不同來(lái)源百合HPLC 指紋圖譜建立

劉湘丹 陳 婭 劉 霞周日寶裴 剛陳乃宏

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 湖南長(zhǎng)沙410208； 2.湘戶大宗道地藥材種質(zhì)資源及規(guī)范化種植重點(diǎn)研究室， 湖南長(zhǎng)沙410208； 3.湖南省中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)化及功能工程技術(shù)研究中心， 湖南長(zhǎng)沙410208； 4.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所， 北京100050）

百合始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其應(yīng)用歷史悠久，屬藥食同源品種［1］。2015 年版《中國(guó)藥典》 記載百合來(lái)源于百合科植物卷丹Lilium lancifoliumThunb.、百合Lilium browniiF.E.Brown var.viridulumBaker 或細(xì)葉百合Lilium pumilumDC.的干燥肉質(zhì)鱗葉［2］。其味甘性寒，歸心、肺經(jīng)，有養(yǎng)陰潤(rùn)肺、寧心安神的功效，主要用于治療肺虛久咳、勞嗽咳血、心煩失眠、情緒不能自主等病［2?3］。課題組在收集百合藥材過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，卷丹為藥用主流品種，市場(chǎng)售價(jià)相對(duì)便宜；百合為食用百合主流品種，售價(jià)較貴；細(xì)葉百合市場(chǎng)上基本不見(jiàn)流通；市場(chǎng)還存在非藥用品種入藥情況；食用百合除百合主流品種外，卷丹、蘭州百合亦食用。以上不同來(lái)源百合飲片性狀比較相似，無(wú)經(jīng)驗(yàn)人員無(wú)法準(zhǔn)確鑒別，2015 年版《中國(guó)藥典》 百合藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)依據(jù)僅為性狀薄層鑒別及水溶性浸出物含有量，無(wú)具體品種的鑒別方法，難以保障入藥的準(zhǔn)確性。基于此，本實(shí)驗(yàn)擬利用HPLC 法建立不同來(lái)源百合指紋圖譜并進(jìn)行補(bǔ)充研究，以期為中藥材百合的質(zhì)量控制、確保用藥準(zhǔn)確性及進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用百合資源提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；Agilent Technologies 1260 Inginity HPLC （美國(guó)Agilent公司）；BCD?452WDPF 冰箱（青島海爾服務(wù)有限公司）；Eco?S15 實(shí)驗(yàn)室純水系統(tǒng) （上海和泰儀器有限公司）；ME204E／02 電子分析天平［瑞士梅特勒?托利多儀器（上海） 有限公司］；中草藥粉碎機(jī)（天津市泰式特儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 王百合苷A 對(duì)照品（實(shí)驗(yàn)室自制，純度≥98%）。甲醇（分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；磷酸（分析純，長(zhǎng)沙分路口塑料化工廠）；乙腈（色譜純，德國(guó)默克公司）。有機(jī)針筒過(guò)濾器（0.22 μm，上海興亞進(jìn)化材料廠）。

課題組于2017 至2018 年共從產(chǎn)地收集36 批百合樣品（包括藥用百合、食用百合、百合藥材混偽品），經(jīng)湖南省藥檢所方石林教授、湖南中醫(yī)藥大學(xué)周日寶教授、劉塔斯教授、湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院張志國(guó)教授、湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)謝紅旗教授鑒定為百合科相關(guān)品種鱗葉的加工品，根據(jù)2018 年12 月3 日發(fā)布實(shí)施的中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)中藥材商品規(guī)格等級(jí)百合團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)（T／CACM 1021.21?2018）［4］將收集的百合藥材進(jìn)行分級(jí)，具體信息見(jiàn)表1。其中野生百合，為課題組野外采集，并于實(shí)驗(yàn)室加工，經(jīng)鑒定其為百合科植物百合Lilium browniiF.E.Brown var.viridulumBak?er。

表1 樣品信息

其中來(lái)源于植物卷丹L.lancifoliumThunb.的干燥肉質(zhì)鱗葉，按基原分類，習(xí)稱“卷丹百合”；來(lái)源于植物百合L.browniiF.E.Brown var.viridulumBaker 的干燥肉質(zhì)鱗葉，按基原分類，栽培品習(xí)稱“龍牙百合”，野生品習(xí)稱“野生百合”；來(lái)源于植物細(xì)葉百合L.pumilumDC.的干燥肉質(zhì)鱗葉，按基原分類，習(xí)稱“細(xì)葉百合”；來(lái)源于植物蘭州百合L.davidivar.unicdorcotton 的干燥肉質(zhì)鱗葉，按基原分類，習(xí)稱“蘭州百合”；來(lái)源于川百合變種的藥用百合混偽品因其開(kāi)黃花，習(xí)稱“金百合”。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 采用Supersil ODS?B 100 A 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A） -0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫，程序見(jiàn)表2；柱溫30 ℃；體積流量1.0 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)310 nm；進(jìn)樣量10 μL。

表2 梯度洗脫程序

2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取王百合苷A 對(duì)照品適量，用75%甲醇溶解制得質(zhì)量濃度為0.1 mg／mL 的王百合苷A對(duì)照品溶液，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，密封，低溫避光保存，備用。

2.3 供試品溶液制備 精密稱取百合樣品粉末（過(guò)3 號(hào)篩） 3 g，置帶塞錐形瓶中，加入75%甲醇溶液60 mL，稱定質(zhì)量，靜置2 h 后，室溫超聲30 min （500 W，40 kHz），待冷卻用75%甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，取上清液過(guò)0.22 μm 微孔濾膜，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取S1 號(hào)樣品，按“2.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄色譜圖。以王百合苷A 為參照峰，測(cè)得10 個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD 均小于0.71%，相對(duì)峰面積RSD 均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取S1 號(hào)樣品（6 份），每份精密稱取3 g，按“2.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，記錄色譜圖。以王百合苷A 為參照峰，測(cè)得10 個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD 均小于0.5%，相對(duì)峰面積RSD 均小于4%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取S1 號(hào)樣品3 g，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下，分別于0、2、4、6、8、10、12 h 進(jìn)樣，記錄色譜圖。以王百合苷A 為參照峰，測(cè)得10 個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD 均小于0.8%，相對(duì)峰面積RSD 均小于5%，表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 參照峰選擇 在各批卷丹百合樣品和各批龍牙百合色譜圖中王百合苷A 分離良好，峰形穩(wěn)定，峰面積較大且為所有樣品共有，所以確定王百合苷A 為參照峰（S）。

2.5 指紋圖譜建立

2.5.1 各來(lái)源百合指紋圖譜 取表1 中百合樣品，按“2.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，記錄色譜圖，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012） ” 對(duì)各來(lái)源樣品HPLC 色譜圖進(jìn)行多點(diǎn)校正，全譜峰匹配（時(shí)間寬度為0.10），用中位數(shù)法生成對(duì)照?qǐng)D譜R，計(jì)算相似度。通過(guò)軟件計(jì)算，20 批卷丹百合樣品，在檢測(cè)到的44 個(gè)色譜峰中，確定了10 個(gè)共有峰，占總峰面積的76.59%，20 批樣品與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度0.964～0.997 之間，表明卷丹百合樣品相似度良好。20 批卷丹百合色譜圖及指紋圖譜見(jiàn)圖1，卷丹百合對(duì)照指紋圖譜見(jiàn)圖2。以王百合苷A 為參照峰，卷丹百合樣品相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積分別見(jiàn)表3～4。

圖1 20 批卷丹百合HPLC 指紋圖譜

圖2 卷丹百合對(duì)照?qǐng)D譜

通過(guò)軟件計(jì)算，10 批龍牙百合樣品，在檢測(cè)到的11 個(gè)色譜峰中，確定了5 個(gè)共有峰，占總峰面積的86.84%，10批龍牙百合藥材與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度0.986～0.999，表明各來(lái)源龍牙百合樣品相似度良好。10 批龍牙百合色譜圖及指紋圖譜見(jiàn)圖3，龍牙百合對(duì)照?qǐng)D譜見(jiàn)圖4。以王百合苷A為參照峰，龍牙百合樣品的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積分別見(jiàn)表5～6。

野生百合色譜圖見(jiàn)圖5，較龍牙百合色譜峰更豐富。細(xì)葉百合色譜圖見(jiàn)圖6，較卷丹百合、龍牙百合有明顯區(qū)別。蘭州百合為食用百合之一，通過(guò)軟件計(jì)算，2 批蘭州百合在檢測(cè)到的22 個(gè)色譜峰中，確定了12 個(gè)共有峰，相似度分別為0.992、0.913，相似度良好，色譜圖見(jiàn)圖7。金百合色譜圖見(jiàn)圖8，較卷丹百合、龍牙百合有明顯區(qū)別。

2.5.2 各來(lái)源百合指紋圖譜比較 將卷丹百合、龍牙百合、細(xì)葉百合、蘭州百合、金百合、野生百合圖譜進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果見(jiàn)圖9。通過(guò)比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)不同來(lái)源品種間相似度均小于0.9，表明本研究建立的指紋圖譜條件可將以上品種進(jìn)行區(qū)分。

2.6 特征峰指認(rèn) 為進(jìn)一步確認(rèn)百合特征峰的化學(xué)信息，采用HPLC?ESI?MS 對(duì)卷丹百合樣品10 個(gè)共有峰、龍牙百合樣品5 個(gè)共有峰中的3 個(gè)色譜峰進(jìn)行指認(rèn)，通過(guò)查閱文獻(xiàn)數(shù)據(jù)及與對(duì)照品對(duì)照，分別鑒定為王百合苷D、王百合苷A、王百合苷E，結(jié)果見(jiàn)表7。

表3 20 批卷丹百合共有峰相對(duì)保留時(shí)間

表4 20 批卷丹百合共有峰的相對(duì)峰面積

圖3 10 批龍牙百合HPLC 指紋圖譜

圖4 龍牙百合對(duì)照?qǐng)D譜

表5 10 批龍牙百合共有峰相對(duì)保留時(shí)間

表6 10 批龍牙百合共有峰的相對(duì)峰面積

圖5 野生百合中王百合苷A HPLC 色譜圖

圖6 細(xì)葉百合中王百合苷A HPLC 色譜圖

圖7 2 批蘭州百合樣品HPLC 特征圖譜

圖8 金百合中王百合苷A HPLC 色譜圖

圖9 不同來(lái)源百合圖譜重疊圖

3 結(jié)論與討論

現(xiàn)代研究表明，藥用百合鱗莖中主要含有酚酸甘油酯、酚酸甘油苷、甾體皂苷、甾醇、黃酮、苯丙素、多糖類、生物堿及磷脂、無(wú)機(jī)鹽等，其中王百合苷A 為酚酸甘油苷類［5?10］。文獻(xiàn)研究也發(fā)現(xiàn)王百合苷A 具有抗氧化、抗腫瘤、抗增殖、免疫調(diào)節(jié)及雌激素活性等作用［11?15］，課題組前期HPLC 和HPLC?MS 預(yù)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，以上不同來(lái)源百合樣品中都含有王百合苷A，其響應(yīng)值高分離度好，相對(duì)百分含有量較高；課題組也從卷丹中分離得到王百合苷A，因此選王百合苷A 為參照峰。

卷丹百合為市場(chǎng)藥用百合的主要來(lái)源，本研究共收集到20 批樣品，未收到符合中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)發(fā)布的中藥材商品規(guī)格等級(jí)百合團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)（T／CACM 1021.21?2018） 的一等品；龍牙百合藥食皆用以食用為主，本研究?jī)H收集到10批樣品；細(xì)葉百合為《中國(guó)藥典》 中百合3 個(gè)來(lái)源之一，但課題組在藥材收集過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，其在市場(chǎng)基本不見(jiàn)流通，僅收集到一批樣品；蘭州百合為食用百合，作為研究對(duì)照收集了2 批樣品；金百合為川百合的變種，開(kāi)黃花，飲片與卷丹相似，微苦，藥材收集過(guò)程中發(fā)現(xiàn)其作百合入藥，為市場(chǎng)百合藥材混偽品，本研究收集到1 批樣品；還特從野外采集了2 批野生百合樣品進(jìn)行對(duì)照研究。

表7 百合特征峰質(zhì)譜數(shù)據(jù)

本研究對(duì)20 批卷丹百合樣品進(jìn)行了分析，有10 個(gè)共有峰，樣品間相似度均大于0.9，不同等級(jí)卷丹百合指紋圖譜無(wú)明顯差異；分析10 批龍牙百合樣品，有5 個(gè)共有峰，樣品間相似度均大于0.9，不同等級(jí)龍牙百合指紋圖譜亦無(wú)明顯差異；表明卷丹百合、龍牙百合都有穩(wěn)定的HPLC 指紋圖譜。本研究采集2 批野生百合、1 批細(xì)葉百合、2 批蘭州百合和1 批金百合進(jìn)行對(duì)比研究。以龍牙百合對(duì)照指紋圖譜為參照峰，與野生百合圖譜進(jìn)行比對(duì)，其相似度0.762～0.879，栽培百合樣品中的5 個(gè)共有峰都能與2 個(gè)野生百合匹配，但發(fā)現(xiàn)野生百合各共有峰對(duì)峰值明顯高，且峰更為豐富。對(duì)其他各來(lái)源百合色譜峰進(jìn)行比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，龍牙百合、野生百合、細(xì)葉百合、蘭州百合、金百合與卷丹百合對(duì)照指紋圖譜的相似度依次為0.653、0.593、0.366、0.566、0.568，表明可將卷丹百合與以上來(lái)源百合進(jìn)行區(qū)分。細(xì)葉百合、蘭州百合、金百合與龍牙百合指紋圖譜的相似度依次為0.470、0.731、0.767，表明可將龍牙百合與細(xì)葉百合、蘭州百合、金百合進(jìn)行區(qū)分。細(xì)葉百合與金百合比對(duì)相似度為0.404，蘭州百合與金百合比對(duì)相似度為0.640，細(xì)葉百合與蘭州百合比對(duì)相似度為0.410，不同來(lái)源品種間相似度均小于0.9。結(jié)果表明，本研究建立的方法可將卷丹百合、龍牙百合、細(xì)葉百合、蘭州百合、金百合進(jìn)行區(qū)分，以期為評(píng)價(jià)鑒別百合品種來(lái)源的研究提供參考。