小麥類胡蘿卜素合成途徑關鍵基因Lcye功能分析

翟勝男 郭 軍 劉 成 李豪圣 宋健民 劉愛峰 曹新有 程敦公 李法計 何中虎 夏先春,* 劉建軍,*

小麥類胡蘿卜素合成途徑關鍵基因功能分析

翟勝男1郭 軍1劉 成1李豪圣1宋健民1劉愛峰1曹新有1程敦公1李法計1何中虎2夏先春2,*劉建軍1,*

1山東省農業(yè)科學院作物研究所, 山東濟南 250100;2中國農業(yè)科學院作物科學研究所, 北京 100081

小麥籽粒黃色素是面粉及面制品黃度形成的主要原因, 其主要成分是類胡蘿卜素。ε-番茄紅素環(huán)化酶(LCYE)是小麥類胡蘿卜素生物合成途徑的關鍵酶, 前人對其研究多集中于QTL定位、基因克隆和分子標記開發(fā), 而基因功能和遺傳調控機制尚不明確。本研究利用TILLING技術篩選EMS誘變群體, 對功能及遺傳調控機制進行研究, 以期深入認識小麥籽粒黃色素含量形成的分子機制。在2491份M2代EMS誘變群體中共檢測到21個基因的點突變, 包含6個錯義突變, 2個同義突變和13個內含子突變,基因在該誘變群體中的突變頻率為1/266.1 kb。PARSENP軟件預測分析顯示, M090815 (C2202T)和M091648 (G3284A)兩個錯義突變可能嚴重影響蛋白質功能。MEME分析結果表明, M090815和M092230 (G2195A)突變位點位于基因保守結構域內。6個錯義突變植株與野生型雜交構建的F2代群體中, M090815突變位點顯著降低籽粒黃色素含量, 證實該位點對LCYE功能具有重要影響。qRT-PCR (quantitative real-time PCR)分析也顯示, M090815突變位點顯著降低基因表達水平, 且和基因表達降低趨勢相似, 而在花后14~28 d表現出補償效應。本研究不僅驗證基因功能, 也為面粉及其制品顏色性狀改良提供了理論依據和種質資源。

EMS; TILLING; 面粉顏色; 黃色素含量; 遺傳育種

面粉色澤是評價小麥粉品質的重要感官指標和市場指標。黃色素是小麥籽粒中最主要的天然色素, 是面粉及其制品黃度形成的主要原因。籽粒黃色素含量與面粉、面團黃度以及面包、面條顏色顯著相關, 相關系數分別高達0.8~0.9和0.69~0.76[1-4]。中式面制品, 如面條、饅頭、包子、餃子等對面粉的白度要求比較高。

類胡蘿卜素是構成黃色素的主要組分。類胡蘿卜素, 尤其是β-胡蘿卜素, 具有抗氧化、抗癌、維生素A原、預防眼睛老年性黃斑病變、延緩衰老、提高免疫力等重要生理保健功能。人類和動物不能自身合成類胡蘿卜素, 因此必須從外界攝取[5-6]。近年來, 隨著人們營養(yǎng)和保健意識的增強, 提高小麥籽粒類胡蘿卜素含量、培育亮黃色的面粉和面制品小麥品種, 逐漸成為新的育種目標。

植物類胡蘿卜素生物合成涉及一個復雜的基因調控網絡[6-7]。番茄紅素環(huán)化是類胡蘿卜素合成途徑的重要分支點。植物體內普遍存在ε-番茄紅素環(huán)化酶(lycopene epsilon cyclase, LCYE)和β-番茄紅素環(huán)化酶(lycopene beta cyclase, LCYB)兩種番茄紅素環(huán)化酶。Howitt等[8]克隆了普通小麥基因, 發(fā)現其與3B染色體上黃色素含量QTL位點共分離, 證實基因是影響籽粒黃色素含量的關鍵基因。董長海[9]克隆了普通小麥3B和3D染色體上的基因全長, 并針對B基因組序列差異開發(fā)了顯性標記。Crawford和Francki[10]克隆了基因, 并根據序列差異開發(fā)了功能標記。綜上所述, 目前對小麥基因研究局限于QTL定位、基因克隆和分子標記開發(fā), 其功能和遺傳調控機制尚不明確, 嚴重影響和制約了小麥面粉及其制品顏色性狀遺傳改良的育種進程。因此, 加強基因功能及其遺傳調控機制研究, 有助于進一步了解小麥籽粒黃色素含量形成的分子機制, 為培育符合市場需求的小麥新品種奠定理論基礎。

定向誘導基因組局部突變技術(targeting induced local lesions in genomes, TILLING)是一種將誘發(fā)產生高頻率點突變的化學誘變方法與PCR篩選和高通量檢測方法有效結合, 快速高效檢測目標區(qū)域點突變, 通過對其表型鑒定分析, 獲得基因功能的反向遺傳學研究方法[11-12]。與轉基因和分子標記輔助選擇等分子育種技術相比, TILLING技術還具有誘變育種穩(wěn)定快、僅改變少數目標性狀、無需進行繁瑣耗時的轉基因及雜交、回交等優(yōu)點, 是一種高效定向的分子育種技術[13-14]。隨著測序技術及作物基因組學的迅速發(fā)展, TILLING技術將在小麥基因功能分析、遺傳調控及重要農藝、品質性狀遺傳改良中發(fā)揮重要作用[15-17]。

本研究應用TILLING技術篩選甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate, EMS)誘變群體, 根據小麥基因序列設計特異引物, 通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術檢測突變位點, 獲得不同等位基因變異的突變植株, 對不同等位基因的遺傳群體與表型進行分析, 鑒定各突變位點對LCYE功能的影響, 揭示小麥類胡蘿卜素合成途徑關鍵基因的功能和遺傳調控機制, 為面制品顏色性狀遺傳改良提供理論基礎和種質資源。

1 材料與方法

1.1 EMS誘變群體構建

EMS誘變群體構建參照Slade等[18]方法。首先篩選一批純合穩(wěn)定、大小一致、籽粒飽滿的濟麥20和濟麥22小麥種子, 利用1.2%濃度的EMS進行誘變處理, 產生一系列的點突變; 將處理后的種子溫室種植獲得突變群體M1代; M1代種子大田種植獲得2491份M2代植株(1251份濟麥20, 1240份濟麥22)。

1.2 應用TILLING技術篩選EMS突變體庫

EMS突變庫篩選參照Till等[19]方法, 具體步驟如下: (1) 突變體DNA池構建: 應用CTAB法[20]分別提取每個M2突變體植株的基因組DNA, 將其存放于96孔板中。利用NanoDrop-2000超微量分光光度儀(thermo scientific)測定DNA的濃度和質量。按8個樣品一組將DNA進行等量混合, 構建8倍DNA混合池, 4℃保存?zhèn)溆谩?2)特異性引物設計: 基于小麥同源基因序列差異, 設計A、B和D基因組特異性引物。利用中國春缺體-四體材料及PCR產物測序方法, 進行引物基因組特異性驗證; 應用CODDLE (codons optimized to discover deleterious lesions, http://www.proweb.org/coddle/)軟件分析擴增區(qū)域是否對基因功能起重要作用。最終4對特異性引物, 用于突變體篩選(表1)。(3) PCR擴增與異源雙鏈生成: 以DNA混合池為模板進行PCR擴增, 反應體系: DNA 50 ng, PreMix 7.5 μL, 10 μmol L?1上、下游引物各1 μL, ddH2O補足至15 μL; 反應程序: 首先95℃變性5 min; 然后95℃變性30 s, 退火溫度從66℃開始, 每個循環(huán)降低0.3℃, 退火45 s, 72℃延伸1.5 min, 重復35個循環(huán); 72℃延伸10 min; 然后99℃ 10 min, 85℃ 1 min, 退火溫度從85℃開始, 每個循環(huán)降低0.5℃, 退火時間30 s, 共99個循環(huán); 最后16℃保溫備用。如果DNA混合池樣本目標片段中含有突變位點, 擴增產物經過反復變性、復性將形成野生型和突變體擴增片段的異源雙鏈(即含有錯配堿基)。(4) CEL I酶切: 用特異性識別并切割錯配堿基的核酸內切酶CEL I剪切異源雙鏈核酸分子。酶切反應體系: 10×消化緩沖液2 μL, CEL I 1 μL, 異源雙鏈DNA 15 μL, ddH2O補足至20 μL。45℃反應20 min, 隨后加入EDTA (0.25 mol L–1) 5 μL終止酶切反應。(5) 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測: 利用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術檢測CEL I酶切片段, 篩選獲得含有突變位點的陽性DNA混合池。對陽性DNA混合池中的每個樣本DNA逐一與野生型DNA進行等量混合, 重復上述步驟, 篩選獲得陽性突變體單株。(6) 突變樣本克隆測序: 對突變個體PCR產物進行克隆測序, 鑒定突變類型和位置。

表1 利用TILLING技術篩選Lcye突變體的引物信息

1.3 突變位點對蛋白功能影響預測

利用PARSESNP (project aligned related sequen ces and evaluate SNPs, http://www.proweb.org/pars esnp/)軟件分析突變體植株DNA序列的突變類型, 預測突變位點對LCYE功能是否造成影響。當PSSM值大于10和SIFT (sorting intolerant from tolerant)值小于0.05的氨基酸改變被認為可能對蛋白質功能造成重要影響[21-22]。

1.4 突變位點功能分析

為了減小其他突變背景影響, 將含有錯義突變位點的純合M3植株與野生型植株進行雜交, 構建F2代群體, 用于分析突變位點對基因表達水平及蛋白質功能的影響。F2群體于2014—2015年度種植于北京, 行長2 m, 行距25 cm, 每行20株, 每個F2群體種20行, 田間管理采用常規(guī)方法。

利用克隆測序的方法, 鑒定F2群體中每個株系基因型(純合突變型、雜合突變型和野生型)。每種基因型各選取10個生長發(fā)育進程一致的生物學重復, 記錄開花期, 分別采集花后7、14、21和28 d籽粒, 立即置于液氮中, ?80℃保存, 用于RNA提取和基因表達水平分析。單株收獲, 成熟籽粒?20℃保存, 用于黃色素含量測定。

利用實時定量PCR (quantitative real-time PCR, qRT-PCR)技術, 測定F2群體中純合突變型、雜合突變型和野生型植株籽粒不同發(fā)育時期(花后7、14、21和28 d)基因及其各同源基因表達量, 分析突變位點對基因表達水平的影響。具體步驟為: 應用RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒(TIANGEN Biotech, 中國北京)分別提取花后7、14、21和28 d籽?？俁NA, 純合突變型、雜合突變型和野生型植株各3個生物學重復; 利用PrimeScript RT Reagent試劑盒(TaKaRa Bio Inc., Otsu, Japan)將其反轉錄成cDNA, 置于–20℃保存?zhèn)溆? 基于小麥同源基因cDNA序列間的保守性和差異性, 設計基因的保守性引物和A、B、D基因組特異性引物(表2), 對其進行溶解曲線分析和qRT-PCR產物克隆測序, 驗證引物保守性和特異性, 普通小麥基因(AB181991)作為內參基因; 反應體系: LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green (Roche Applied Sciences, USA) 10 μL, 上下游引物0.5 μmol L?1, cDNA 50 ng, ddH2O補充至20 μL。反應程序: 95℃ 10 min; 95℃ 15 s, 60℃ 20 s和72℃ 20 s, 共40個循環(huán); 應用公式2?ΔΔCT計算目標基因相對表達量[23]。首先, 利用同一樣本中基因轉錄水平來校正目標基因相對表達水平; 其次將野生型植株花后28 d籽粒目標基因相對表達量設為1, 計算不同基因型植株的籽粒不同發(fā)育時期目標基因的相對表達量。每個樣本3次技術重復, 基因相對表達量用平均值±標準誤差(standard error, SE)表示。

表2 Lcye基因的qRT-PCR引物信息

測定F2群體中純合突變型、雜合突變型與野生型植株籽粒黃色素含量, 分析突變位點對LCYE蛋白功能的影響。每種基因型測定5個單株, 平均值作為該基因型的黃色素含量。籽粒黃色素含量的測定參照AACC方法14-50, 稍作改動。稱取1 g全麥粉, 用水飽和正丁醇溶液(5∶1)振蕩提取1 h; 2823′離心10 min。應用分光光度計測定上清液在436.5 nm處吸光值, 計算黃色素含量。每個樣本3次技術重復, 黃色素含量用平均值±SE表示。

1.5 LCYE功能結構域預測

利用NCBI (national center for biotechnology information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數據庫, 獲得目前已知的27個物種基因的cDNA序列(附表1), 利用MEME Suite 5.1.0 (http://meme-suite. org/)預測LCYE功能結構域, 分析各突變位點在結構域中的分布情況。

1.6 統(tǒng)計分析

應用Student’s檢驗對F2群體中純合突變型、雜合突變型和野生型植株籽?；虮磉_差異和黃色素含量進行顯著性分析。基因在EMS誘變群體中的突變密度=點突變數/檢測總堿基數。

2 結果與分析

2.1 EMS突變體庫篩選

應用TILLING技術, 在2491份M2代EMS誘變群體中共檢測到21個基因的突變植株(表3)。采用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術分離CEL I酶切產物, 擴增片段150 bp內的錯配超出檢測范圍, 將無法被檢測到, 因此推測基因在該EMS誘變群體中的突變密度為1/266.1 kb。

突變體克隆測序和序列分析顯示, 核苷酸從C到T的突變頻率為57.1%, G到A的突變頻率為38.1%, 還檢測到1個T到C的特異突變位點(表3)。根據突變位置分類, 8個位于外顯子區(qū), 13個分布于內含子區(qū)(圖1)。外顯子區(qū)域的點突變又分為6個錯義突變和2個同義突變(表3)。

2.2 突變位點對蛋白質功能影響預測

PARSESNP軟件分析結果顯示, 錯義突變體M090815 (C2202T)和M091648 (G3284A)的PSSM值分別為26.9和27.7, SIFT值均為0, 推測這些突變位點可能對LCYE蛋白功能產生嚴重影響(表4)。

表3 利用TILLING技術篩選獲得Lcye突變體信息

Hom: 純合突變型; Het: 雜合突變型。Hom: homozygous mutants; Het: heterozygous mutants.

圖1 Lcye突變位點分布圖

黃色箭頭代表外顯子; 連線代表內含子。

Exons are represented by yellow arrows and introns by connecting lines.

表4 突變位點對蛋白功能影響嚴重度預測

2.3 突變體Lcye基因表達和黃色素含量分析

將6個純合錯義突變體與野生型植株雜交, 構建F2代群體, 分析突變位點對基因表達水平和籽粒黃色素含量的影響。結果表明, 6個F2群體中, 僅M090815 (C2202T)突變位點顯著降低了基因表達和黃色素含量(圖2和圖3), 表明該突變位點對LCYE蛋白功能產生重要影響。

突變體M090815構建的F2群體中, 不同基因型植株籽粒及其同源基因表達水平如圖2所示?；ê?~21 d, 純合突變型植株籽?；蚩偙磉_量降低至野生型的59.0%~83.0%, 雜合型降低至71.5%~91.1%, 花后28 d各基因型表達差異不顯著。除了純合突變型在花后28 d表達量顯著高于野生型外, 花后各時期和基因表達顯示相似的下降趨勢, 純合突變型植株表達量降低至野生型的70.0%~78.7%和55.5%~92.0%,雜合型降低至83.1%~90.0%和75.2%~90.0%。在花后7 d, 各基因型表達量差異不顯著,花后14~28 d, 表現出補償效應, 純合突變型比野生型表達量高33.4%~70.0%, 雜合型高0.7%~ 48.1%。相應地, 在突變體M090815構建的F2群體中, 純合突變型植株成熟籽粒黃色素含量顯著低于雜合突變型和野生型植株(圖3, 1.63 vs. 1.90和2.02 μg g?1)。

圖2 突變體M090815的F2群體中不同基因型植株籽粒Lcye及其同源基因的相對表達量

*和**分別代表0.05和0.01顯著水平的差異。Hom: 純合突變型; Het: 雜合突變型; WT: 野生型。

*< 0.05, **< 0.01. Hom: homozygous mutants; Het: heterozygous mutants; WT: wild-type genotypes.

圖3 突變體M090815的F2群體中不同基因型植株籽粒黃色素含量

Fig. 3 Yellow pigment content of different genotypes in F2populations derived from homozygous M090815 mutant crossed with wild-type plant

*代表0.05顯著水平的差異。Hom: 純合突變型; Het: 雜合突變型; WT: 野生型。

*< 0.05. Hom: homozygous mutants; Het: heterozygous mutants; WT: wild-type genotypes.

2.4 LCYE功能結構域預測

基于擬南芥()、水稻()、大麥()等27個物種已知的基因cDNA序列(附表1), 利用MEME Suite 5.1.0預測LCYE功能結構域, 共檢測到3個結構域(圖4)。6個錯義突變中, M090815 (C2202T)和M092230 (G2195A)突變位點恰好位于結構域1內, 且M090815突變位點在27個物種中非常保守, M092230突變位點存在G、A和U三種堿基變異。

圖4 Lcye功能結構域預測

3 討論

3.1 LCYE調控小麥籽粒類胡蘿卜素合成

小麥籽粒類胡蘿卜素影響面制品營養(yǎng)品質和表觀色澤。番茄紅素環(huán)化是類胡蘿卜素合成途徑中一個重要的分節(jié)點, 番茄紅素在LCYB催化下, 經β-β途徑生成β-胡蘿卜素、玉米黃質、花藥黃質和堇菜黃質等葉黃素類物質; 在LCYE和LCYB共同催化下,經β-ε途徑生成α-胡蘿卜素和葉黃體素。類胡蘿卜素含量和組成在小麥籽粒發(fā)育過程中是動態(tài)變化的, 具有復雜的遺傳調控網絡[8]。β-β途徑在籽粒發(fā)育早期占有較高表達水平, 隨著籽粒生長發(fā)育表達量和所占比例逐漸下降, 成熟籽粒幾乎檢測不到玉米黃質、環(huán)氧玉米黃質和堇菜黃質等類胡蘿卜素。相反, β-ε途徑在整個籽粒發(fā)育過程中穩(wěn)定表達, 葉黃體素成為構成成熟籽粒類胡蘿卜素的主要成分[8]。

通過調節(jié)LCYB和LCYE的相對活性和相對含量可以決定番茄紅素轉化為α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素的比例。在番茄突變體中,轉錄水平提高, 果實內δ-胡蘿卜素含量大量增多; 而在番茄突變體中,過表達, 果實中累積大量的β-胡蘿卜素[24]。對比兩種突變體的差異進一步證實番茄果實中類胡蘿卜素的積累主要是相關基因在轉錄水平上差異表達的結果[25]。

Richaud等[26]應用TILLING技術, 篩選硬粒小麥突變體, W437*()突變位點顯著增加突變體葉片中β-胡蘿卜素和類胡蘿卜素的含量, 但對籽粒中類胡蘿卜素含量無顯著影響。本研究利用TILLING技術篩選普通小麥EMS突變體庫, 獲得基因一系列等位變異, 研究其對基因表達和籽粒黃色素含量的影響, 為基因功能研究和面制品顏色性狀改良奠定理論基礎和提供重要種質資源。

3.2 Lcye突變體篩選

TILLING技術有效結合了高頻率點突變與現代分析檢測技術, 僅需要較小的突變群體便可快速有效地篩選到一系列目標基因點突變, 逐漸成為植物功能基因組學、作物遺傳育種以及自然資源遺傳多樣性評估等研究的重要手段[27-28]。目前, 該技術已廣泛應用于水稻[29]、玉米[30]、小麥[31-32]、大麥[33]、高粱[34]等20多種作物。研究表明小麥基因突變頻率遠遠高于擬南芥、水稻和玉米等植物, TILLING技術在小麥等麥類作物中的應用潛力更為巨大、前景更為光明。

對于小麥等基因組復雜的多倍體物種, 基因多拷貝是限制TILLING技術高效應用的一個瓶頸。設計特異性引物至關重要, 否則會影響檢測效率。小麥基因A、B和D同源基因間序列相似性非常高(89.1%~97.0%), 設計特異性引物非常困難。結合CODDLE程序給出的EMS誘導植株產生有害突變的可能范圍, 最終篩選到4對引物用于突變體檢測(表1)。

酶切產物的檢測方法有多種, 一般采用高效液相色譜技術、聚丙烯酰胺凝膠電泳、瓊脂糖凝膠電泳以及雙色紅外熒光檢測技術[35-38]。本研究采用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測技術, 既不使用熒光標記引物, 又不使用昂貴的變性凝膠電泳成像系統(tǒng), 有效地簡化了實驗流程, 降低了實驗成本, 在一定程度上擴大TILLING的應用范圍和工作效率。共篩選到21個突變位點, 推測在EMS誘變群體中的突變頻率為(1/266.1 kb), 遠低于Uauy等[37]應用非變性聚丙烯酰胺凝膠技術檢測到的六倍體小麥突變頻率(1/38 kb)。這可能是由于基因目標區(qū)域G/C含量不同或者非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測技術對8樣本DNA混池的檢測靈敏度較低所致。

3.3 影響LCYE功能的重要調控位點

基于擬南芥、水稻、大麥等27個物種的cDNA序列, 利用MEME預測LCYE功能結構域, 結果顯示M090815 (C2202T)和M092230 (G2195A)突變位點恰好位于結構域1內(圖4)。M092230 (G2195A)突變位點在自然界物種進化中存在G、A和U三種堿基變異, 因此推測G到A核苷酸突變對LCYE功能未產生影響。而M090815 (C2202T)突變位點在27個物種中高度保守, 推測該位點對LCYE功能具有重要影響。PARSESNP軟件預測顯示M090815 (C2202T)和M091648 (G3284A)突變位點可能對蛋白功能產生嚴重影響(表4), 進一步表明M090815 (C2202T)突變位點對LCYE蛋白功能的重要性。M090815構建的F2群體中, 與野生型植株相比, 純合突變型植株籽粒黃色素含量顯著下降(圖3), 證實M090815 (C2202T)突變位點對LCYE功能具有重要影響。然而在M091648構建的F2群體中純合突變型與野生型植株相比籽粒黃色素含量差異并不顯著。這種不一致性可能是由于PARSESN軟件是基于序列同源性及氨基酸物理特性進行突變位點對蛋白功能影響嚴重度的預測, 而有些位點可能并不參與蛋白功能調控[21-22]。

對M090815構建的F2群體進行及其同源基因表達水平分析顯示, 與野生型植株相比, 純合突變型植株籽?；蚩偙磉_量顯著降低(圖2)。籽粒發(fā)育各時期, 除在純合突變型植株中表達水平在花后28 d高于野生型外,和基因表達水平均呈下降趨勢。而在花后7 d, 各基因型植株表達差異不顯著, 花后14~28 d, 表現出補償效應。推測和基因表達受協(xié)同調控, 而表達調控機制可能與之不同。序列分析發(fā)現,與和的序列相似性分別為89.1%和89.2%, 而和基因序列相似性高達97.0%, 為上述推測提供間接支持。鑒于上述結果只通過一個F2群體獲得, 因此仍需進一步研究。

3.4 分子育種

種質資源缺乏成為小麥面粉及其制品顏色改良的“瓶頸”, 嚴重影響我國小麥品種面制品顏色性狀的遺傳改良。EMS誘變可以創(chuàng)造大量的等位變異, 且在后代穩(wěn)定遺傳, 由于不涉及轉基因操作, 獲得的優(yōu)異突變體可以直接用于育種實踐[39-40]。在我國, 面制品以蒸煮為主, 細膩潔白的面粉備受消費者青睞。本研究采用TILLING技術篩選獲得的顯著降低籽粒黃色素含量的M090815突變體, 該突變體農藝性狀與野生型濟麥20無顯著差異, 可作為面粉顏色遺傳改良的重要種質資源。此外, 濟麥20為高產優(yōu)質面包、面條兼用型強筋小麥; 濟麥22為超高產穩(wěn)產廣適多抗小麥品種, 兩個均為大面積推廣種植的優(yōu)良品種, 綜合性狀良好。以上述兩個品種作誘變基礎材料創(chuàng)制的優(yōu)異突變體, 更適宜于用作雜交親本, 以期快速培育出高產優(yōu)質小麥新品種。

競爭性等位基因特異性PCR (Kompetitive Allele Specific PCR, KASP)是基于引物末端堿基的特異性匹配對SNP進行雙等位基因分型技術, 具有高通量、準確性高、穩(wěn)定性好和檢測成本低等優(yōu)點, 是目前廣泛使用的SNP分型方法[41-42]。因此, 在后續(xù)工作中針對M090815突變體基因C2202T的SNP變異位點開發(fā)KSAP標記, 以期為利用M090815突變體對面制品顏色性狀進行高效、可靠的分子標記輔助育種提供技術支撐。

4 結論

本研究以濟麥20和濟麥22的EMS誘變群體為材料, 利用TILLING技術篩選小麥類胡蘿卜素合成關鍵基因的突變體, 共獲得21個基因的點突變。生物信息學分析、基因表達水平和黃色素含量測定均顯示, M090815 (C2202T)突變位點對LCYE蛋白功能具有重要影響。M090815突變位點顯著降低基因表達水平, 且和基因表達降低趨勢相似, 而在花后14~28 d表現出補償效應。本研究獲得的突變體不僅為開展基因功能研究提供了良好的試驗材料, 也為面制品顏色性狀遺傳改良提供了豐富的種質資源。

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附表1 27個物種基因cDNA序列信息

Supplementary table 1 Information of cDNA sequences of Lcye genes in 27 plant species

GenBank: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/.

Functional analysis ofgene involved in the carotenoid synthesis in common wheat

ZHAI Sheng-Nan1, GUO Jun1, LIU Cheng1, LI Hao-Sheng1, SONG Jian-Min1, LIU Ai-Feng1, CAO Xin-You1,CHENG Dun-Gong1, LI Fa-Ji1, HE Zhong-Hu2, XIA Xian-Chun2,*, and LIU Jian-Jun1,*

1Crop Research Institute, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250100, Shandong, China;2Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China

Yellow pigment in wheat grains, mostly composed of carotenoids, is a main factor for the yellowness of flour and its end-used products. Lycopene epsilon cyclase (LCYE) is a key enzyme for the carotenoid biosynthesis pathway in wheat. Previous studies ofgene mainly focused on QTL mapping, gene cloning, and molecular marker development, but its function and genetic regulatory mechanisms remained unclear. In the present study, in order to further understanding the molecular mechanism of yellow pigment formation in wheat grains, the function and genetic regulation ofwere studied by TILLING to screen the EMS-mutagenised population. A total of 21mutations including six missense mutations, two synonymous mutations and 13 intron mutations were detected consisted from 2491 M2EMS-mutagenised population. The mutation frequency ofin the population was 1/266.1 kb. Two missense mutations (M090815 and M091648) were predicted to have severe effects on LCYE protein function based on PARSENP software. MEME analysis showed that the mutation sites of M090815 and M092230 were located on the conserved domain ofgene. In F2populations crossing by six missense mutants and the wild type, C2202T mutation in M090815 significantly reduced yellow pigment content in grains, indicating the mutation played an important effect on LCYE function. The quantitative real-time PCR (qRT-PCR) results also showed that the expression level ofgene were significantly reduced, and the decrease trend ofandexpression level was similar during different seed developmental stages, while the expression level ofexhibited a compensation effect at 14–28 days post anthesis. This study identifiedgene function, and provided germplasms and a theoretical basis for the improvement of flour color traits and end-used products.

EMS; TILLING; flour color; yellow pigment content; genetics and breeding

10.3724/SP.J.1006.2020.01013

本研究由國家自然科學基金項目(31701420), 山東省農業(yè)科學院農業(yè)科技創(chuàng)新工程(CXGC2018E01), 中國科協(xié)青年人才托舉工程(2017QNRC001)和山東省農業(yè)良種工程項目(2019LGC001)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31701420), the Agricultural Scientific and Technological Innovation Project of Shandong Academy of Agricultural Sciences (CXGC2018E01), the Young Elite Scientists Sponsorship Program by CAST (2017QNRC001), and the Agricultural Variety Improvement Project of Shandong Province (2019LGC001).

夏先春, E-mail: xiaxianchun@caas.cn, Tel: 010-82108610; 劉建軍, E-mail: ljjsaas@163.com, Tel: 0531-66659561

E-mail: zsn19870322@163.com, Tel: 0531-66659561

2020-02-18;

2020-06-02;

2020-06-12.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20200612.1151.004.html