超高效液相色譜

王睿 付志成 胡貽椿 毛德倩 楊曉光 陳競 楊麗琛

摘 要：目的：建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）同時測定血清中維生素A、E的方法。方法：取標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液、空白替代血清樣品（4% BSA牛血清白蛋白溶液）各50 μL，經(jīng)硫酸鋅、沉淀劑（甲醇/乙腈=50/50，V/V）沉淀蛋白，振蕩，12 000 r/min離心5 min，取上清，低壓離心揮干，復(fù)溶振蕩，12 000 r/min離心5 min，取上清待測。采用Waters BEH Phenyl色譜（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）分離，以0.1%甲酸-水溶液和0.1%甲酸-甲醇溶液為流動相等度洗脫，電噴霧（ESI）正離子模式、多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）下檢測，內(nèi)標(biāo)法定量。結(jié)果：UPLC-MS/MS檢測血清維生素A、α-維生素E、β-維生素E線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)分別為0.999 3、0.999 3、0.999 7;維生素A、α-維生素E、β-維生素E定量限分別為0.213、0.240、0.070 ng/mL，檢出限分別為0.064、0.072、0.021 ng/mL;維生素A、E在低、高濃度加標(biāo)回收率范圍分別為89.7～107.4、97.6～118.1，RSD分別為2.45%～3.43%、1.48%～5.40%。結(jié)論：本研究建立的人血清維生素A、E超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法靈敏度高、準(zhǔn)確穩(wěn)定、重現(xiàn)性好，對血清中維生素 A 和維生素 E 的測定具很好的的應(yīng)用價值。

關(guān)鍵詞：超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法;維生素A;維生素E;血清

準(zhǔn)確評價人體維生素A、E的營養(yǎng)狀況對于相關(guān)疾病的及早預(yù)防與治療非常重要[1-3]。文獻(xiàn)報道，檢測食品中維生素A、E的方法主要有分光光度法、熒光分析法、高效液相色譜法、雙波電壓法、示波極譜法[4-6]等，國家也分別在2003年、2010年和2016年對食品中維生素A、E的測定出臺及修訂了相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)[7-9]，推薦方法為反相色譜法。人體血液中維生素A、E以多種形式存在，維生素E包括生育酚和三烯生育酚兩類共8種化合物，其中α-生育酚分布最廣、生物活性最高，δ-生育酚抗氧化能力最強(qiáng)。目前，血清中維生素A、E的測定方法主要有高效液相色譜法、質(zhì)譜法、酶免疫測定法等[10-13]。人群血清維生素A篩查方法已經(jīng)建立標(biāo)準(zhǔn)（WS/T 553—2017）[14]。如HIX J[10]等用酶免疫測定視黃醇結(jié)合蛋白，但該方法特異性和靈敏度較差，只能測定視黃醇結(jié)合蛋白而非視黃醇;高效液相色譜法在同時測定維生素A和維生素E時出峰時間長，分離維生素E的四種異構(gòu)體時分離度欠佳，對色譜柱及柱溫有較高要求，且樣本量需求較大，一些小的實(shí)驗(yàn)室或大批量人群檢測很難滿足以上條件[11]。賈妍等[12]建立了液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測方法，但該方法僅實(shí)現(xiàn)了維生素A和維生素E的定量分析，未完成維生素E四種異構(gòu)體的定量分析。

本研究目的基于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（LC-MS/MS法），建立一種分離度好、分離時間短、用血量少的可推廣的血清維生素A、E同時檢測方法，可以準(zhǔn)確快速測定維生素A和維生素E異構(gòu)體含量。

1 材料與方法

1.1 儀器

ACQUITY H-Class超高效液相色譜儀、XEVO TQ-S 串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀、Masslynx質(zhì)譜軟件，均來自美國Waters科技有限公司;電子分析天平（感量0.1mg）;渦旋儀;低速冷凍離心機(jī) KDC-2046，科大創(chuàng)新公司;旋轉(zhuǎn)真空干燥儀，吉艾姆公司;Milipore純水儀，美國密理博公司;微量移液器，德國Eppendorf公司。

1.2 試劑

Retinol-D5同位素標(biāo)記物（Santa Cruz Biotech公司）：純度>98%或經(jīng)國家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì);Alpha-Tocopherol-D6同位素標(biāo)記物（Sigma-Aldrich公司）：純度>98%或經(jīng)國家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì);維生素A標(biāo)準(zhǔn)品（Retinol）和維生素E標(biāo)準(zhǔn)品（α-Tocopherol、β-Tocopherol、γ-Tocopherol ），均購自Sigma-Aldrich公司;LC/MS級甲醇、LC/MS級甲酸、色譜級乙醇、正己烷、乙腈，均購自Merck公司;牛血清白蛋白（BSA）：純度≥99%;七水合硫酸鋅：純度≥99%;超純水：Milipore純水儀制備。

1.3 試劑配制

沉淀劑：甲醇∶ 乙腈（1∶ 1，v/v）;甲酸-水溶液：0.1%;甲酸-甲醇溶液：0.1%;0.07%BHT甲醇溶液（m/v）;BSA溶液：稱取1.6 g BSA溶解至40 mL水中;Retinol標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（0.5 mg/mL）;α-Tocopherol標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（5 mg/mL）;β-Tocopherol標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（0.5mg/mL）。

1.4 溶液配制

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 取Retinol標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液、α-Tocopherol標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液、β-Tocopherol標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液各100 μL，50% 甲醇-水溶液700 μL配制成混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。工作標(biāo)準(zhǔn)液是將混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液逐級稀釋，均用棕色瓶儲存。

1.4.2 內(nèi)標(biāo)工作液 Retinol-d5同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（1 μg/mL）;α-Tocopherol-d6同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（1 μg/mL）;混合同位素內(nèi)標(biāo)溶液：1 μg/mL，用50%甲醇-水溶液配制。

1.5 樣品前處理

取標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液各50 μL，在標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液中分別加入混合同位素內(nèi)標(biāo)溶液20 μL、空白替代血清樣品（4% BSA牛血清白蛋白溶液）50 μL 、4.5%硫酸鋅水溶液10 μL、200 μL沉淀劑（甲醇/乙腈=50/50，V/V），室溫下渦旋振蕩混勻60 s;加入1 mL正己烷，室溫下渦旋振蕩5 min，然后在4 ℃ 12 000 r/min下離心5 min;吸取0.8 mL上清液至1.5 mL離心管中，低壓離心揮干溶劑;用500 μL初始流動相（0.1%甲酸，96%甲醇水溶液）復(fù)溶，渦旋振蕩30 s，繼續(xù)4 ℃ 12 000 r/min下離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶中待UPLC-MS/MS分析。1.6 儀器條件

1.6.1 色譜條件 采用Waters BEH Phenyl色譜柱（柱長100 mm、柱內(nèi)徑2.1 mm、填料粒徑1.7 μm），以0.1%甲酸-水溶液為流動相A、0.1%甲酸-甲醇溶液為流動相B，按照體積比進(jìn)行等度洗脫，A相∶ B相=4∶ 96，流速0.3 mL/min，柱溫20 ℃，進(jìn)樣量2.0 μL。

1.6.2 質(zhì)譜條件 采用多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）、電噴霧（ESI）正離子模式，噴霧電壓4 000 V，離子源溫度400 ℃，氣簾氣152 psi，霧化器氣流7.0 Bar，去溶劑氣1 000L/Hr（表1、附圖）。

1.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

取混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液用甲醇-水溶液（1∶ 1，v/v）逐級稀釋（表2），分別加入20 μL混合同位素內(nèi)標(biāo)溶液、50 μLBSA溶液、10 μL硫酸鋅溶液、沉淀劑200 μL。由于方法前處理過程較為復(fù)雜，為對樣品處理過程中進(jìn)行質(zhì)量控制，在樣品處理前加入同位素內(nèi)標(biāo)，以校正待測物質(zhì)在前處理或儀器進(jìn)樣檢測出現(xiàn)偏差。綜合考慮化合物性質(zhì)及內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的可獲得性，采用性質(zhì)相似的同類物質(zhì)作為對應(yīng)內(nèi)標(biāo)，維生素A對應(yīng)內(nèi)標(biāo)物質(zhì)為Retinol-d5，維生素E對應(yīng)內(nèi)標(biāo)物質(zhì)為α-Tocopherol-d6。液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜分析條件下，將標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液由低濃度到高濃度進(jìn)行進(jìn)樣分析，以維生素A、α-維生素E、β-維生素E的色譜峰與其對應(yīng)的同位素內(nèi)標(biāo)色譜峰的峰面積比值-濃度比值作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液的直線擬合方程，計算其線性相關(guān)系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 液相條件優(yōu)化

本研究對比了Waters ACQUITY HSS PFP色譜柱、Waters Symmetry C18色譜柱和Waters BEH Phenyl色譜柱，后者獲得了更好地分離效果和比較對稱的峰形，特別是對于維生素E的各種化合物的分離效果很好，也解決了之前其他色譜柱拖尾現(xiàn)象。本研究分別選擇了0.1 %甲酸-水溶液與0.1%甲酸-甲醇溶液分別為95∶ 5、96∶ 4、97∶ 3的比例作為流動相，也對比了不同柱溫（20.30、35℃）、流速（0.2、0.3、0.5 mL/min）和進(jìn)樣量（1.0、2.0 μL）對加有內(nèi)標(biāo)的維生素A、E標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行色譜分析，最終選擇峰形最好、保留時間最短的作為此次研究的最終理想色譜條件。

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

本研究采用多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）、電噴霧（ESI）正離子模式，采用自動調(diào)諧優(yōu)化和手動調(diào)諧優(yōu)化相結(jié)合的方式，優(yōu)化DP、CE、EP和CXP，選定對質(zhì)譜響應(yīng)最強(qiáng)的兩個離子對分別作為定量離子對和定性離子對。

2.3 前處理條件優(yōu)化

本研究采用兩步沉淀蛋白，先使用ZnSO4溶液進(jìn)行釋放蛋白結(jié)合物，然后加入1∶ 1甲醇/乙腈溶液進(jìn)行沉淀蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，色譜圖中噪音明顯減少，從而減少雜質(zhì)對目標(biāo)峰的影響。

2.4 方法線性范圍、檢出限和定量限

取混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液用甲醇-水溶液（1∶ 1，v/v）逐級稀釋（表2）。以色譜峰信噪比S/N=3時對應(yīng)的濃度作為方法的檢出限，以色譜峰信噪比S/N=10時對應(yīng)的濃度作為方法的定量限（表3）。

2.5 方法準(zhǔn)確度和精密度

取混合血清做本底，加入兩個水平的標(biāo)準(zhǔn)液，每個濃度水平重復(fù)6份平行樣，低壓離心揮干后，上機(jī)測定，計算其精密度和加標(biāo)回收率（表4）。

3 討論

本研究建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定血清中維生素A、E的方法，該方法對前處理的步驟進(jìn)行了優(yōu)化，使血清中蛋白沉淀的更加徹底，使色譜圖中噪音明顯減少，從而減少雜質(zhì)對目標(biāo)峰的影響，確保了在大批量進(jìn)樣后色譜圖噪音保存不變。本研究對色譜柱種類進(jìn)行了考察，最后選擇BEH Phenyl色譜柱，其能最大限度去除雜質(zhì)分子，擁有更好的分離度和更窄的峰型，使分析物與共流出物更好的分離，以類似物為內(nèi)標(biāo)，消除了基質(zhì)效應(yīng)的影響。另外，本研究方法相較其他方法前處理需要的樣本量更少，最少取樣量可至20 μL，且維生素A、β-維生素E、α-維生素E保留時間分別為1.29、1.79、1.89 min，3 min可完成1個樣本分析，操作安全簡單，檢測高效快速，尤其適合大批量現(xiàn)場或臨床工作的要求。本研究結(jié)果顯示，所測維生素A、E的低、高濃度加標(biāo)回收率范圍分別為89.7～107.4、97.6～118.1，RSD分別為2.45%～3.43%、1.48%～5.40%，具有較好的準(zhǔn)確度和精密度?？傊痉椒ㄇ疤幚砗啽惆踩?，測定靈敏、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，具有線性范圍寬，檢出限和定量限低的優(yōu)點(diǎn)，適用于微量血清中維生素 A 和維生素 E 的定量分析研究?！?/p>

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Abstract：Objective ? To establish a method for simultaneous determination of serum vitamin A and E by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（UPLC-MS/MS）method.Method ? Take 50 μL each of standard series working solution and blank replacement serum sample （4% BSA），after proteins were precipitated by zinc sulfate and precipitant （methanol / acetonitrile = 50/50，V/V），take the supernatant for testing after pre-processing，and then separated by Waters BEH Phenyl （2.1mm×100 mm，1.7 μm）and eluted with the mobile phaes consisted of 0.1% formic acid in water and methanol in a equals program，then analyzed by UPLC-MS/MS with the positive electrospray ionization（ESI+）mode and multiple reaction monitor（MRM）mode，internal standard method for quantification.Result ? UPLC-MS / MS detection of serum vitamin A，α-vitamin E，β-vitamin E had a good linear relationship，the correlation coefficients were 0.999 3，0.999 3 and 0.999 7，respectively.The quantitation limits of vitamin A，α-vitamin E，β-vitamin E were 0.213 ng/mL，0.240 ng/mL and 0.070 ng/mL，respectively，the detection limits of vitamin A，α-vitamin E，β-vitamin E were 0.064 ng/mL，0.072 ng/mL and 0.021 ng/mL.Low and high concentration of vitamin A and vitamin E recovery rate were 89.7～107.4 and 97.6～118.1 respectively，RSD were 45%～3.43% and 1.48%～5.40% .Conclusion ? This proposed method is sensitive，accurate and stable，reproducible，and has very good application value for the determination of vitamin A and vitamin E in serum.

Keywords：UPLC-MS/MS;vitamin A;vitamin E;serum