茶樹己糖激酶基因CsHXK2的啟動(dòng)子克隆及表達(dá)特性分析

李娜娜 劉 瑩,2 張豪杰 王 璐 郝心愿 張偉富 王玉春 熊 飛,3 楊亞軍,* 王新超,*

研究簡(jiǎn)報(bào)

茶樹己糖激酶基因的啟動(dòng)子克隆及表達(dá)特性分析

李娜娜1劉 瑩1,2張豪杰1王 璐1郝心愿1張偉富1王玉春1熊 飛1,3楊亞軍1,*王新超1,*

1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所 / 國(guó)家茶樹改良中心 / 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部茶樹生物學(xué)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 浙江杭州 310008;2西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院, 陜西楊凌 712100;3南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院, 江蘇南京 210095

植物己糖激酶是雙功能蛋白, 具有磷酸化己糖和介導(dǎo)糖信號(hào)的關(guān)鍵性作用。前期研究中, 我們從茶樹中克隆獲得4個(gè)己糖激酶基因, 其中基因編碼492個(gè)氨基酸殘基, 與擬南芥、番茄歸為Type A類HXKs。利用RT-PCR技術(shù), 克隆獲得長(zhǎng)度為2029 bp的基因啟動(dòng)子?；蚩赡苁艿焦庹?、低溫、病原菌、糖和多種激素等信號(hào)的調(diào)控, 且可能特異性表達(dá)于葉、花、種子、根系、腋芽等組織。CsHXK2蛋白定位于葉綠體內(nèi)。酵母突變體功能互補(bǔ)試驗(yàn)表明, 去除葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)肽的CsHXK2成熟蛋白具有葡萄糖和果糖磷酸化活性。茶樹組織特異性表達(dá)分析顯示,基因在根和莖中表達(dá)量最高, 而在老葉中表達(dá)量最低?；虻谋磉_(dá)受低溫脅迫而顯著下調(diào), 經(jīng)炭疽菌侵染的茶樹葉片內(nèi)基因的表達(dá)也受到顯著抑制, 而外源赤霉素(GA3)處理的茶樹葉片內(nèi)基因表達(dá)顯著上調(diào)。本研究結(jié)果表明,基因在茶樹的生長(zhǎng)發(fā)育過程和逆境脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

茶樹; 己糖激酶; 啟動(dòng)子; 亞細(xì)胞定位; 表達(dá)調(diào)控

植物己糖激酶HXK (hexokinase, EC: 2.7.1.1)是兼職雙功能蛋白。源庫組織內(nèi), 由淀粉和蔗糖產(chǎn)生的葡萄糖和果糖, 經(jīng)HXK磷酸化形成葡萄糖-6-磷酸和果糖-6-磷酸, 進(jìn)而參與糖酵解、呼吸作用、分解與合成等代謝過程, 為植物的生理活動(dòng)提供能量和中間代謝產(chǎn)物; 此外, HXK在植物糖信號(hào)感知中具有重要作用[1-2], 其作為糖傳感蛋白, 參與糖信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo), 感知脅迫、光照、激素和養(yǎng)分等條件, 進(jìn)而調(diào)控植株的基因表達(dá)與生長(zhǎng)發(fā)育[3]。

Dai等[4]利用酵母三重突變體(), 通過功能互補(bǔ)策略, 首次分離獲得植物擬南芥基因。隨后, 玉米、番茄、水稻、葡萄、馬鈴薯、煙草、木薯、油菜、梨、麻風(fēng)樹等多種植物的基因相繼被分離克隆[5-9]。在雙子葉和單子葉植物中均以多基因家族形式存在, 擬南芥有6個(gè)[10], 煙草有9個(gè)[11], 木薯有7個(gè)[6], 水稻有10個(gè)[12]。根據(jù)N-末端氨基酸序列的保守性和定位信號(hào)肽的預(yù)測(cè)結(jié)果, 植物中的HXK蛋白可分為2種類型, 即含有葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的type A類和具有膜錨定區(qū)域的type B類[13-14]。依據(jù)HXK是否具有己糖磷酸化功能, HXK蛋白劃分為具有磷酸化活性的HXK和缺乏磷酸化活性的HXKL(HXK-like) 2類。如AtHXK1-3蛋白屬催化活躍的HXK類, AtHXKL1-3蛋白和NtHXKL1蛋白屬催化失活的HXKL類[10-11]。

目前, 對(duì)植物己糖激酶的研究主要集中于基因在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中的作用, 關(guān)于其在抗逆脅迫方面的研究則相對(duì)較少。組織內(nèi)超表達(dá)擬南芥基因, 植株表現(xiàn)出生長(zhǎng)抑制、葉綠素含量減少、光合作用減弱、可溶性固形物和淀粉含量降低、葉片加速衰老以及光合作用相關(guān)基因和表達(dá)下調(diào)等現(xiàn)象[15-16]。利用擬南芥葡萄糖非敏感突變體()研究基因的生理功能[17], 缺乏HXK1葡萄糖催化功能的突變體仍具有多種信號(hào)功能, 可調(diào)控光合作用基因和表達(dá)、細(xì)胞增殖、根葉生長(zhǎng)、開花和衰老等,突變體表現(xiàn)出對(duì)生長(zhǎng)素(IAA)不敏感而對(duì)細(xì)胞分裂素2IP超敏感, 表明植物利用HXK為葡萄糖感受體, 使得養(yǎng)分、光照和激素信號(hào)網(wǎng)絡(luò)相互關(guān)聯(lián), 從而調(diào)控植物的生長(zhǎng)與發(fā)育。通過RNAi技術(shù)抑制基因在油菜籽苗內(nèi)的表達(dá), 植株具有生長(zhǎng)遲緩、矮化、葉片卷曲特征, 表明參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育過程[7]。脅迫過程中,、和基因能響應(yīng)甲基紫精和病原體侵染誘導(dǎo)的氧化脅迫, 高水平的HXK能增強(qiáng)對(duì)氧化脅迫的抵抗力[18];和基因能在低溫、高鹽處理下表達(dá)上調(diào)[14]; 麻風(fēng)樹、和基因在葉片內(nèi)同樣能響應(yīng)低溫而誘導(dǎo)表達(dá)[9]; 油菜、和基因能響應(yīng)核盤菌在抗性品種內(nèi)的侵染而表達(dá)顯著上調(diào)[7]。

茶樹[(L.) O. Kuntze]是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)葉用型作物, 在其生長(zhǎng)過程中頻受低溫、干旱、高鹽、病原菌等脅迫。因此, 挖掘茶樹重要抗性基因、闡明茶樹抗逆分子機(jī)制、選育強(qiáng)抗逆茶樹品種, 是減少環(huán)境脅迫造成茶產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)損失的重要舉措?；诨蛟跀M南芥等植物中的重要作用, 本研究開展了茶樹基因的分析研究, 以期獲得基因在茶樹生長(zhǎng)發(fā)育及抵御脅迫過程中的生理功能。本課題組前期已從茶樹‘龍井43’組織內(nèi)克隆獲得4個(gè)己糖激酶基因~?；?NCBI登錄號(hào)為KX159478)的開放閱讀框(open reading frame, ORF)長(zhǎng)度為1479 bp, 編碼492個(gè)氨基酸; CsHXK2蛋白含有葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)肽而不具備跨膜螺旋結(jié)構(gòu), 且具有保守的ATP結(jié)合和糖結(jié)合區(qū)域, 屬于type A類和磷酸化功能活躍的HXK類[19]。本研究進(jìn)而對(duì)基因啟動(dòng)子進(jìn)行克隆, 并深入分析該段啟動(dòng)子的順式作用元件構(gòu)成, 探明該編碼蛋白的亞細(xì)胞作用位點(diǎn)以及己糖磷酸化活性,并檢測(cè)該基因在茶樹不同組織器官內(nèi)以及低溫、炭疽菌、赤霉素處理下的表達(dá)變化。以期為闡明基因在茶樹中的生理功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

茶樹苗栽培于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所試驗(yàn)地(30.18°N, 120.09°E)。室內(nèi)赤霉素、低溫處理以及不同組織器官取樣的茶苗為同一批盆栽的‘龍井43’, 即于2015年移栽入花盆內(nèi)的一年生茶苗。2016年, 待盆栽苗在自然條件下新梢萌展至一芽二葉, 將茶苗移至人工氣候室內(nèi)適應(yīng)性培養(yǎng)14 d [14 h光照/10 h黑暗; (24 ± 0.5)℃; 相對(duì)濕度為75%], 把配置好的濃度為50 μmol L-1的GA3溶液均勻噴施至新梢蓬面, 同時(shí)以噴施ddH2O作為對(duì)照處理, 采摘處理0、1、2、3、5 d的一芽二葉, 用于基因表達(dá)分析。2017年, 待盆栽苗在自然環(huán)境下新梢萌展至一芽三葉, 將茶苗移至人工氣候室內(nèi)適應(yīng)性生長(zhǎng)7 d [14 h光照/10 h黑暗; (25 ± 0.5)℃; 相對(duì)濕度為75%], 隨后將溫度降至4℃, 低溫處理8 d, 再將溫度恢復(fù)至25℃生長(zhǎng)2 d, 采摘低溫和常溫恢復(fù)階段的一芽三/四葉, 用于基因表達(dá)分析。2018年4月, 采集盆栽苗頂芽、第一葉、第二葉、第三葉、老葉、莖和根, 11月采集頂芽、腋芽、花蕾、盛花、老葉、莖和根, 用于基因啟動(dòng)子克隆和組織特異性表達(dá)檢測(cè)。

室內(nèi)炭疽菌接種的材料為2013年移栽入花盆內(nèi)的一年生‘龍井43’茶苗。2018年, 待盆栽苗新梢萌展至一芽二葉, 采集離體枝條做針刺葉片有傷處理, 將濃度為1×107個(gè) mL-1的茶樹炭疽菌()孢子懸浮液均勻噴施至供試枝條, 并以噴施無菌ddH2O作為對(duì)照, 隨后保濕培養(yǎng)于光照培養(yǎng)箱內(nèi)[12 h光照/12 h黑暗; (25 ± 0.4)℃], 處理0、12和24 h后取樣, 用于基因表達(dá)檢測(cè)。2017年11月至2018年3月, 每1個(gè)月左右, 于上午9: 00—10: 00采集成齡茶樹品種‘龍井43’、‘大面白’、‘浙農(nóng)12’、‘浙農(nóng)113’的健康成熟葉片(第二、三、四葉), 用于基因表達(dá)檢測(cè)。以上試驗(yàn)均設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。所有采集的樣品立即用液氮速凍, 置于-80°C保存待用。

1.2 基因組DNA、總RNA的提取及cDNA的合成

使用植物基因組DNA提取試劑盒(DP305, 北京天根生化科技有限公司)提取茶樹組織DNA, 使用RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(DP441, 北京天根生化科技有限公司)提取總RNA。利用分光光度計(jì)NanoDrop 2000C (Thermo Scientific, 美國(guó))檢測(cè)DNA和RNA的濃度和純度, 并分別用1.0%和1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA和RNA的完整性。隨后, 使用PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(TaKaRa, 中國(guó)), 取1 μg總RNA為模板合成cDNA第1鏈。

1.3 CsHXK2基因啟動(dòng)子克隆及生物信息學(xué)分析

根據(jù)已公布的茶樹基因組信息[20], 查找獲得基因上游啟動(dòng)子模板序列, 并設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物(表1)。以‘龍井43’組織DNA為模板, 使用高保真酶PrimeSTAR HS DNA Polymerase (TaKaRa, 中國(guó))進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、目的條帶回收純化、連接至PMD18-T載體、轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞后, 取適量轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂板于LB+氨芐青霉素(Amp)的固體培養(yǎng)基, 隨機(jī)挑選陽性單克隆送測(cè)序, 獲得目的啟動(dòng)子序列。在New PLACE數(shù)據(jù)庫(A Database of Plant Cis-acting Regulatory DNA Elements; https://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/?action=newplace)[21]預(yù)測(cè)分析啟動(dòng)子序列所含的順式作用元件。

表1 引物信息

ORF: 開放閱讀框; cTP: 葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)肽。

ORF: open reading frame; cTP: chloroplast transit peptide.

1.4 CsHXK2基因系列載體構(gòu)建

以‘龍井43’組織cDNA為模板, 表1對(duì)應(yīng)序列為載體構(gòu)建引物, 利用高保真酶PrimeSTAR HS DNA Polymerase (TaKaRa, 中國(guó))進(jìn)行qRT-PCR, 擴(kuò)增片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后切割、回收, 連接至-Blunt Zero中間載體(CB501, Transgen, 中國(guó)), 連接反應(yīng)詳見說明書。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α, 菌液涂板于LB+卡那霉素(Kan)的固體培養(yǎng)基上, 篩選陽性單克隆菌液送測(cè)序。

使用相對(duì)應(yīng)的限制性內(nèi)切酶(I和H I,I和I,I和9 I; Thermo scientific, 美國(guó))對(duì)中間連接載體CsHXK2::-Blunt Zero、CsHXK2-cTP::- Blunt Zero和終載體35S::sGFP、pDR196進(jìn)行雙酶切, 反應(yīng)體系詳見說明書。酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳, 切割、回收目的片段。使用T4 DNA連接酶(M0202, New England Biolabs, 美國(guó))將目的片段與終載體骨架按照3∶1摩爾比進(jìn)行連接反應(yīng), 反應(yīng)體系詳見說明書。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α, 菌液涂板于LB+Kan/Amp的固體培養(yǎng)基上, 鑒定陽性單克隆菌液并送測(cè)序。最后, 提取正確的終載體質(zhì)粒, 即::::、::::、::和::。

1.5 CsHXK2蛋白亞細(xì)胞定位

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草瞬時(shí)表達(dá)方法。用凍融法將表達(dá)載體::::、::::以及空載體35S::sGFP轉(zhuǎn)化至感受態(tài)農(nóng)桿菌GV3101; 然后將攜帶目的質(zhì)粒的農(nóng)桿菌在10 mL LB+Kan+利福平(Rif)的液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)(28℃和220′), 使OD600=1.0~1.2; 取適量菌液, 室溫5000′離心5 min后棄上清; 用轉(zhuǎn)化緩沖液(50 mmol L-1MES, 2 mmol L-1Na3PO4, 0.5%葡萄糖, 100 μmol L-1乙酰丁香酮)重懸, 使OD600=0.8~1.0; 用無菌針管將懸浮液注射至煙草葉片, 正常條件下培養(yǎng)48 h后, 用激光共聚焦顯微鏡(Zeiss, 德國(guó))觀察并照相。

1.6 CsHXK2蛋白酵母功能互補(bǔ)驗(yàn)證

采用化學(xué)轉(zhuǎn)化法將載體::、::以及空載體pDR196轉(zhuǎn)化至新鮮制備的感受態(tài)酵母突變體菌株YSH7.4-3C(己糖激酶//三重缺失)[22]。隨后, 將含有重組質(zhì)粒和空載體質(zhì)粒的酵母分別稀釋至OD600=0.2、OD600=0.04、OD600=0.008和OD600=0.0016, 然后點(diǎn)板生長(zhǎng)于含有不同碳源的SD/-Ura選擇性培養(yǎng)基上(0.67% yeast nitrogen base, 0.077%-Ura DO Supplement, 2%瓊脂, 2% ddH2O/2%半乳糖/2%葡萄糖/2%果糖)[12]。置于30℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)暗培養(yǎng)4 d后觀察、記錄并照相。

1.7 CsHXK2基因表達(dá)分析

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(qRT-PCR)檢測(cè)在茶樹不同組織器官內(nèi)和不同處理下的表達(dá)情況?；诨蛐蛄衃19], 在NCBI的Primer-BLAST網(wǎng)頁(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)設(shè)計(jì)熒光定量引物(表1), 并用常規(guī)qRT-PCR和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)引物的特異性。選用作為內(nèi)參基因[23]; 使用LightCycler 480 SYBR Green I Master試劑和LightCycler 480 II儀器(Roche, 瑞士)進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。采用2–?CT或2–??CT法[24]計(jì)算該基因相對(duì)表達(dá)水平。

1.8 數(shù)據(jù)獲取、處理及分析

使用TPIA數(shù)據(jù)庫http://tpia.teaplant.org/index.html[25]下載茶樹品種‘舒茶早’不同組織器官內(nèi)基因(TEA022532)表達(dá)量數(shù)據(jù)。采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示; 使用Prism 6.0 (GraphPad, 美國(guó))制作柱狀圖; 使用SPSS Statistics 20.0軟件(IBM, 美國(guó))對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 CsHXK2基因啟動(dòng)子克隆及分析

通過qRT-PCR擴(kuò)增, 獲得了特異性的目的條帶(圖1-A)。經(jīng)克隆、測(cè)序得到基因起始密碼子ATG上游?2097 bp至?69 bp啟動(dòng)子序列(圖1-B), 其中腺嘌呤(A)數(shù)為785個(gè), 占38.69%; 鳥嘌呤(G)數(shù)為193, 占9.51%; 胞嘧啶(C)數(shù)為228, 占11.24%; 胸腺嘧啶(T)數(shù)為823, 占40.56%。

利用New PLACE數(shù)據(jù)庫分析該段2029 bp序列所含的關(guān)鍵順式作用調(diào)控DNA元件。由表2可知, 該啟動(dòng)子含有多種調(diào)控茶樹響應(yīng)外在信號(hào)的順式作用元件, 如感知光照、熱擊、氧氣、病菌、創(chuàng)傷、低溫、干旱的響應(yīng)元件, 即-10PEHVPSBD、GATABOX、CCAATBOX1、CURECORECR、ELRECOREPCRP1、LTRE1HVBLT49、MYCCONSENSUSAT等; 如響應(yīng)生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素、水楊酸、乙烯、赤霉素、脫落酸的作用元件, 即ARFAT、ARR1AT、ELRECOREPCRP1、ERELEE4、GARE1OSREP1、MYB1AT等; 多個(gè)糖信號(hào)響應(yīng)元件, 即MYBGAHV、SREATMSD、SURE1STPAT21、WBOXHVISO1; 且有ARF、Dof、WRKY、MYB、MYC、RAV1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn), 即ARFAT、DOFCOREZM、ELRECOREPCRP1、MYB1AT、MYCCONSENSUSAT、RAV1AAT等。此外, 還具有調(diào)控葉肉、種子、花、根系、腋芽、保衛(wèi)細(xì)胞組織基因表達(dá)的元件, 即CACTFTPPCA1、CANBNNAPA、CARGATCON SENSUS、RHERPATEXPA7、SREATMSD、TAAAGSTKST1等。說明茶樹基因啟動(dòng)子具備多種調(diào)控作用元件, 可能通過參與糖代謝和轉(zhuǎn)導(dǎo)糖信號(hào)而調(diào)控茶樹的生長(zhǎng)發(fā)育以及逆境脅迫應(yīng)答。

圖1 茶樹CsHXK2基因啟動(dòng)子擴(kuò)增及序列

A:啟動(dòng)子PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖; B:啟動(dòng)子序列。

A: electrophoresis of PCR products ofpromoter; B: sequence ofpromoter

表2 茶樹CsHXK2基因啟動(dòng)子的主要順式作用元件

2.2 CsHXK2蛋白亞細(xì)胞定位

將攜帶::和::::載體的農(nóng)桿菌注射至煙葉片內(nèi)。經(jīng)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn), 注射空載體的葉片在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜、細(xì)胞核內(nèi)均具有GFP綠色熒光信號(hào)(圖2-A, C); 含有CsHXK2融合GFP蛋白的葉片, 細(xì)胞內(nèi)的綠色熒光(圖2-D)可以與葉綠素自發(fā)紅色熒光(圖2-E)相互重疊, 呈現(xiàn)出黃色熒光信號(hào)(圖2-G)。隨后, 我們將去除N末端葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的CsHXK2蛋白融合GFP表達(dá)載體(即::::)注射至含有RFP核定位marker的煙草葉片內(nèi)發(fā)現(xiàn), 含有CsHXK2-cTP融合GFP蛋白的葉片與含有空載體的葉片所發(fā)射的綠色熒光信號(hào)具有相同的來源(圖2-L, O, H, K), 即來源于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜、細(xì)胞核。表明CsHXK2蛋白定位于葉綠體, 且其蛋白質(zhì)序列上存在的N末端葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)肽對(duì)其定位起到了決定性的作用。

圖2 茶樹CsHXK2蛋白亞細(xì)胞定位

A~C和H~K:::; D~G:::::; L~O:::::。A, D, H, L: GFP綠色熒光信號(hào); E: 葉綠素自發(fā)熒光; I, M: 細(xì)胞核RFP紅色熒光信號(hào); B, F, J, N: 明場(chǎng); C, G, K, O: 信號(hào)融合。

A–C and H–K:::; D–G:::::; L–O:::::. A, D, H, L: GFP green fluorescent signal; E: chlorophyll autofluorescence; I, M: RFP red fluorescent signal of nucleus; B, F, J, N: bright field; C, G, K, O: merged signal.

2.3 CsHXK2蛋白酵母功能互補(bǔ)驗(yàn)證

本研究將::、::酵母表達(dá)載體以及空載體pDR196分別轉(zhuǎn)化至缺乏己糖激酶()活性的酵母三重突變體YSH7.4-3C, 轉(zhuǎn)化片段經(jīng)酵母菌液PCR和電泳跑膠驗(yàn)證正確(圖3-E)。點(diǎn)板試驗(yàn)結(jié)果顯示, 轉(zhuǎn)化空載體、CsHXK2和CsHXK2-cTP的酵母均可在無碳源而僅有yeast nitrogen base、–Ura DO Supplement、瓊脂成分的培養(yǎng)基上進(jìn)行緩慢生長(zhǎng)(圖3-A), 而在含半乳糖為碳源的培養(yǎng)基上迅速生長(zhǎng)(圖3-B); 在含葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基上, 轉(zhuǎn)化CsHXK2-cTP的酵母長(zhǎng)勢(shì)顯著優(yōu)于轉(zhuǎn)化CsHXK2的酵母, 且二者長(zhǎng)勢(shì)明顯優(yōu)于轉(zhuǎn)化空載體pDR196的酵母(圖3-C); 在含果糖為碳源的培養(yǎng)基上, 轉(zhuǎn)化CsHXK2的酵母與轉(zhuǎn)化空載體pDR196的酵母生長(zhǎng)勢(shì)相似, 而轉(zhuǎn)化CsHXK2-cTP的酵母長(zhǎng)勢(shì)顯著性優(yōu)于二者(圖3-D)。說明CsHXK2蛋白具有的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽能顯著影響其磷酸化催化活性; CsHXK2成熟蛋白可以磷酸化葡萄糖和果糖。

圖3 CsHXK2蛋白酵母功能互補(bǔ)驗(yàn)證

A: ddH2O; B: 2%半乳糖; C: 2%葡萄糖; D: 2%果糖; E: 酵母轉(zhuǎn)化片段電泳檢測(cè)。

A: ddH2O; B: 2% galactose; C: 2% glucose; D: 2% fructose; E: electrophoretic detection of the transformed fragments in yeast.

2.4 CsHXK2基因組織表達(dá)特異性

本研究利用qRT-PCR檢測(cè)了茶樹品種‘龍井43’春季和秋季不同組織中基因的表達(dá)情況, 并用TPIA數(shù)據(jù)庫[25]獲取了基因在茶樹品種‘舒茶早’不同組織器官內(nèi)的表達(dá)水平(圖4)?！埦?3’春季組織中,基因表達(dá)量在根系中最高, 其次在莖中; 此外, 其表達(dá)量隨著頂芽生長(zhǎng)發(fā)育至第三葉而顯著性上升; 但在老葉中呈現(xiàn)出最低表達(dá)量(圖4-A)?！埦?3’秋季組織中,基因同樣在根系內(nèi)表達(dá)量最高, 其次在莖和未綻放的花蕾中, 3個(gè)組織內(nèi)的表達(dá)量無顯著性差異;基因在腋芽?jī)?nèi)的表達(dá)量顯著性高于頂芽, 而在老葉和盛開的花中表達(dá)量最低(圖4-B)?；蛟凇娌柙纭鹘M織器官內(nèi)的表達(dá)水平呈現(xiàn)出與‘龍井43’組織內(nèi)相似的表達(dá)特異性, 即表達(dá)量在根系中最高, 其次在莖中, 而在老葉中最低(圖4-C)。表明基因在茶樹源庫組織內(nèi)均具有一定的作用, 尤其在庫組織根和莖的生長(zhǎng)發(fā)育和物質(zhì)代謝中起到重要的作用。

2.5 CsHXK2基因不同處理下的表達(dá)模式

對(duì)茶樹品種‘龍井43’、‘大面白’、‘浙農(nóng)12’和‘浙農(nóng)113’自然冷馴化(越冬期)和脫馴化過程中的基因表達(dá)情況的分析發(fā)現(xiàn),基因在4個(gè)不同茶樹品種內(nèi)具有相似的表達(dá)模式, 且在‘龍井43’、‘浙農(nóng)12’和‘浙農(nóng)113’內(nèi)的表達(dá)隨著環(huán)境氣溫的降低(2017.12.18, 2018.01.12)[26]而顯著下調(diào), 并隨著氣溫的升高(2018-03-27)而顯著上調(diào)(圖5-A)。室內(nèi)4℃低溫處理能顯著降低茶樹葉片內(nèi)基因的表達(dá)量, 且隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低; 而基因的表達(dá)水平隨著處理溫度恢復(fù)至25℃而快速上升至處理前表達(dá)量(圖5-B)。表明基因的表達(dá)受到低溫的抑制。

圖4 茶樹CsHXK2基因的組織特異性表達(dá)模式

A: 春季‘龍井43’不同組織; B: 秋季‘龍井43’不同組織; C: ‘舒茶早’不同組織。柱上標(biāo)以不同字母表示數(shù)據(jù)間的顯著性差異(< 0.05)。

A: different tissues of ‘Longjing 43’ in spring; B: different tissues of ‘Longjing 43’ in autumn; C: different tissues of ‘Shuchazao’. Different letters on the column indicate significant difference between the data (< 0.05).

采用有傷接種的方式, 對(duì)‘龍井43’葉片進(jìn)行針頭刺傷后分別噴施ddH2O和炭疽菌孢子懸浮液, 取樣后檢測(cè)基因的表達(dá)變化。由圖5-C可知, 在刺傷噴灑ddH2O和炭疽菌的葉片中,基因的表達(dá)均隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)至24 h而顯著下調(diào); 在24 h時(shí)間點(diǎn), 炭疽菌處理葉片內(nèi)的基因表達(dá)量顯著低于對(duì)照。表明基因響應(yīng)炭疽菌生物脅迫侵染而抑制表達(dá)。

對(duì)盆栽‘龍井43’葉片分別噴灑ddH2O和50 μmol L-1GA3, 處理后取樣并進(jìn)行基因表達(dá)分析。噴灑ddH2O葉片內(nèi)的基因表達(dá)無顯著性變化; 而50 μmol L-1GA3處理的葉片內(nèi),基因表達(dá)量在第3天和第5天顯著上升, 且顯著高于同一時(shí)間點(diǎn)的對(duì)照(圖5-D)。說明基因參與響應(yīng)赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

圖5 茶樹CsHXK2基因在不同處理下的表達(dá)分析

A: 自然冷馴化; B: 4℃低溫及25℃恢復(fù); C: 炭疽菌接種; D: 50 μmol L–1外源GA3處理。柱上標(biāo)以不同字母表示數(shù)據(jù)間的顯著性差異(< 0.05)。*表示0.05水平顯著; ***表示0.001水平顯著。

A: natural cold acclimation; B: 4℃ cold and 25℃ recovery; C: inoculation with; D: 50 μmol L–1exogenous GA3. Different letters on the column indicate significant difference between the data (< 0.05). * indicates significant at the 0.05 probability level; *** indicates significant at the 0.001 probability level.

3 討論

六碳糖己糖(Hexose), 如葡萄糖和果糖, 是植物中大部分代謝途徑和有機(jī)物質(zhì)的最初底物。己糖在參與呼吸作用、合成代謝等過程之前必須被磷酸化[27]。己糖激酶HXKs可以ATP依賴性地磷酸化一系列己糖(通常為葡萄糖和果糖)轉(zhuǎn)換成己糖-6-磷酸; 此外, 許多HXKs如擬南芥AtHXK1, 具有感知糖濃度水平, 進(jìn)而調(diào)控光合系統(tǒng)基因表達(dá)、細(xì)胞增殖、根和花序生長(zhǎng)、葉片擴(kuò)展和衰老[16-17]。因此, HXKs是參與碳水化合物代謝和糖信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的雙功能酶, 在植物代謝以及生長(zhǎng)發(fā)育中起著不可或缺的作用。

與茶樹CsHXK2關(guān)系密切的親緣蛋白有擬南芥AtHXK3、水稻OsHXK4、煙草NtHXK2及番茄LeHXK4, 均屬于具有葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的type A類HXKs[19], 且均作用于葉綠體基質(zhì)[10,12,28-29]?；诮湍讣禾羌っ腹δ苋笔Щパa(bǔ)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn), LeHXK4全長(zhǎng)蛋白不能磷酸化葡萄糖和果糖, 但其去除葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的成熟蛋白能磷酸化葡萄糖和果糖; 而利用酶活動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn), LeHXK4具有葡萄糖和果糖磷酸化活性[29]。因此, 轉(zhuǎn)化LeHXK4的酵母突變體不能利用己糖為碳源, 主要是由于葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽所引起的蛋白細(xì)胞內(nèi)定位而造成, 轉(zhuǎn)運(yùn)肽本身并沒有改變酶的催化活性。本研究中, CsHXK2蛋白定位于葉綠體(圖2-D和G)內(nèi), 具有葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的CsHXK2蛋白僅能以磷酸化葡萄糖為碳源, 而去除轉(zhuǎn)運(yùn)肽的CsHXK2成熟蛋白則能催化葡萄糖和果糖為碳源(圖3-C和D)。說明CsHXK2成熟蛋白具備己糖磷酸化活性, 而完整CsHXK2蛋白的催化能力仍有待用酶活試驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步的探究。

擬南芥基因在根和種子(長(zhǎng)角果)中具有相對(duì)豐富的表達(dá)量[10,14]; 水稻基因在根、花、幼嫩種子內(nèi)的表達(dá)量明顯高于葉片, 且在胚乳內(nèi)的表達(dá)顯著高于種皮[12]; 煙草pNtHXK2::GUS活性可在淀粉鞘、木質(zhì)部薄壁組織、保衛(wèi)細(xì)胞和根尖組織中被檢測(cè)到, 而在成熟花藥內(nèi)無活性[28]; 質(zhì)體定位的番茄LeHXK4編碼基因可在非光合作用庫組織內(nèi)表達(dá), 包括根、莖、花、綠果、粉果、紅果[29]。與同為type A類的、、、基因組織表達(dá)特異性相似,基因在茶樹的根、莖、嫩葉(芽)、花、腋芽?jī)?nèi)具有較高的表達(dá)量(圖4)。這可能歸因于基因啟動(dòng)子上具有的根(RAV1AAT和RHERPATEXPA7)、花(CARGATCONSENSUS和POLLEN1LELAT52)、葉肉(CACTFTPPCA1)以及腋芽(SREATMSD)特異性表達(dá)元件(表2)。說明基因主要在茶樹根、莖等庫組織的生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮作用, 可能通過磷酸化質(zhì)體內(nèi)的葡萄糖和果糖而促進(jìn)糖代謝, 進(jìn)而為組織生長(zhǎng)發(fā)育提供能量和中間代謝物。

茶樹原產(chǎn)于熱帶及亞熱帶地區(qū), 性喜溫暖, 冬季低溫和春季倒春寒是威脅茶葉生產(chǎn)的主要?dú)夂蛞蛩?。處于溫暖濕?rùn)的茶樹葉片極易感染由炭疽菌而引發(fā)的茶炭疽病, 造成茶葉品質(zhì)及產(chǎn)量降低。自然冷馴化低溫條件下, 茶樹葉片內(nèi)可溶性總糖、蔗糖、葡萄糖及果糖含量顯著上升[30-31]。同樣, 經(jīng)炭疽菌侵染的植物葉片內(nèi)總可溶性碳水化合物、蔗糖、己糖含量明顯積累[32-33]。增加的可溶性糖, 包括葡萄糖和果糖, 既能參與細(xì)胞內(nèi)碳和能量代謝, 又能作為信號(hào)分子而參與調(diào)控植物脅迫響應(yīng)和生長(zhǎng)發(fā)育[34]。本研究中基因在低溫及炭疽菌處理后葉片內(nèi)的表達(dá)情況表明, 該基因響應(yīng)低溫及炭疽菌脅迫而表達(dá)顯著下調(diào)(圖5-A~C)。擬南芥基因響應(yīng)低溫、滲透和鹽脅迫而在根系或嫩梢組織內(nèi)表達(dá)降低[14]; 同樣為type A類的麻風(fēng)樹基因, 在低溫處理24 h的葉片內(nèi)表達(dá)上調(diào), 而在根系內(nèi)表達(dá)下調(diào)[9]。因此, 感應(yīng)低溫和炭疽菌而表達(dá)抑制的基因是如何參與調(diào)節(jié)茶樹適應(yīng)外在刺激, 仍有待深入研究。

赤霉素(GA3)作為一種植物激素, 參與調(diào)控多種生長(zhǎng)發(fā)育過程。赤霉素信號(hào)途徑與糖信號(hào)之間存在著緊密關(guān)聯(lián),其中HXKs是激素與糖聯(lián)系的一個(gè)關(guān)鍵元件。離體矮牽?；ü趦?nèi), GA3對(duì)赤霉素誘導(dǎo)基因(gibberellin-induced gene)和查爾酮合成酶基因(chalcone synthase gene)表達(dá)的誘導(dǎo)受到葡萄糖的促進(jìn), 但這種葡萄糖引起的促進(jìn)效果可以被HXK競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑甘露庚酮糖所完全摧毀, 表明HXKs參與的糖磷酸化相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與赤霉素信號(hào)相互作用, 進(jìn)而誘導(dǎo)矮牽牛花冠發(fā)育過程中的基因表達(dá)和花青素積累[35]。阿洛糖作為葡萄糖的差向異構(gòu)體, 能強(qiáng)烈抑制水稻赤霉素依賴性反應(yīng), 如第二葉鞘的伸長(zhǎng)以及無胚半稻種子α-淀粉酶的誘導(dǎo), 也能抑制具有赤霉素組成型響應(yīng)表型的水稻突變體的生長(zhǎng), 而這些抑制能被HXK抑制劑甘露庚酮糖所阻止, 表明阿洛糖通過HXK依賴途徑抑制赤霉素信號(hào)傳導(dǎo)[36]。本研究檢測(cè)GA3處理的茶樹葉片內(nèi)基因的表達(dá)發(fā)現(xiàn), 該基因轉(zhuǎn)錄本在處理樣品中有顯著的誘導(dǎo)富集(圖5-D)。表明茶樹赤霉素信號(hào)途徑和基因表達(dá)關(guān)系密切, 可能與HXK介導(dǎo)的糖信號(hào)途徑共同調(diào)控茶樹的生長(zhǎng)發(fā)育與逆境脅迫響應(yīng)有關(guān)。

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Promoter cloning and expression analysis of the hexokinase genein tea plant ()

LI Na-Na1, LIU Ying1,2, ZHANG Hao-Jie1, WANG Lu1, HAO Xin-Yuan1, ZHANG Wei-Fu1, WANGYu-Chun1, XIONG Fei1,3, YANG Ya-Jun1,*, and WANG Xin-Chao1,*

1Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences / National Center for Tea Improvement / Key Laboratory of Tea Biology and Resources Utilization, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Hangzhou 310008, Zhejiang, China;2College of Horticulture, Northwest A&F University, Yangling 712100, Shaanxi, China;3College of Horticulture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, Jiangsu, China

Hexokinase is a kind of dual-function protein playing a crucial role in hexose phosphorylation and sugar signaling transduction in plants. In our previous study, four hexokinase genes from tea plant were cloned, andgene encoded 492 amino acid residues was classified as Type A HXKs together with AtHXK3 fromand LeHXK4 from tomato. 2029 bp promoter ofgene was obtained by RT-PCR. Further sequence analysis showed thatgene may be regulated by light, low temperature, pathogen, sugars and phytohormones, and specificallyexpressed in leaves, flowers, seeds, roots, axillary buds. CsHXK2 protein was localized in the chloroplast. Functional complementation of the hexokinase-deficient yeast mutant showed that the CsHXK2 mature protein removal of chloroplast transit peptide, had phosphorylation activity of glucose and fructose. Tissue-specific expression analysis found thathad the highest transcriptional levels in roots and stems, whereas the lowest in old leaves. The expression level ofgene was significantly down-regulated in both cold stress treatment and leaves infected treatment by. However, the expression level ofwas significantly stimulated after exogenous GA3treatment in tea leaves. In conclusion, the results suggested thatplayed an important role in the regulation of both development and stress responses in tea plant.

tea plant; hexokinase; promoter; subcellular localization; expression regulation

10.3724/SP.J.1006.2020.94166

本研究由國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31700615), 中國(guó)博士后科學(xué)基金項(xiàng)目(2017T100119, 2016M600150)和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(茶葉)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-19)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31700615), the China Postdoctoral Science Foundation (2017T100119, 2016M600150), and the Earmarked Fund for China Agriculture Research System (Tea) (CARS-19).

楊亞軍, E-mail: yjyang@tricaas.com; 王新超, E-mail: xcw75@tricaas.com

E-mail: nanali@tricaas.com

2019-11-06;

2020-06-02;

2020-07-03.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20200703.1710.004.html