研究體外初步說明丙泊酚可通過上調(diào)miR-133a抑制MCF-7細(xì)胞增殖和侵襲，下一步可進(jìn)行動物模型實驗研究丙泊酚在體內(nèi)對乳腺癌的抑制作用，并探討其體內(nèi)最佳作用濃度，為臨床乳腺癌術(shù)中合適使用丙泊酚，減少圍術(shù)期風(fēng)險及術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移提供參考依據(jù)。