擬南芥MATE轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白DTX6參與鎘離子的胞內(nèi)運(yùn)輸

呂澤玉，王文靜，趙明明，葛曉春

(復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，上海 200438)

鎘是具有生物毒性的重金屬元素之一,土壤中的鎘離子會通過食物鏈進(jìn)入人體而對人類健康造成嚴(yán)重危害[1].世界衛(wèi)生組織將鎘列為食品污染物,我國也將鎘列為需要進(jìn)行重點監(jiān)控的環(huán)境污染指標(biāo)之一.土壤中的鎘很容易通過鐵、鋅或錳的吸收途徑被植物根所吸收,并影響根部對礦質(zhì)營養(yǎng)元素的攝取[2],它能夠使轉(zhuǎn)錄因子和抗氧化酶等多種蛋白質(zhì)變性失活,并進(jìn)一步產(chǎn)生活性氧[3].鎘脅迫還會降低光合作用,導(dǎo)致農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)嚴(yán)重下降,因此對于植物中鎘吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的研究將為降低糧食中的鎘毒害、解決農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中重金屬污染的問題提供解決方案[4].

目前植物中還沒有專一性的鎘離子通道和轉(zhuǎn)運(yùn)載體的報道,植物主要通過一些礦質(zhì)營養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來吸收鎘離子,比如與鎘元素化學(xué)性質(zhì)相似的陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,包括轉(zhuǎn)運(yùn)鋅和鐵的ZRT/IRT蛋白(如水稻和擬南芥中都有的IRT1)[5]、低親和力的陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(Low-affinity Cation Transporter 1, LCT1)[6]以及天然抗性相關(guān)巨噬細(xì)胞蛋白(Natural Resistance-Associated Macrophage Proteins, NRAMPs)[7-8].鎘離子進(jìn)入細(xì)胞后,一方面可以由ATP依賴的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將其排出細(xì)胞,如擬南芥AtPDR8(Pleiotropic Drug Resistance 8)可將表皮細(xì)胞中的鎘離子排出,從而幫助植物耐受鎘毒害[9].另外,擬南芥防御素AtPDF2.5(Plant Defensin 2.5)可螯合細(xì)胞質(zhì)中的鎘離子,將鎘離子外排到質(zhì)外體,從而實現(xiàn)解毒作用[10];另一方面,鎘離子還可通過木質(zhì)部由根向地上部分轉(zhuǎn)移,這一過程需要重金屬ATP酶(Heavy Metal ATPase, HMA)的參與,例如擬南芥AtHMA2和AtHMA4可裝載鎘離子進(jìn)入維管組織從而進(jìn)行遠(yuǎn)距離運(yùn)輸[11].植物細(xì)胞為避免鎘離子的毒害,會通過幾類蛋白將鎘離子隔離在液泡中從而減弱對細(xì)胞的損害,如陽離子/H+交換(Cation Exchanger, CAX)型逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AtCAX2、AtCAX4[12]以及AtHMA3,它們轉(zhuǎn)運(yùn)鎘離子進(jìn)入液泡,從而提高植物對鎘離子的抗性[13];另外,植物體內(nèi)存在一些配體分子,可以與鎘離子結(jié)合形成螯合物,如植物螯合肽(Phytochelatins, PCs),它能夠螯合重金屬離子,以減少對細(xì)胞的毒害作用[14].有趣的是,擬南芥AtABCC1和AtABCC2也可以轉(zhuǎn)運(yùn)PC-Cd的螯合物到液泡中,從而對鎘毒害產(chǎn)生耐受作用[15].

植物中過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、愈創(chuàng)木酚過氧化物酶(GPX)等抗氧化酶和非酶抗氧化劑也可能參與抵抗鎘脅迫.谷胱甘肽(GSH)是合成PCs的前體物質(zhì),與此相關(guān)的合成酶缺陷均會不同程度地造成植物對鎘離子敏感[16-17].富含半胱氨酸的分子,包括金屬硫蛋白、谷胱甘肽、植物螯合肽等,均可以與重金屬鎘結(jié)合來抵御鎘脅迫[18].茉莉酸(JA)、脫落酸(ABA)等激素類分子也可以通過調(diào)控下游應(yīng)激基因的表達(dá)間接影響鎘離子在植物體內(nèi)的積累,以減緩鎘的毒害作用[19-21].

生物體為了抵抗毒素侵害,進(jìn)化出了多種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白.多藥及毒素化合物外排蛋白(Multidrug and Toxic Compound Extrusion, MATE)是其中一種,它廣泛存在于細(xì)菌和真核生物的細(xì)胞膜上,依賴跨膜的質(zhì)子勢能或鈉離子勢能,以主動運(yùn)輸?shù)姆绞睫D(zhuǎn)運(yùn)一些內(nèi)源代謝物以及外源毒性物質(zhì)[22].原核生物中首次被報道的MATE蛋白是副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)中的NorM,它參與多藥、抗生素、陽離子染料等物質(zhì)的外排[23],其結(jié)構(gòu)已被解析,由12個α跨膜螺旋形成一個V字形的結(jié)構(gòu)[24].DTX1(Detoxification 1)是擬南芥中第一個被報道的MATE轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,它定位于細(xì)胞膜上,參與了鎘離子的外排,在大腸桿菌中表達(dá)DTX1可提高大腸桿菌對鎘的耐受性[25].另外,在擬南芥和水稻中均存在MATE轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白FRD3(Ferric Reductase Defective 3),可轉(zhuǎn)運(yùn)鐵螯合劑檸檬酸,從而影響鐵的運(yùn)輸和分配[26].FRD3基因發(fā)生兩處堿基替換可使其獲得鋅耐受能力[27].在高粱、大麥等作物中均存在MATE轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,它們對維持鐵離子的穩(wěn)態(tài)、增強(qiáng)鋁的耐受性具有重要作用[28-29].

擬南芥MATE轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白成員眾多,與DTX1同源性較高的MATE蛋白成員有5個,它們處在同一個進(jìn)化分枝上,分別是AT2G04040(DTX1),AT2G04050(DTX2),AT2G04070(DTX3),AT2G04080(DTX4),AT2G04090(DTX5)和AT2G04100(DTX6),它們在基因組上緊密連鎖,成簇存在.除了DTX1被報道具有外排鎘離子的能力,其他成員在植物體內(nèi)的功能還沒有報道.研究鎘離子在植物中的吸收、轉(zhuǎn)移和分布對于降低鎘毒害、指導(dǎo)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重要意義.本研究通過遺傳和表達(dá)分析等發(fā)現(xiàn)DTX6與DTX1在功能上發(fā)生了較大差異,它定位在高爾基體而不是細(xì)胞質(zhì)膜上,可能參與了鎘離子在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸,而不是外排.對于DTX6參與鎘離子轉(zhuǎn)運(yùn)的研究將有助于我們了解植物中鎘離子的解毒機(jī)制.同時,可以利用基因編輯手段在作物中培育抗鎘毒害的優(yōu)良品種,具有廣泛的應(yīng)用價值.

1 材料與方法

1.1 材料、菌株與載體

實驗用到的擬南芥(Arabidopisisthaliana)均為Columbia(Col-0)生態(tài)型,DTX6的CRISPR突變體以Col-0生態(tài)型為背景構(gòu)建;植物生長條件為22℃,光照周期為光照16h/黑暗8h循環(huán);大腸桿菌E.coliDH5α、農(nóng)桿菌GV3101、酵母菌株THY.AP4、基因敲除載體pHSE401、植物過表達(dá)載體pCAMBIA1301-eYFP-N、pCAMBIA1306-eGFP、酵母表達(dá)載體為pNXgate32-3HA、啟動子分析載體pCAMBIA-1300均為本實驗室保存.

1.2 方法

1.2.1 擬南芥培養(yǎng)及脅迫處理

土壤培養(yǎng)植物:擬南芥培養(yǎng)土成分為蛭石∶黑土∶珍珠巖=9∶3∶1(質(zhì)量比).將土裝滿小盆,在底部澆入營養(yǎng)液并使土壤充分浸濕,將種子播種在土中,標(biāo)記植物的品種、種植人以及種植時間,用保鮮膜覆蓋,置于4℃低溫處理2～3d以打破休眠,之后移入長日照溫室中,(22±2) ℃進(jìn)行培養(yǎng).

平板培養(yǎng)植物:將種子裝入干凈滅菌后的Ep管,加入70%乙醇旋轉(zhuǎn)滅菌10min,之后換用含有0.01% Triton X-100的無水乙醇,振蕩幾次后倒在無菌濾紙上,待乙醇揮發(fā)后,點播或均勻撒在1/2MS培養(yǎng)基上,4℃避光處理2～3d后,轉(zhuǎn)移至長日照培養(yǎng)箱(22±2) ℃條件下生長.

CdCl2脅迫處理方法:將野生型和突變體種子用牙簽點在正常1/2MS和添加有10μmol/L CdCl2的1/2MS培養(yǎng)基上,4℃春化3d后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱中垂直生長,光照強(qiáng)度150μmol/(m2·s),生長10d后拍照觀察表型.統(tǒng)計野生型和突變體分別在鎘脅迫培養(yǎng)基以及正常培養(yǎng)基上的主根長,兩者相除得到相對根長.

1.2.2 擬南芥轉(zhuǎn)化

轉(zhuǎn)基因前一天,剪掉擬南芥果莢及已開放的花;將帶有質(zhì)粒的農(nóng)桿菌單菌落接入3mL DYT抗性培養(yǎng)基中,28℃、220r/min培養(yǎng)過夜;然后再以1∶100比例轉(zhuǎn)接到200mL含相同抗性的DYT培養(yǎng)基中,繼續(xù)培養(yǎng)至OD600在1.0～1.5之間;室溫5000g離心15min收集菌體,以MS培養(yǎng)液重懸使得OD600=0.8;將植物的花序浸泡在菌體懸浮液中9min;然后蓋上保鮮膜,避光于溫室培養(yǎng)24h,之后正常生長至收獲種子.

1.2.3 擬南芥RNA抽提及熒光定量PCR

使用TRIzol試劑抽提總RNA,以2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性,用PrimeScript RT-PCR Kit with gDNA eraser試劑(TaKaRa)將1μg RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA,然后用SYBR Green Master Mix試劑盒(YEASEN)進(jìn)行實時熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)錄水平,UBQ5用作基因表達(dá)內(nèi)參.

表1 基因表達(dá)水平檢測引物Tab.1 Primers for testing gene transcription level

1.2.4 酵母轉(zhuǎn)化

將酵母菌種劃線接種于固體YPDA培養(yǎng)基上,28℃培養(yǎng)2～3d;挑取平板上直徑為2～3mm的單菌落,接種于液體YPDA培養(yǎng)基中,30℃、250r/min培養(yǎng)過夜;將過夜培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)接至50mL液體YPDA中,使得OD600在0.2～0.3之間;然后30℃、250r/min培養(yǎng)3～4h;待菌體生長至OD600=0.5左右,離心收集菌體;用無菌水洗滌菌體,再以0.1mol/L LiAC重懸酵母,離心去除上清,用1.1×TE/LiAC重懸酵母,分裝成100μL每管.在管中加入提前混好的10μL單鏈鮭魚精DNA以及10μL待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒,再加入480μL 50% PEG、60μL 1mol/L LiAC和60μL 10×TE;將上述體系混合均勻,再30℃、220r/min振搖30min;然后加入70μL DMSO,于42℃水浴25min,期間顛倒混勻5次;42℃溫育結(jié)束后將離心管置冰上2min;然后離心收集菌體,以生理鹽水重懸菌體,涂布在SD/-T培養(yǎng)基上.

1.2.5 蛋白亞細(xì)胞定位

擬南芥原生質(zhì)體的制備方法見參考文獻(xiàn)[30].將構(gòu)建好的35S:DTX6-GFP載體和細(xì)胞器標(biāo)記物載體1∶1混勻,加入到適量的擬南芥原生質(zhì)體中,輕柔混勻,再加入終濃度33% PEG3350,混合均勻后,23℃反應(yīng)10min,加入440μL W5溶液(154mmol/L NaCl,125mmol/L CaCl2,5mmol/L KCl,2mmol/L MES, pH5.7)終止反應(yīng),100g離心2min后,去干凈上清,再加入100μL W5混勻,最后將重懸的原生質(zhì)體加入到含有W5溶液的細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)過夜.次日,離心收集原生質(zhì)體,取適量原生質(zhì)體制片,使用尼康正置激光共聚焦顯微鏡(A1;Nikon)觀察熒光信號.綠色熒光蛋白最大激發(fā)波長為488nm,發(fā)射光波段為500～550nm;紅色熒光蛋白最大激發(fā)光波長為561nm,發(fā)射光波段為570～620nm.

2 結(jié)果與分析

2.1 dtx6突變體耐受鎘脅迫

首先我們對與DTX1同源性較近的幾個連鎖基因進(jìn)行了進(jìn)化分析,發(fā)現(xiàn)DTX6盡管與DTX1同源性較近,但在這幾個連鎖基因中明顯與其他基因有所分化(圖1(a)),于是選擇DTX6進(jìn)行進(jìn)一步研究.從擬南芥種質(zhì)資源中心我們未能找到DTX6的突變體,于是利用CRISPR-Cas9技術(shù),選擇C端的保守區(qū)域設(shè)計靶位點,獲得了兩個敲除突變體,分別命名為dtx6-1和dtx6-2.利用DNAMAN比對突變體中DTX6靶位點附近的測序結(jié)果(圖1(b)),推導(dǎo)發(fā)現(xiàn)突變后氨基酸序列均有不同程度的截短(圖1(c)).為了解DTX6基因是否在耐受鎘離子脅迫中起作用,將Col-0型和突變體種子點在正常1/2MS培養(yǎng)基上以及含10μmol/L CdCl2的1/2MS培養(yǎng)基上,置于擬南芥光照培養(yǎng)箱生長10d后拍照(圖2(a,b)),發(fā)現(xiàn)在CdCl2脅迫下,DTX6兩個CRISPR突變體的相對根長明顯大于野生型的相對根長(圖2(c)).

圖1 DTX6的CRISPR突變體鑒定Fig.1 Identification of CRISPR mutants of DTX6(a) DTX1連鎖基因的進(jìn)化分析,使用MEGA 6.0軟件中的鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹;(b) 敲除突變體中DTX6靶位點附近測序結(jié)果比對,黑色方框中的堿基序列表示前間隔序列鄰近基序(Protospacer Adjacent Motif, PAM);(c) CRISPR突變體推導(dǎo)氨基酸序列示意圖,紅色標(biāo)記為非匹配序列,綠色標(biāo)記為預(yù)測的跨膜結(jié)構(gòu)域(Transmembrane Domain, TM).

圖2 擬南芥DTX6敲除突變體耐受鎘脅迫Fig.2 The DTX6 knock out mutants of Arabidopsis are resistant to cadmium stress(a)和(b)分別表示野生型和突變體在正常1/2MS培養(yǎng)基和含有10μmol/L CdCl2的1/2MS培養(yǎng)基上的表型,標(biāo)尺=1cm;(c) 鎘離子處理下平均每棵苗的相對根長.每種處理重復(fù)3次,圖中數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=8),進(jìn)行t檢驗,**表示P<0.01.

已知MATE蛋白家族中的DTX1能夠外運(yùn)重金屬鎘離子,DTX6與DTX1在親緣關(guān)系上又比較接近(圖1(a)),二者序列一致性達(dá)到70%,是二號染色體上成簇狀存在的同源基因.然而DTX6的CRISPR突變體對鎘離子表現(xiàn)抗性,說明DTX6也參與轉(zhuǎn)運(yùn)鎘離子,但似乎功能與DTX1相反.

2.2 酵母中過表達(dá)DTX6對鎘脅迫表現(xiàn)敏感

為了進(jìn)一步了解DTX6在鎘離子轉(zhuǎn)運(yùn)過程中的功能,我們將DTX6轉(zhuǎn)入釀酒酵母THY.AP4中表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)DTX6的酵母對鎘離子脅迫表現(xiàn)極為敏感(圖3(a,b)，見第394頁).同時發(fā)現(xiàn)在酵母中DTX6蛋白定位于點狀細(xì)胞器(圖3(c)，見第394頁),未發(fā)現(xiàn)其定位于細(xì)胞膜.已報道的DTX1定位于細(xì)胞質(zhì)膜上,在大腸桿菌中表達(dá)DTX1賦予了大腸桿菌抗鎘的特性;而DTX6的突變體抗鎘,酵母中過表達(dá)DTX6則表現(xiàn)對鎘敏感,DTX6定位在點狀的囊泡結(jié)構(gòu)上.以上結(jié)果進(jìn)一步說明DTX6并不參與鎘離子的外排,而極有可能在鎘離子進(jìn)入細(xì)胞后參與鎘離子在胞內(nèi)的運(yùn)輸.

圖3 過表達(dá)DTX6的酵母菌對鎘極為敏感Fig.3 Saccharomyces cerevisiae is hypersensitive to cadmium when over-experessing DTX6(a) 將轉(zhuǎn)化空載和DTX6的酵母菌OD600調(diào)至0.5,并依次稀釋5倍,各取5μL點在含有不同濃度CdCl2的SD/-T培養(yǎng)基上,28℃生長6d后拍照;(b) 酵母中蛋白表達(dá)鑒定;(c) eYFP空載和eYFP-DTX6融合蛋白在酵母中的亞細(xì)胞定位,DIC表示微分干涉相差成像,標(biāo)尺=75μm.

2.3 擬南芥中過表達(dá)DTX6對鎘脅迫沒有明顯表型

為了驗證擬南芥中過表達(dá)DTX6是否也對鎘離子脅迫表現(xiàn)敏感,我們將DTX6的過表達(dá)轉(zhuǎn)基因載體Pro35S∶∶eYFP-DTX6轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌后進(jìn)行轉(zhuǎn)基因,一共獲得43個陽性株系,選擇其中表達(dá)水平較高的3個株系,通過降低鎘離子的使用濃度,來觀察它們在鎘離子脅迫下的表型(圖4(a)，見第394頁).結(jié)果發(fā)現(xiàn)相對于Col-0型來說它們的根長并沒有顯著性差異(圖4(b)，見第394頁).我們獲得的轉(zhuǎn)基因株系經(jīng)過了RNA水平的鑒定,確認(rèn)為過表達(dá)DTX6的陽性株系(圖4(c)，見第394頁),但在觀察葉片和根中YFP熒光信號時不能觀察到明顯的YFP信號,利用幼苗或者蓮座葉材料進(jìn)行Western blot時也未發(fā)現(xiàn)有目標(biāo)大小的條帶出現(xiàn)(圖4(d))(eYFP-DTX6蛋白大小約為82kD).我們推測DTX6在植物中的表達(dá)有可能受到翻譯后調(diào)控,因此難以獲得穩(wěn)定的高表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥.

圖4 擬南芥轉(zhuǎn)基因株系在CdCl2脅迫下的表型Fig.4 Phenotype of Arabidopsis transgenic lines under cadmium stress(a) 3個DTX6的過表達(dá)株系(overexpression lines, OE lines)在正常1/2MS培養(yǎng)基和含有8μmol/L CdCl2的1/2MS 培養(yǎng)基上的表型,標(biāo)尺=1cm;(b) 鎘離子脅迫下平均每棵苗的相對根長.每種處理重復(fù)3次,圖中數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=8),進(jìn)行t檢驗;(c)和(d)分別表示轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平鑒定各株系中DTX6的表達(dá)水平,OE-5,OE-11和OE-25為3個不同的過表達(dá)株系.

2.4 DTX6基因的組織表達(dá)特異性

為了研究DTX6基因在擬南芥不同部位的表達(dá)水平,以幫助我們更好的解釋其功能,我們構(gòu)建了DTX6基因啟動子驅(qū)動的GUS表達(dá)載體ProDTX6∶∶GUS,轉(zhuǎn)基因后用潮霉素篩選陽性苗.觀察擬南芥幼苗、花、種子中的GUS信號,發(fā)現(xiàn)在正常生長兩周幼苗的葉尖、下胚軸以及生長一周的根部維管組織中GUS信號相對較強(qiáng),而在雄蕊和雌蕊、未成熟的種子以及成熟后的干種子中沒有發(fā)現(xiàn)GUS基因的表達(dá)(圖5),結(jié)果與擬南芥網(wǎng)站芯片數(shù)據(jù)基本一致.DTX6的組織表達(dá)特異性表明DTX6有可能在苗發(fā)育早期參與鎘離子由地下部分向地上部分的長距離運(yùn)輸.

2.5 DTX6蛋白定位于高爾基體

作為轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,DTX6的亞細(xì)胞定位對于解釋其功能非常重要.在酵母中發(fā)現(xiàn)DTX6定位于點狀細(xì)胞器,為了確認(rèn)DTX6的精確亞細(xì)胞定位,我們構(gòu)建了35S啟動子驅(qū)動的DTX6-eGFP以及eYFP-DTX6融合蛋白表達(dá)載體,然后與高爾基體標(biāo)記物(Golgi-mCherry)、線粒體標(biāo)記物(MT-mCherry)、過氧化物體標(biāo)記物(PX-mCherry)共同轉(zhuǎn)化Col-0原生質(zhì)體.通過共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),無論將DTX6放在熒光蛋白的N端還是C端,均顯示同樣的定位信號,信號均出現(xiàn)在點狀細(xì)胞器中,進(jìn)一步的共定位研究發(fā)現(xiàn)DTX6與高爾基體標(biāo)記物存在大部分共定位(圖6(a)，見第396頁),但高爾基標(biāo)記物的熒光信號多于DTX6的信號,表明DTX6可能存在于順式或者反式高爾基體中的一種;DTX6信號與線粒體和過氧化物酶體標(biāo)記物沒有共定位(圖6(b,c)，見第396頁),因此認(rèn)為DTX6存在于高爾基體向其他細(xì)胞器的輸送途徑中,但究竟是在反式高爾基體還是在順式高爾基體中,將有待進(jìn)一步分析.

圖6 擬南芥原生質(zhì)體中的DTX6-eGFP蛋白亞細(xì)胞定位Fig.6 Subcellular localization of DTX6-eGFP in Arabidopsis protoplast(a)、(b)、(c)分別表示激光共聚焦顯微鏡觀察DTX6-eGFP融合熒光蛋白與高爾基體標(biāo)記物(CD3-968)、過氧化物酶體標(biāo)記物(CD3-984)、線粒體標(biāo)記物(CD3-992)共定位的結(jié)果,標(biāo)尺=10μm.

據(jù)此我們認(rèn)為DTX6與定位在細(xì)胞膜上負(fù)責(zé)外排鎘離子的DTX1功能不同,盡管它們在進(jìn)化上關(guān)系比較接近,但功能發(fā)生了分化.dtx6突變體的遺傳表型、DTX6的組織表達(dá)特異性分析以及DTX6的亞細(xì)胞定位結(jié)果表明,DTX6參與了鎘離子在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸,但不參與鎘離子的外排,說明這一分支的MATE蛋白盡管功能有所分化,但仍然對鎘離子具有一定親和力.DTX6突變后表現(xiàn)出對鎘離子的抗性,說明DTX6的存在可能使得細(xì)胞內(nèi)的鎘離子濃度升高,但是DTX6與線粒體和過氧化物酶體不存在共定位,說明DTX6的作用部位可能不是線粒體和過氧化物酶體,而是其他細(xì)胞器.

3 討 論

植物擁有龐大的MATE蛋白家族,模式植物擬南芥MATE蛋白家族共有58個成員.該家族成員近年來被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)參與多種有機(jī)化合物(如生物堿類、類黃酮物質(zhì)、有機(jī)酸類、抗菌化合物等)以及金屬離子的轉(zhuǎn)運(yùn)[31-32],從而對擬南芥的生長發(fā)育、環(huán)境適應(yīng)性、激素以及離子穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)起著十分重要的作用.擬南芥MATE蛋白DTX14的結(jié)構(gòu)已經(jīng)被報道,蛋白由12個跨膜螺旋組成,N端6個跨膜螺旋和C端6個跨膜螺旋蛋白形成V字形的“口袋”構(gòu)象.DTX14和NorM類蛋白在C端存在共同的保守性氨基酸殘基,而在N端不存在保守性,說明擬南芥MATE蛋白C端結(jié)構(gòu)域可能對于毒素的轉(zhuǎn)運(yùn)更加重要[33].

擬南芥MATE轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白DTX1在原核生物中具有外排鎘離子的活性,DTX1所處進(jìn)化樹分支上的同源蛋白還有5個,本研究發(fā)現(xiàn)DTX6的敲除突變體對鎘離子表現(xiàn)抗性,而在酵母中過表達(dá)DTX6則對鎘離子表現(xiàn)敏感,與已報道的DTX1在大腸桿菌中表達(dá)會使得宿主菌抗鎘的表型相反.DTX6主要在下胚軸和根中表達(dá),蛋白定位于高爾基體中,而DTX1主要在花和種子中高表達(dá),蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)膜上[25],二者表達(dá)的組織特異性存在差異,亞細(xì)胞定位也不相同,推測DTX6參與了鎘離子在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸,而DTX1則參與鎘離子的外排.

鎘是對植物毒害作用最大的重金屬元素之一,它與植物必需的金屬元素競爭,嚴(yán)重抑制植物的正常生長,造成農(nóng)作物減產(chǎn)[34],因此對于鎘在植物體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和積累機(jī)理的研究顯得十分重要.鎘的毒性,在于它能使蛋白變性失活,導(dǎo)致氧化還原平衡的破壞和代謝紊亂[35].除了線粒體,葉綠體也是鎘離子攻擊的主要細(xì)胞器,鎘離子可以代替葉綠素分子中的Mg2+,使葉綠素更容易受到損傷,同時影響色素代謝、光合電子傳遞鏈的活性以及與二氧化碳固定相關(guān)的酶的活性,從而嚴(yán)重影響光合作用[36].DTX6基因的突變,可能減少了鎘離子在細(xì)胞內(nèi)的積累和對葉綠體的傷害.

前面我們提到植物中存在一些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族負(fù)責(zé)運(yùn)輸必需金屬元素Fe2+和Mn2+,這些蛋白往往也可以轉(zhuǎn)運(yùn)化學(xué)性質(zhì)相似的鎘離子,因此DTX6在體內(nèi)也可能運(yùn)輸其他陽離子.另外,其缺失引起的抗鎘表型也可能是一個間接的效應(yīng).擬南芥AtNRAMP3和AtNRAMP4主要負(fù)責(zé)從液泡內(nèi)向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)鐵元素從而供應(yīng)葉綠體進(jìn)行正常的光合作用[37].nramp3nramp4雙突變體對鎘脅迫極為敏感,這顯然不是鎘離子從液泡向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移缺陷造成的,而是因為NRAMP的突變造成葉綠體中鐵元素的缺失,而外源施加的鎘離子依然可以對葉綠體造成嚴(yán)重?fù)p害,在雙重作用下造成雙突變體對鎘脅迫敏感[38].這個例子說明植物在重金屬元素脅迫下其表型的內(nèi)在機(jī)制可能比預(yù)料的更為復(fù)雜.目前植物中還沒有專一性的鎘離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,因此我們猜測DTX6轉(zhuǎn)運(yùn)鎘離子可能為其衍生功能,它在體內(nèi)可能另有其底物,這有待于我們進(jìn)一步挖掘DTX6的體內(nèi)功能.