油菜抗咪唑啉酮類除草劑基因標記的開發(fā)與應(yīng)用

胡茂龍 程 麗 郭 月 龍衛(wèi)華 高建芹 浦惠明,* 張潔夫 陳 松

研究簡報

油菜抗咪唑啉酮類除草劑基因標記的開發(fā)與應(yīng)用

胡茂龍1,2程 麗1郭 月1龍衛(wèi)華1高建芹1浦惠明1,*張潔夫1,2陳 松1

1江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所/ 國家油料作物改良中心南京分中心/ 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部長江下游棉花與油菜重點實驗室/江蘇省農(nóng)業(yè)生物學(xué)重點實驗室/ 江蘇省現(xiàn)代作物生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心, 江蘇南京 210014;2江蘇大學(xué)生命科學(xué)研究院, 江蘇鎮(zhèn)江 212023

草害已成為嚴重制約我國油菜生產(chǎn)的重要因素。種植抗除草劑品種和采用化學(xué)除草是防控草害的經(jīng)濟有效途徑。為了開展分子標記輔助選擇(marker-assisted selection, MAS)育種, 加速抗除草劑品種培育, 本研究針對已發(fā)現(xiàn)的抗咪唑啉酮類除草劑油菜M9中基因編碼區(qū)第1913位點的SNP變異, 開發(fā)高通量、低成本的競爭性等位基因特異PCR (kompetitive allele specific PCR, KASP)標記。采用篩選出的KBA1R19681913B標記在2個F2群體中進行KASP反應(yīng)。結(jié)果表明, 該標記能有效檢測群體中存在的3種基因型, 其分離比均為1︰2︰1, 遵循單基因遺傳規(guī)律, 且基因型與表型完全吻合。將該標記用于抗性純合基因的回交轉(zhuǎn)育, 獲得200多個抗咪唑啉酮油菜恢復(fù)系。該標記還可在油菜苗期鑒定抗性雜交種的純度。KASP標記KBA1R19681913B的獲得為油菜抗除草劑MAS育種以及抗性新種質(zhì)的培育提供了技術(shù)支撐。

草害; 油菜; 標記輔助選擇; 咪唑啉酮類除草劑; KASP標記

油菜是我國第一大油料作物, 產(chǎn)油量占國產(chǎn)油料作物總產(chǎn)的55%以上, 發(fā)展油菜生產(chǎn)對維護我國食用油供給安全具有重要的戰(zhàn)略意義[1]。然而, 隨著我國農(nóng)村經(jīng)濟的快速發(fā)展, 勞動力成本大幅提高, 油菜比較效益下降, 農(nóng)戶種植油菜積極性不高, 生產(chǎn)管理粗放, 草害日益嚴重,已成為制約我國油菜生產(chǎn)的重要因素。生產(chǎn)上使用的穩(wěn)殺得、蓋草能等除草劑能有效防除油菜田單子葉雜草, 對減輕雜草危害和提高油菜產(chǎn)量起到一定的作用。但對絕大多數(shù)闊葉雜草, 目前生產(chǎn)上尚未開發(fā)出安全高效的除草劑, 我國油菜田化學(xué)除草面積非常有限。開發(fā)抗性基因, 選育種植對特定除草劑具有選擇抗性的油菜品種, 是解決油菜化除最經(jīng)濟有效的途徑[2]。

咪唑啉酮(imidazolinone, IMI)類除草劑是應(yīng)用較廣泛的一類除草劑。該類除草劑具有選擇性強、廣譜、高活性等優(yōu)點, 可進行播前混土、苗前土表處理以及莖葉噴霧, 除草劑經(jīng)植物根與葉吸收后可有效防除一年生禾本科與闊葉雜草, 也能防除多年生雜草[3]。但該類除草劑對一般不具有抗(耐)除草劑特性的農(nóng)作物本身也會產(chǎn)生藥害, 極大限制了其使用時間和空間, 如需要在農(nóng)作物播種前一段時間使用才能避免產(chǎn)生藥害。培育抗(耐)除草劑品種可減少藥害、拓寬現(xiàn)有咪唑啉酮類除草劑的使用范圍。通過定向誘變IMIs的靶標酶乙酰乳酸合酶(acetolactate synthase, ALS)氨基酸變異, 可引起除草劑與ALS結(jié)合方式的變化產(chǎn)生抗性植物[4]。參照模式植物擬南芥ALS氨基酸序列, 已報道的抗性位點中主要涉及Ala122、Pro197、Ala205、Asp376、Arg377、Trp574、Ser653、Gly654等氨基酸, 其中對IMIs產(chǎn)生抗性的氨基酸突變位點主要有Pro122、Trp574、Ser653和Gly654[5-10]。而已發(fā)現(xiàn)抗IMI的油菜突變位點主要是Trp574和Ser653[11-14]。前期我們獲得了自然突變的抗IMI油菜M9, 其抗性濃度是除草劑有效殺草濃度的2~3倍, 抗性穩(wěn)定、具有利用價值[15-17]。胡茂龍等[18]從M9中克隆到抗性基因發(fā)現(xiàn), 抗性基因與野生型基因在第1913位點存在1處SNP, 導(dǎo)致ALS1的第638位絲氨酸殘基被天冬酰胺酸替代?？剐曰虻陌l(fā)現(xiàn)為我國提供了具有自主知識產(chǎn)權(quán)的抗除草劑基因, 通過常規(guī)的雜交、回交等育種手段可將該基因轉(zhuǎn)育到栽培品種中, 但需要噴施除草劑逐代篩選鑒定, 其過程經(jīng)歷多代的雜交和回交, 育種周期較長, 而且該基因為不完全顯性基因, 表型選擇難以分辨純合和雜合抗性基因型, 更增加了育種的周期和難度。因此, 若能開發(fā)到檢測抗性功能基因分子標記, 利用分子標記輔助選擇(marker-assisted selection, MAS)技術(shù)鑒定基因型, 指導(dǎo)田間育種, 對于抗除草劑基因快速轉(zhuǎn)育、加快育種進程具有重要意義。

競爭性等位基因PCR (kompetitive allele specific PCR, KASP)標記技術(shù)是基于引物末端堿基的特異匹配來對SNPs和InDels (Insertions and Deletions, 插入和缺失)進行高精度的雙等位基因分型方法, 是由LGC (Laboratory of the Government Chemist)公司(http://www.lgcgroup.com/)設(shè)計和創(chuàng)制, 具有通量高、成本低、準確度高等優(yōu)點, 已經(jīng)成為新一代的SNP分型標記, 在水稻、小麥、玉米、大豆等作物的基因精細定位、MAS育種、種質(zhì)資源鑒定等方面被廣泛應(yīng)用[19-22]。但迄今, KASP標記在油菜研究上鮮有報道, 特別是有關(guān)檢測油菜抗除草劑基因在國內(nèi)外未見報道。本研究根據(jù)M9中基因第1913位點的SNP變異, 設(shè)計開發(fā)了KASP標記, 能夠高效、精確選擇抗除草劑基因的基因型, 加快了油菜材料的抗性穩(wěn)定進程, 以期為油菜抗除草劑MAS育種提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

M9-2、M9-14為含有抗性基因的M9后代系選材料, M9是浦惠明等[17]在油菜和大豆多年輪作的試驗田中發(fā)現(xiàn)的抗IMI自然突變體。3075R和N341為江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所選育的MICMS細胞質(zhì)雄性不育雙低恢復(fù)系, 均經(jīng)過多代自交, 各項性狀穩(wěn)定。F1-2是以N341為母本、抗性材料M9-2為父本雜交F1代, F1-3是以3075R為母本、抗性材料M9-14為父本雜交F1代。2個F1自交衍生獲得F2群體, 用于基因型在分離群體中檢測鑒定。10M169為帶有抗性基因的MICMS恢復(fù)系, 對應(yīng)不育系寧A7均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所選育保存。

1.2 分子試劑與除草劑

由英國LGC公司合成KASP反應(yīng)試劑、KASP引物及特定的FAM和HEX熒光接頭序列。由上海英俊(Invitrogen)生命技術(shù)有限公司合成其他常規(guī)引物, DNA測序委托南京鐘鼎生物技術(shù)有限公司完成。DNA分子量標準、DNA回收試劑盒購自天根生化科技北京有限公司, 高保真性DNA聚合酶KOD-Plus及PCR試劑購自東洋紡(上海)生物科技有限公司。IMI類除草劑為山東先達化工有限公司生產(chǎn)的5.0%“豆施樂”水劑。

1.3 田間試驗與除草劑處理

油菜材料種植于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院南京溧水植物科學(xué)基地油菜隔離繁殖區(qū), 試驗嚴格控制花粉外漂, 以常規(guī)方法栽培管理。油菜花期用M9-2、M9-14與MICMS雙低恢復(fù)系3075R和N341配制F1組合, 次年春自交獲得F2世代, 秋播鑒定分離世代的抗性表現(xiàn)。同時用抗性恢復(fù)系10M169與不育系寧A7以人工雜交、網(wǎng)罩隔離和天然授粉3種方法生產(chǎn)抗性雜交種, 秋播鑒定F1和親本的抗性表現(xiàn)。油菜三至四葉期用濃度為90 g a.i. hm–2除草劑處理, 處理前取少許葉片保存于?80℃冰箱, 用于DNA提取。21 d后調(diào)查抗性表型。處理后油菜植株生長良好, 無藥害表現(xiàn), 為抗除草劑材料, 抗性表型用R表示; 處理后油菜植株生長受到抑制, 最終死亡, 為感除草劑材料, 抗性表型用S表示。

1.4 分子標記設(shè)計與KASP分型

M9與常規(guī)油菜寧油16、寧油18編碼ALS家族中的核苷酸序列存在1處SNP[12], 根據(jù)該處SNP可開發(fā)KASP分子標記檢測抗性基因。將己克隆的基因序列與野生型序列比對, 明確SNP在油菜基因的第1913位。以候選SNP位點為中心提取兩側(cè)50 bp側(cè)翼序列, 設(shè)計2組KASP分子標記引物, 每組標記由3條引物組成, 其中2條特異引物3'末端為等位變異堿基G/A, 且在5'端分別連接英國LGC公司KASP反應(yīng)試劑特定的FAM和HEX熒光接頭序列。通用引物的序列選擇要保證擴增片段在60~120 bp (表1)。

表1 抗性基因BnALS1R的KASP分子標記引物序列

下畫線黑體堿基表示SNP位點。The underlined and bold bases indicate SNP loci.

采用CTAB法并稍作修改提取DNA, 用1% (v/w)的瓊脂糖電泳和分光光度法檢測其純度[2]。KASP反應(yīng)體系包含模板DNA (20 ng μL-1) 2.5 μL、2×KASP Master mix 2.5 μL、KASP Assay mix 0.07 μL。PCR反應(yīng)條件為94℃ 15 min; 94℃ 20 s, 61~55℃ 1 min, 每個循環(huán)退火溫度降低0.6℃, 共10個循環(huán); 94℃ 20 s, 55℃ 1 min, 共26個循環(huán)。若擴增效果不理想可加循環(huán), 每次加3個循環(huán), 最多3次。KASP反應(yīng)在LGC Hydrocycler-16進行, 完成反應(yīng)后利用掃描儀Pherastar對KASP產(chǎn)物讀取熒光數(shù)據(jù), 熒光掃描的結(jié)果會自動轉(zhuǎn)化成圖形。利用BMG PHERAstar儀器檢測熒光信號并查看分型情況。若分型不充分, 則繼續(xù)擴增, 每3個循環(huán)查看分型情況, 直至分型完全。根據(jù)分析結(jié)果確定待測樣本中抗性基因的基因型, 在X軸附近顯示藍色的樣本基因型為連接FAM熒光標簽序列的等位基因型G/G, 為不含抗性基因的純合體; 在Y軸附近顯示紅色樣本的基因型為連接HEX熒光標簽序列的等位基因型A/A, 為含抗性基因的純合體; 中間顯示綠色樣本的基因型為雜合等位基因型G/A, 為含抗性基因的雜合體; 顯示黑色的樣本為空白對照。

1.5 基因克隆與測序

利用Primer Premier 5.0軟件根據(jù)甘藍型油菜(GenBank登錄號為Z11524)基因序列設(shè)計正向引物ALS1-5F: 5'-TGGATATTGACGGTGATGG-3'和反向引物ALS1-5R: 5'-CGAGTACGTCTGGGAACAA-3', 通過PCR特異擴增一段含有突變位點(G/A)的基因片段, 長度為537 bp。PCR反應(yīng)體系包含DNA模板5 μL、10×酶反應(yīng)緩沖液5 μL、25 mmol L?1MgSO42 μL、2 mmol L–1dNTPs 5 μL、10 μmol L–1引物各5 μL、1 U μL–1KOD-Plus酶1 μL, 加ddH2O水至50 μL。反應(yīng)程序為94℃ 5 min; 94℃ 30 s, 60℃ 30 s, 72℃ 30 s, 35個循環(huán)。經(jīng)1.2% (v/w)瓊脂糖凝膠電泳分離, 用DNA凝膠回收試劑盒將目的片段回收純化, 采用上下游引物雙向測序。通過DNAMAN 6.0、Sequencher、DNASTAR等生物信息學(xué)軟件分析測序結(jié)果, 確定樣本中的基因型。

1.6 應(yīng)用標記檢測F2群體基因型和F1雜種純度

于苗期提取1.3中的2個F2分離群體和3種不同授粉條件下的F1雜交種葉片DNA, 利用標記KBA1R19681913B引物進行KASP分型。根據(jù)基因分型結(jié)果, 統(tǒng)計F1雜種的純度和F2群體的基因型分離比例, 并對F2群體基因分型結(jié)果進行卡平方測驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 BnALS1R基因KASP標記的開發(fā)與驗證

油菜突變體M9中的抗性基因與常規(guī)油菜的在第1913處存在SNP位點(G/A), 屬于錯義突變位點(絲氨酸/天冬酰胺), 攜帶A等位變異為含抗除草劑基因的抗性材料, 攜帶G等位變異的為不含抗除草劑基因的敏感材料[18]。由于油菜ALS基因家族核酸序列的高度同源性, 特別是和(GenBank登錄號為Z11524、Z11526)在核酸水平的同源性達98%[23-24], 因此本研究選擇在第1913突變位點上下游2個基因序列有差異的位置設(shè)計2組特異性KASP標記引物KBA1R19681913A和KBA1R19681913B (表1)。選取含有抗性基因的M9后代株系M9-2、M9-14和不含抗性基因的MICMS雙低恢復(fù)系3075R和N341, 以及它們雜交獲得的F1代和F2群體單株共18個油菜材料, 利用設(shè)計的KASP 標記進行多態(tài)型篩選與小群體驗證。多次驗證結(jié)果發(fā)現(xiàn), 標記KBA1R19681913A在親本和小群體中沒有多態(tài)性, 而標記KA1R19681913B具有多態(tài)性, 其中KBA1R19681913B-X-allele檢測攜帶敏感基因的等位變異, KBA1R19681913B-Y-allele檢測攜帶抗性基因的等位變異, 上游共同引物KBA1R19681913B-common與存在3處堿基差異(圖1)。從圖2可以看出, 該標記可以清晰地把3種基因型分開, 其中靠近Y軸的紅點為攜帶A等位變異的抗IMI類除草劑基因純合型材料, 如M9后代株系M9-2、M9-14等; 靠近X軸的藍點為攜帶G等位變異的不含抗IMI類除草劑基因純合型材料, 如MICMS雙低恢復(fù)系3075R和N341等; 中間的綠點為攜帶G/A等位變異的含抗IMI類除草劑基因雜合型材料, 如F1代和F2群體單株M318-5、M318-7和M318-9等, 黑點為空白對照(圖2和表2)。

為了進一步驗證KASP標記引物的特異性和準確性, 設(shè)計1對引物特異擴增含有突變位點(G/A)的基因片段進行雙向測序。所有材料的PCR產(chǎn)物測序結(jié)果與KASP標記分型結(jié)果一致(表2)。油菜田間苗期抗除草劑表型鑒定的結(jié)果也發(fā)現(xiàn), 基因型與抗除草劑鑒定表型結(jié)果吻合(表2)。因此, 本研究獲得了檢測油菜抗IMI類除草劑基因的KASP分子標記引物, 能夠精確鑒定出抗性基因的3種基因型。

圖1 油菜BnALS1與BnALS3基因序列比對與多態(tài)性引物位置

倒三角形表示突變位點。箭頭線表示引物位置和擴增方向。

The single-site mutation is denoted by inverted triangle. The arrow lines represent primer sites and amplification directions.

圖2 KASP標記KBA1R19681913B在小群體中分型圖

2.2 群體中標記KBA1R19681913B檢測效果及抗性分析

利用標記KBA1R19681913B檢測2個F2群體(3075R/M9-14和N341/M9-2)基因型。2個F2群體中標記檢測效果良好, 呈現(xiàn)3種基因型(圖3)。攜帶抗IMI類除草劑基因的純合和雜合基因型的F2單株都表現(xiàn)抗除草劑, 而所有不攜帶抗IMI類除草劑基因純合基因型的F2群體單株均表現(xiàn)感除草劑。其中F2(3075R/M9-14)群體共分析29個單株, 有7個單株為抗性基因的純合體, 8個單株為不含抗性基因的純合體, 14個單株為抗性基因的雜合型, 3種基因型符合1︰2︰1 (χ2= 0.012,= 0.994)。F2(N341/M9-2)群體共分析50個單株, 有16個單株為抗性基因的純合體, 11個單株為不含抗性基因的純合體, 23個單株為抗性基因的雜合型, 3種基因型符合1︰2︰1 (χ2= 0.085,= 0.958)。2個群體均符合單基因遺傳分離規(guī)律, 標記檢測結(jié)果與苗期噴施除草劑鑒定表型完全一致, 即標記KBA1R19681913B與抗/感除草劑表型完全共分離, 同時能檢測到抗性雜合基因型, 表明標記KBA1R19681913B可用于抗IMI類除草劑育種的MAS選擇(表3)。

2.3 利用標記KBA1R19681913B輔助選擇抗性恢復(fù)系

本研究以M9-2和M9-14為抗性基因供體親本,MICMS恢復(fù)系3075R和N341為輪回親本, 分別對3075R/M9-14和N341/M9-2組合后代的抗性植株進行回交轉(zhuǎn)育, 回交2代, 每一代均對雜交種檢測保留抗性基因的雜合型單株, 與輪回親本回交; 對BC2F2單株保留抗性基因純合單株, 再自交一代, 結(jié)合農(nóng)藝和品質(zhì)性狀選擇, 獲得除草劑抗性穩(wěn)定BC2F3株系。同時, 由于3075R和N341均為帶有不育細胞質(zhì)的恢復(fù)系, 因此在回交后代連續(xù)選擇可育單株自交并進行抗性鑒定, 就育成抗咪唑啉酮的MICMS恢復(fù)系。目前已從2個回交后代群體選擇到生長勢強、成熟期適中的200多個抗性株系, 可為選育抗除草劑雜交種提供親本。

2.4 標記KBA1R19681913B在雜交種純度鑒定中的利用

利用攜帶抗性基因的MICMS恢復(fù)系10M169與不育系寧A7在3種不同授粉條件下配置F1雜種, 通過利用分子標記KBA1R19681913B對未經(jīng)IMI類除草劑咪唑乙煙酸處理和經(jīng)過噴藥處理的菜苗進行純度鑒定發(fā)現(xiàn), 在網(wǎng)罩隔離授粉和自然授粉條件下, 除草劑未處理的F1雜種純度分別為84%和80%, 均達不到85%的國標要求[25], 而經(jīng)過除草劑處理的F1雜種純度分別為97%和96%, 且標記鑒定結(jié)果與雜交種田間鑒定純度結(jié)果吻合, 表明標記KBA1R19681913B可用于抗性雜交油菜種子純度提前鑒定(表4)。因此, 在生產(chǎn)上如果通過KBA1R19681913B標記鑒定的雜交種子純度達不到國標要求, 可對F1雜種苗期進行除草劑處理, 以達到提高種子純度的目的, 同時兼顧大田除草, 一舉多得。

表2 KASP標記KALS1R19681913B在小群體中的分型結(jié)果與抗性表型

圖3 標記KBA1R19681913B在2個F2群體及親本中的基因分型

表3 標記在F2群體中基因型分型

3 討論

雜草是影響油菜生產(chǎn)的重要生物災(zāi)害之一, 噴施除草劑是防治草害的有效手段。加拿大、澳大利亞、法國、德國等油菜主產(chǎn)區(qū)早以通過種植抗IMI油菜實施雜草化學(xué)防控[4]。然而我國缺乏自主知識產(chǎn)權(quán)的油菜抗性基因, 至今無法應(yīng)用IMI類除草劑進行化學(xué)除草[26-27]。前期我們從M9中克隆獲得抗性基因, 該基因的突變位點與Swanson等[11]報道的PM1突變位點相同, 屬于除草劑靶標酶ALS的Ser653位點突變, 但是我國自主研發(fā)具有知識產(chǎn)權(quán)的抗性基因, 不受國際知識產(chǎn)權(quán)保護的限制[2]。本研究基于該突變位點的SNP, 在國內(nèi)外首次開發(fā)了檢測該抗性基因的KASP標記KBA1R19 681913B, 將該標記在F2群體進行驗證, 并應(yīng)用到抗性恢復(fù)系選育和雜交種純度鑒定中, 發(fā)現(xiàn)該KASP標記能夠快速、精確區(qū)分出的3種基因型和真假雜種。顯然, 以上研究可加快我國抗IMI油菜的選育和推廣應(yīng)用步伐。

表4 標記KBA1R19681913B在鑒定雜交種子純度的應(yīng)用

便宜、高效且準確的基因SNP分型方法一直是遺傳學(xué)家和育種家追求的技術(shù)手段。目前SNP分型技術(shù)有RFLP、CAPS等傳統(tǒng)的標記方法, 也有高通量測序和基因芯片等現(xiàn)代方法[28-30]。前者涉及到繁瑣的分子雜交和酶切實驗, 操作流程復(fù)雜、通量不高; 后者具有快速高效、結(jié)果可靠等優(yōu)勢, 但費用相對昂貴。同時芯片技術(shù)主要用于對百個以上的SNP檢測, 對少量SNP或單個基因的SNP進行檢測時, KASP技術(shù)具有經(jīng)濟高效的優(yōu)勢[31]。與基于芯片的Illumina GoldenGate相比, 使用KASP分型用于MAS回交選擇比使用其他高通量平臺節(jié)省7.9%~46.1%的費用[31]。KASP技術(shù)價格低廉、高效靈活特性[32], 已在水稻、小麥、玉米、大豆等作物中得到應(yīng)用[19-22,33]。在油菜中, Chang等[34]開發(fā)了源于黑芥()的抗根腫病基因的KASP標記, 并應(yīng)用于基因的精細定位和同源性關(guān)系分析。Fu等[35]利用BSR-Seq (bulked segregant RNA Sequencing)技術(shù)開發(fā)了多個KASP標記, 對油菜抗黑脛病(blackleg)基因進行了精細定位, 獲得了候選基因和可用于MAS選擇的KASP標記。但迄今在國內(nèi)外未見有關(guān)油菜抗IMI類除草劑基因分型的報道。本研究獲得了高效、精確檢測抗除草劑基因基因型的KASP標記KBA1R19681913B, 與之前的檢測該基因型的AS-PCR標記相比, 本研究獲得的標記在實際應(yīng)用中成本更低、通量更高[36]。另外, KASP標記僅需PCR和熒光檢測2個步驟, 無需對產(chǎn)物進行凝膠電泳檢測, 徹底杜絕了電泳中常用的染色劑溴化乙錠對人體的危害和環(huán)境的污染。綜上, 本研究獲得的基因分型方法具有簡便、快速、通量高、環(huán)境友好的顯著優(yōu)點, 更加適用于育種家在遺傳大群體中對不同基因型的鑒定以及MAS育種。

咪唑啉酮類除草劑的靶標ALS是植物支鏈氨基酸合成的關(guān)鍵酶。除草劑通過抑制ALS酶活性, 導(dǎo)致支鏈氨基酸合成受阻, 達到殺草目的。ALS基因堿基位點變異引起編碼氨基酸的改變產(chǎn)生抗性基因, 可使敏感作物產(chǎn)生除草劑抗性。在獲得抗性基因后, 開發(fā)合適的分子標記鑒定抗性基因型是進行MAS選擇的前提, 此方面前人有些研究。Thompson等[37]開發(fā)了檢測鷹嘴豆(L.)抗性位點Ala205的KASP標記; Kadaru等[38]開發(fā)了檢測水稻抗性位點Ser653和Gly654的AS-PCR標記; Lee等[39]開發(fā)了檢測大麥抗性位點Ser653的AS-PCR標記。然而, 與鷹嘴豆染色體組(2=16)、水稻(2=24)和大麥(2=14)不同, 甘藍型油菜為異源四倍體(2=38), 基因組龐大, 包括A、C兩套基因組?；蚪M進化的高度重排導(dǎo)致甘藍型油菜相關(guān)基因多以基因家族的形式存在[40]。同一家族基因核酸序列高度同源, IMI的靶基因ALS也不例外。位于基因組A的和基因組C的核酸同源性達98%, 這給KASP標記檢測增加了難度, 因為在進行PCR擴增過程中會受到同源序列的干擾[23-24]。為此, 在本研究中為明確KASP標記KBA1R19681913B基因分型的準確性, 我們另外設(shè)計了特異性引物進行雙向測序, 測序結(jié)果與KASP分型結(jié)果一致(表2)。同時, 用該標記對2個F2群體進行檢測發(fā)現(xiàn), 基因型分離比遵循單基因遺傳模式, 證明標記KBA1R19681913B可以有效、準確檢測的3種不同基因型。有意思的是, KBA1R19681913B的共用引物恰好錨定在和的3個SNP上(圖1), 而無多態(tài)性的KBA1R19681913A共用引物僅錨定在和的1個SNP (數(shù)據(jù)未列出)。這給了我們啟示, 即將來在油菜中開發(fā)KASP標記要特別重視共用引物序列的特異性。

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Development and application of the marker for imidazolinone-resistant gene in

HU Mao-Long1,2, CHENG Li1, GUO Yue1, LONG Wei-Hua1, GAO Jian-Qin1, PU Hui-Ming1,*, ZHANG Jie-Fu1,2, and CHEN Song1

1Institute of Industrial Crops, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences / Nanjing Sub-center, National Center of Oil Crops Improvement / Key Laboratory of Cotton and Rapeseed (Nanjing), Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Provincial Key Laboratory of Agrobiology, Jiangsu Aca-demy of Agricultural Sciences / Jiangsu Collaborative Innovation Center for Modern Crop Production, Nanjing 210014, Jiangsu, China;2Institute of Life Sciences, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, Jiangsu, China

Weed damage is one of the most important factors restricting the development of rapeseed production in China. Cultivation of herbicide-resistant varieties combined with chemical herbicides was an extremely effective help to control field weed in rapeseed production. To accelerate the breeding of cultivars with resistance imidazolinone herbicides through molecular marker-assisted selection in, the simplest, most cost-effective and high-throughput KASP markers were developed by using a SNP mutation at 1913 bp position of ALS (acetolactate synthase) gene in the mutant. A polymorphic marker designed KBA1R19681913B was obtained to effectively distinguish the homozygous resistant M9 from susceptible rapeseeds. Meanwhile, the KASP marker was evaluated in two F2populations and could effectively discriminate three genotypes. F2populations gave a good fit to the expected 1:2:1 ratio, confirming a single gene Mendel model with the perfect matched between phenotyping and genotyping. About more than two hundred homozygous restoring lines containingwere developed through KASP marker selection in multi-generation backcross and showed stable imidazolinone herbicide resistance. This functional marker can also be used to identify the purity of hybrid seeds at the seedling stage. In conclusion, the validated KASP marker KBA1R19681913B would provide a technical support for developing herbicide-resistant rapeseed in marker-assisted selection and identification of resistant germplasm.

weed damage; rapeseed (L.); marker-assisted selection; imidazolinone herbicides; KASP marker

10.3724/SP.J.1006.2020.04056

本研究由國家重點研發(fā)計劃項目(2016YFD0101300), 國家自然科學(xué)基金項目(31671731, 31901503), 國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(CARS-13)和江蘇省自然科學(xué)基金項目(BK20190267)資助。

This study was supported by the National Key Research and Development Program of China (2016YFD0101300), the National Natural Science Foundation of China (31671731, 31901503), the China Agricultural Research System (CARS-13), and the Natural Science Foundation of Jiangsu Province (BK20190267).

浦惠明, E-mail: puhuiming@126.com, Tel: 025-84390370

E-mail: humolon@163.com, Tel: 025-84390372

2020-03-02;

2020-06-02;

2020-06-14.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20200612.1531.006.html