微生物發(fā)酵制備沙棘果漿酵素的研究

王巨成

(山西省林業(yè)科學(xué)研究院，山西 太原 030012)

植物原料經(jīng)微生物發(fā)酵生產(chǎn)的酵素產(chǎn)品有獨(dú)特的口感和風(fēng)味，且酵素含有豐富的超氧化物歧化酶、維他命群、微量元素、核酸、氨基酸、醇和脂類等營養(yǎng)物質(zhì)，是一種高營養(yǎng)、高價(jià)值的優(yōu)質(zhì)飲品。酵素有平衡機(jī)體、消炎抗菌、解酒護(hù)肝和抗氧化、延緩衰老等功能。

沙棘果實(shí)營養(yǎng)豐富，其果實(shí)中含有多種維生素、脂肪酸、微量元素、亞油素、沙棘黃酮、超氧化物等活性物質(zhì)和人體所需的各種氨基酸。其中，維生素C含量極高，每100 g果汁中含量可達(dá)825 mg～1 100 mg，是獼猴桃的2倍～3倍，有維生素C之王的美稱；含糖7.5%～10%，含酸3%～5%.

目前為止，市場(chǎng)上沒有沙棘果泥酵素，也沒有成熟的沙棘果泥酵素生產(chǎn)工藝。在沙棘果粗加工的基礎(chǔ)上，對(duì)沙棘果漿、沙棘果泥接種有益微生物，制備沙棘酵素，開發(fā)標(biāo)準(zhǔn)化酵素發(fā)酵工藝的相關(guān)核心技術(shù)，可為沙棘酵素產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

沙棘原漿(呂梁野山坡食品有限責(zé)任公司沙棘原漿，-20 ℃冷凍保藏)。

酵母菌：安琪葡萄酒·果酒專用酵母SY(安琪酵母股份有限公司)；安琪葡萄酒·果酒專用酵母RW(安琪酵母股份有限公司)。

根霉菌：安琪甜味型甜酒曲(安琪酵母股份有限公司)。

乳酸菌：佰生優(yōu)酸奶發(fā)酵粉(昆山佰生優(yōu)生物科技有限公司)。

1.2 沙棘酵素產(chǎn)品工藝研究

沙棘酵素工藝流程,見圖1.

圖1 沙棘酵素工藝流程

如圖1所示，沙棘原漿以及澄清果汁、果泥沉淀(對(duì)沙棘原漿進(jìn)行5 000 r/min，6 min離心分離)可用作沙棘酵素產(chǎn)品的開發(fā)。原漿是指將沙棘果經(jīng)過打漿均質(zhì)后所得到的沙棘原漿,澄清果汁是指原漿經(jīng)過離心后得到的上層清液，果泥是指原漿經(jīng)過離心后得到的下層果泥沉淀。

1.3 沙棘酵素發(fā)酵條件的優(yōu)化

本試驗(yàn)采用直投式菌，酵母菌、乳酸菌(酸奶發(fā)酵劑)以及根霉菌(酒曲)均從市場(chǎng)購買，菌粉的接種量以及接種溫度均按照所購買菌的產(chǎn)品說明接種。

1.3.1 發(fā)酵菌種選擇的單因素試驗(yàn)

分別將酵母菌、乳酸菌、根霉菌接種于沙棘原漿中，于表1條件下發(fā)酵后進(jìn)行感官評(píng)價(jià)評(píng)分。由10位經(jīng)過訓(xùn)練的專業(yè)人員組成評(píng)價(jià)小組，按照表2的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分，取其平均值作為評(píng)分結(jié)果。結(jié)合感官評(píng)價(jià)得分以及指標(biāo)測(cè)定的結(jié)果，選擇發(fā)酵效果較好的2種菌作為沙棘酵素加工工藝中的接種菌。

表1 不同微生物菌種的接種條件

表2 沙棘發(fā)酵產(chǎn)品感官評(píng)價(jià)

1.3.2 發(fā)酵方式的選擇

對(duì)比酵母菌單菌發(fā)酵、乳酸菌單菌發(fā)酵、酵母菌和乳酸菌的混合菌發(fā)酵3種方式。單菌接種方式和接種量按表1進(jìn)行；混合菌發(fā)酵方式中酵母菌粉的接種量為0.01%，乳酸菌粉接種量為0.1%，在37 ℃條件下發(fā)酵16 h.以上發(fā)酵產(chǎn)品按照表2進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，并進(jìn)行理化指標(biāo)檢測(cè)，進(jìn)而確定較好的發(fā)酵方式。

1.3.3 混合菌發(fā)酵時(shí)間單因素試驗(yàn)

混合菌發(fā)酵的溫度設(shè)定為37 ℃，酵母菌粉的接種量為0.01%，乳酸菌粉的接種量為0.1%.發(fā)酵時(shí)間設(shè)為8 h，16 h，24 h，32 h，40 h時(shí)，定時(shí)取樣，置于-20 ℃冰箱里保存。待取樣結(jié)束后進(jìn)行黃酮含量、可溶性還原糖含量以及總酸含量的測(cè)定，進(jìn)而研究混合菌發(fā)酵時(shí)間對(duì)理化指標(biāo)的影響，并確定沙棘酵素混合菌發(fā)酵方式的最佳時(shí)間。

1.4 指標(biāo)測(cè)定

參照文獻(xiàn)中總酸(以檸檬酸計(jì))含量的測(cè)定方法，采用pH電位法測(cè)定樣品的總酸含量。使用葡萄糖測(cè)定試劑盒(3,5-二硝基水楊酸比色法)測(cè)定樣品的可溶性還原糖含量?？傸S酮含量以異鼠李素計(jì)，樣品的預(yù)處理為移液槍吸取0.5 mL沙棘發(fā)酵液，用70%乙醇溶液稀釋18倍，搖勻備用。樣品溶液中黃酮的測(cè)定步驟，見表3.在50 ℃下超聲3 min，靜置40 min，后在波長405 nm條件下測(cè)定OD值。

表3 沙棘中黃酮的測(cè)定 mL

2 結(jié)果與分析

2.1 沙棘原漿的理化指標(biāo)

沙棘原漿理化指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果，見第11頁表4.

表4 沙棘原漿理化指標(biāo)的測(cè)定

由表4可知，沙棘原漿的密度為1.406 kg/cm3(15 ℃)，pH值為3.5，可溶性還原糖含量為17.2 mg/mL,總酸含量為26.90 g/L,總黃酮含量為7.294 mg/mL.

2.2 沙棘酵素工藝

2.2.1 發(fā)酵菌種對(duì)沙棘原漿感官和總酸含量的影響

在沙棘原漿中添加不同菌種的酵素，在37 ℃條件下發(fā)酵16 h，感官評(píng)價(jià)結(jié)果與總酸(以檸檬酸計(jì))含量見表5.

表5 發(fā)酵菌種對(duì)沙棘原漿酵素產(chǎn)品的影響

從表5中可以看出，根霉菌發(fā)酵的酵素有異味，感官評(píng)價(jià)得分最差。酵母菌和乳酸菌發(fā)酵的酵素感官評(píng)分相差不多，酵母菌與乳酸菌混合菌發(fā)酵的酵素感官評(píng)分最高。酵母菌和乳酸菌混合菌發(fā)酵方式的總酸含量最高，酵母菌單菌發(fā)酵方式的總酸含量最低。綜合感官評(píng)價(jià)與總酸含量表明，發(fā)酵效果較好的2種菌為酵母菌和乳酸菌。

2.2.2 發(fā)酵方式對(duì)沙棘果泥理化指標(biāo)的影響

不同菌種組合方式在37 ℃條件下發(fā)酵16 h，對(duì)沙棘果泥發(fā)酵理化指標(biāo)的影響見表6.

表6 不同菌種組合方式對(duì)沙棘果泥發(fā)酵理化指標(biāo)的影響

如表6所示，沙棘果泥在37 ℃條件下發(fā)酵16 h后，混合菌發(fā)酵方式和乳酸菌單菌發(fā)酵方式可溶性還原糖含量較高，酵母菌單菌發(fā)酵方式的可溶性還原糖含量最低?；旌暇l(fā)酵和乳酸菌單菌發(fā)酵方式的酵素中黃酮含量最高，酵母菌單菌發(fā)酵方式的酵素中黃酮含量最低?？紤]到感官評(píng)價(jià)得分以及對(duì)產(chǎn)品評(píng)測(cè)指標(biāo)的要求，確定沙棘果泥酵素的發(fā)酵方式為酵母菌與乳酸菌混合菌發(fā)酵方式。

2.2.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)沙棘果泥酵素理化指標(biāo)的影響

在37 ℃的條件下，混合菌發(fā)酵時(shí)間對(duì)沙棘果泥酵素理化指標(biāo)的影響見表7.

表7 混合菌發(fā)酵時(shí)間對(duì)沙棘果泥酵素理化指標(biāo)的影響

在37 ℃條件下，沙棘果泥發(fā)酵過程中可溶性還原糖含量變化見圖2.

圖2 沙棘果泥發(fā)酵過程中可溶性還原糖含量變化

如表7和圖2所示，酵母菌和乳酸菌混合菌發(fā)酵，在37 ℃條件下，0 h～30 h可溶性還原糖含量下降趨勢(shì)明顯，尤其在24 h～30 h可溶性還原糖含量下降最快，在這段時(shí)間內(nèi)益生菌繁殖速度最快；30 h后可能趨于平緩，此時(shí)還原糖利用高效充分，利于發(fā)酵產(chǎn)物的形成。因此，在30 h左右發(fā)酵液中的益生菌數(shù)量可能達(dá)到最大值。

在37 ℃條件下，沙棘果泥發(fā)酵過程中總酸含量(以檸檬酸計(jì))變化見第12頁圖3.

如圖3所示，酵母菌和乳酸菌混合菌發(fā)酵，在37 ℃條件下，沙棘酵素發(fā)酵過程中總酸的含量呈波動(dòng)下降趨勢(shì)，但總體變化程度不大。因此，沙棘果泥發(fā)酵時(shí)間對(duì)總酸含量的影響不明顯?？赡苁怯捎谌樗峋l(fā)酵過程中將糖降解為乳酸，而酵母菌可以降解乳酸為CO2.因此，導(dǎo)致發(fā)酵液中的總酸含量沒有很大變化。

圖3 沙棘果泥發(fā)酵過程中總酸含量變化

黃酮(以異鼠李素計(jì))含量標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖4.

圖4 黃酮含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

如圖4所示，總黃酮含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合方程為:

Y=6.913 3x-0.040 3,R2=0.990 9.

在37 ℃條件下，沙棘果泥發(fā)酵過程中黃酮(以異鼠李素計(jì))含量變化見圖5.

圖5 沙棘果泥發(fā)酵過程中黃酮含量變化

如圖5所示，酵母菌和乳酸菌混合菌發(fā)酵，在37 ℃條件下，發(fā)酵過程中的黃酮含量呈波動(dòng)上升的變化趨勢(shì)。在0 h～18 h內(nèi)呈上升趨勢(shì)，18 h～36 h內(nèi)呈下降趨勢(shì)，36 h后呈上升趨勢(shì)，且上升趨勢(shì)明顯，到40 h時(shí)發(fā)酵液中的黃酮含量達(dá)到起點(diǎn)時(shí)的2倍。這可能是由于微生物的代謝分解了黃酮糖苷，增加了游離苷元的含量。

考慮到發(fā)酵液中總酸含量、總黃酮含量、還原糖的利用率，以及對(duì)最終產(chǎn)品的較高期望，最終確定沙棘果泥酵素酵母菌和乳酸菌混合菌發(fā)酵方式的最佳發(fā)酵時(shí)間為40 h.可能是由于菌粉未經(jīng)活化直接進(jìn)行發(fā)酵，或者接種量過低導(dǎo)致發(fā)酵時(shí)間較長。因此,提前活化菌種或者增加接種量可能會(huì)縮短沙棘果泥的發(fā)酵時(shí)間。

3 結(jié)論

1) 沙棘原漿的密度為1.406 kg/cm3(15 ℃)，pH值為3.5，可溶性還原糖含量為17.2 mg/mL,總酸含量為26.90 g/L,總黃酮含量為7.294 mg/mL.

2) 通過單因素試驗(yàn)，確定沙棘酵素發(fā)酵工藝采用酵母菌與乳酸菌混合菌發(fā)酵，酵母菌粉的接種量為0.01%，乳酸菌粉的接種量為0.1%，發(fā)酵條件為37 ℃，發(fā)酵16 h后沙棘酵素所含益生菌總數(shù)為3.5×106CFU/mL，發(fā)酵40 h效果最佳。

本試驗(yàn)以沙棘加工的下腳料沙棘果泥為主要原料，通過發(fā)酵、復(fù)合調(diào)配制成沙棘酵素果凍，提高了沙棘資源的利用率，延伸了沙棘深加工產(chǎn)業(yè)鏈，提高了沙棘的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和資源利用率，應(yīng)用前景廣闊。但國內(nèi)關(guān)于食用酵素的研究較少，所以下一步應(yīng)加強(qiáng)食用酵素相關(guān)檢測(cè)指標(biāo)、功能性、安全標(biāo)準(zhǔn)制定等方面的研究。