超高效液相色譜 三重四極桿/復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜測定水樣中三苯甲烷類及代謝物

周巖+趙永剛+張蓓蓓+章勇+陳國松??

摘 要 建立了固相萃?。⊿PE）/超高效液相色譜 三重四極桿/復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜（UPLC MS/MS/MS）同時測定水體中孔雀石綠（MG）、結(jié)晶紫（CV）、亮綠（BG）及其代謝產(chǎn)物隱性孔雀石綠（LMG）和隱性結(jié)晶紫（LCV）5種三苯甲烷類殘留的方法。100 mL水樣過濾后用對甲苯磺酸溶液調(diào)節(jié)pH=4， 經(jīng)MCX陽離子固相萃取柱富集凈化后，采用BEH C18色譜柱，以乙腈 5 mmol/L乙酸銨溶液（含0.02%甲酸）作為流動相進(jìn)行梯度洗脫，采用“桿 阱掃描”（MRM IDA EPI）正離子模式進(jìn)行檢測。5種三苯甲烷類物質(zhì)MG， LCV， BG， LMG和CV在0.02～10 μg/L濃度范圍內(nèi)線性良好（r>0.998），回收率為70.9%～101%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，n=6）為3.4%～11.9%，方法檢出限為0.42～2.2 ng/L，定量限為1.7～8.7 ng/L。本方法快速、靈敏，適用于水體中5種三苯甲烷類殘留物的痕量測定。

關(guān)鍵詞 三苯甲烷類； 超高效液相色譜； 三重四極桿/復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜； 固相萃??； 水樣

1 引言

孔雀石綠（Malachite green，MG）、結(jié)晶紫（Crystal violet，CV）和亮綠（Brilliant green，BG）均為三苯甲烷類染料，因其具有消毒殺菌作用而廣泛用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中。 MG和CV在生物體內(nèi)分別代謝降解產(chǎn)物為隱性孔雀石綠（Leucomalachite green，LMG）和隱性結(jié)晶紫（Leucocrystal violet，LCV）。三苯甲烷類及其代謝物具有較高毒性、致癌、致畸、致突變等特性，在生物體內(nèi)具有較高殘留，對人體危害較大，近年成為水體污染和水產(chǎn)品安全的重點(diǎn)監(jiān)控污染物[1～3]。美國、加拿大和歐盟等國已將MG、CV列為水產(chǎn)養(yǎng)殖禁用藥，許多國家也制定了相關(guān)的法律法規(guī)及檢測措施，愛爾蘭規(guī)定養(yǎng)殖排放水中MG含量不得超過100 μg/L，飲用水中不得超過1.0 μg/L[4，5]。我國于2002年5月將MG列入《食品動物禁用的獸藥及其化合物清單》中，禁止用于所有食品動物中；農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)使用準(zhǔn)則《無公害食品漁用藥物使用準(zhǔn)則》（NY 5071 2002）中也將MG列為禁用藥物；同時嚴(yán)禁在水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用MG和CV，并規(guī)定MG（含LMG）和（含LCV）不得檢出。但由于MG抗菌性效果好，價格低廉，替代品少等原因，仍有少部分養(yǎng)殖用戶違法使用。關(guān)于水產(chǎn)品中的三苯甲烷類物質(zhì)及其代謝物的檢測方法已經(jīng)建立了相應(yīng)的國標(biāo)、行標(biāo)[6～8]，但目前對水環(huán)境中這類殺菌劑并沒有相關(guān)控制限值，存在環(huán)境監(jiān)管盲點(diǎn)，安全隱患較大。三苯甲烷類物質(zhì)分子式見圖1。

目前，三苯甲烷類物質(zhì)的測定多采用液相色譜法（紫外檢測、熒光檢測）或液相色譜 質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)。由于LMG和LCV在紫外可見區(qū)無吸收峰，而MG和CV又無熒光響應(yīng)，故采用高效液相法同時測定這幾類物質(zhì)時常需要借助一定的前處理手段，過程繁瑣且方法檢出限較高（一般為μg/L級）[9～12]。而采用質(zhì)譜法[13～16]檢測相對于液相色譜法而言具有更高的靈敏度和更強(qiáng)定性能力。

目前，對三苯甲烷類的殘留檢測文獻(xiàn)多集中在水產(chǎn)品中的研究，而針對水環(huán)境中這類物質(zhì)的研究很少，并且目標(biāo)化合物的種類也很少[2，11，12，17]，國家尚無相關(guān)控制標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)采用的超高效液相色譜 復(fù)合質(zhì)譜是一種先進(jìn)的新型質(zhì)譜儀器，串聯(lián)四極桿線性離子阱技術(shù)，與普通的液相色譜 三重四極桿串聯(lián)相比極大提高了MS/MS掃描能力，縮短分析時間，建立一種簡單、快速、靈敏的方法同時測定水體中5種三苯甲烷類物質(zhì)， 為進(jìn)一步分析評價生態(tài)環(huán)境中污染情況提供可靠的檢測方法。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

超高效液相色譜ACQUITY UPLC（美國Waters公司）；AB SCIEX QTRAP 5500 質(zhì)譜儀（美國 AB公司）；固相萃取儀（美國 Supelco公司）；固相萃取柱Oasis MCX 150 mg/6 mL（美國 Waters公司），氮吹濃縮儀（美國 Zymark公司）； 0.22 μm聚偏二氟乙烯（PVDF）膜針頭式過濾器（美國 Millipore公司）；Milli Q超純水器（美國 Millipore公司）；渦旋混合器（日本 LMS公司）。

標(biāo)準(zhǔn)品孔雀石綠（MG，純度98.0%）、隱性孔雀石（LMG，純度97.0%）、結(jié)晶紫（CV，純度92.5%）、隱性結(jié)晶紫（LCV，純度99.0%）、亮綠（BG，純度96.0%）、氘代隱性孔雀石（LMG D6，純度98.5%）、氘代結(jié)晶紫（CV D6，純度99.0%）均為德國Dr. Ehrenstorfer公司試劑；氘代孔雀石綠（MG D5，純度99.7%）和氘代隱性結(jié)晶紫（LCV D6，純度99.8%）為德國Witega公司試劑。

乙腈、甲醇、甲酸、乙酸、異丙醇、乙酸銨（色譜純，德國 Merck試劑）；鹽酸羥胺、對甲苯磺酸（純度99%，瑞士 Adamas公司）；實(shí)驗(yàn)用水Millipore超純水（電阻率：18.2 MΩ cm）。

2.2 溶液配制

1000 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確稱?。?0±0.1） mg的MG， LMG， CV， LCV和BG標(biāo)準(zhǔn)品及MG D5， LMG D6， CV D6和LCV D6內(nèi)標(biāo)物，用乙腈分別溶解于10 mL容量瓶中，配制1000 mg/L的儲備液。以上標(biāo)準(zhǔn)溶液避光于4 ℃保存，臨用前稀釋成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

配置成MG D5 ， LMG D6， CV D6和LCV D6的濃度均為100 μg/L的乙腈溶劑，待用。

2.3 色譜條件

ACQUITY UPLCTM BEH C18色譜柱（50 mm ×2.1 mm， 1.7 μm，美國Waters公司）。流動相： 5 mmol/L乙酸銨溶液（0.02%甲酸）（A）和乙腈（B）；采用梯度洗脫模式：0～0.5 min，20% B； 保持；0.5～3.0 min，20%～80% B； 3.0～4.0 min， 80% B；4.0～5.0 min， 20% B。流速0.5 mL/min， 進(jìn)樣體積5 μL；樣品室溫度8 ℃；柱溫：50 ℃；內(nèi)標(biāo)法定量。

2.4 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI），正離子掃描方式，“桿 阱掃描”（MRM IDA EPI）方式。離子化電壓（IS）：5000 V，離子源溫度（TEM）：600 ℃，氣簾氣（CUR）： 276 kPa（40 psi）， 噴霧氣（GS1）：379 kPa（55 psi）， 輔助加熱氣（GS2）： 413 kPa （60 psi）， 碰撞器（CAD）：High。各物質(zhì)離子對優(yōu)化后參數(shù)見表1。

2.5 樣品處理

分別用5 mL乙腈、5 mL 5%甲酸溶液活化MCX固相萃取柱。量取100 mL水樣，加入2 mL 10%鹽酸羥胺溶液防止待測物降解、1 mL 1.0 mol/L對甲苯磺酸溶液（酸化水樣， 并有利于形成離子對[16]）。搖勻后，以約1 mL/min流速將水樣通過小柱，以富集水樣中的三苯甲烷類化合物。上樣后，依次用3 mL丙酮、5 mL乙腈、5 mL水淋洗小柱除雜，用氮?dú)獯祾咝≈?0 min，去除小柱中的水分。最后用10 mL氨水 乙腈（5∶95，V/V）溶液洗脫，收集洗脫液。將洗脫液置于氮吹管中， 用氮吹濃縮儀吹至盡干，用乙腈定容至1.0 mL，加入10 μL 100 μg/L內(nèi)標(biāo)混合溶液， 渦旋振蕩混勻，過0.22 μm PVDF濾膜，置于進(jìn)樣瓶中，待測。3 結(jié)果與討論

3.1 質(zhì)譜條件選擇

采用“桿 阱掃描”（MRM IDA EPI）模式，選擇＼[M+H]+為母離子，再以適當(dāng)?shù)呐鲎材芰繉G， LMG， CV， LCV和 BG及其對應(yīng)同位素內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描，以響應(yīng)相對較強(qiáng)的子離子作為定量離子。詳細(xì)參數(shù)見表1。

三重四極桿/復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜，既保留串聯(lián)四極桿較好選擇性與靈敏度，也可作為線性離子阱增強(qiáng)二級碎片離子定性功能。“桿 阱掃描”（MRM IDA EPI）模式，一次進(jìn)樣可得到用于定量的MRM色譜圖及用于定性的二級質(zhì)譜圖，與常見的三重四極桿掃描模式相比，增強(qiáng)了二級碎片子離子掃描，極大提高了MS/MS的掃描能力，更有利于增強(qiáng)復(fù)雜介質(zhì)中微量目標(biāo)化合物的定性能力。圖2以MG為例，比較了EPI掃描模式與MS/MS子離子掃描模式對比， 10 μg/L MG在EPI掃描模式下，碎片離子響應(yīng)增強(qiáng)近100倍。以MG物質(zhì)為例，定量離子m/z313.1在MRM分析時進(jìn)一步得到的子離子掃描的譜圖，如圖3所示。

由于三苯甲烷類化合物屬于極性分子，選用ESI離子源相比于APCI離子源，離子化效率更高。MG， CV和 BG具有銨離子基團(tuán)，LMG， LCV具有二甲胺基，因此離子化采用正離子ESI源。三苯甲烷類物質(zhì)二級碎片質(zhì)譜圖見圖4。

3.2 色譜條件流動相選擇

目標(biāo)化合物三苯甲烷類物質(zhì)屬于弱堿性物質(zhì)，在超高效液相色譜 質(zhì)譜聯(lián)用中，對于正離子電噴霧掃描模式，流動相在弱酸性環(huán)境條件下加入適量乙酸銨可以提高待測物離子化效率[18]。當(dāng)水相中同時添加乙酸銨和甲酸時，有利于目標(biāo)分析物的分子離子化，目標(biāo)化合物的色譜峰峰形得到極大改善。本實(shí)驗(yàn)考察了流動相乙腈 5 mmol/L乙酸銨（分別含0.01%，0.02%，0.05%，0.10%和0.20%甲酸）對流動相對目標(biāo)化合物的影響。隨著H+濃度增加，其對目標(biāo)分析物的質(zhì)子化作用增強(qiáng)，分析物在流動相中的電離相應(yīng)增加，保留能力降低，同時峰形展寬，響應(yīng)下降。pH值越低，尤其對LCV的峰形影響越大、色譜峰響應(yīng)減弱、峰形變寬拖尾（圖5中列出流動相不同濃度甲酸對LCV物質(zhì)的影響）。當(dāng)甲酸的濃度低于0.02%時，對峰形無影響。根據(jù)峰形、響應(yīng)強(qiáng)度、分離度等因素綜合考慮， 圖5 LCV在不同甲酸濃度下的色譜圖

3.3 內(nèi)標(biāo)物的選擇

實(shí)驗(yàn)表明，三苯甲烷類物質(zhì)對內(nèi)標(biāo)物的要求非常嚴(yán)格，由于三苯甲烷類物質(zhì)本身的不穩(wěn)定及源內(nèi)裂解等一些特性，選用不同的內(nèi)標(biāo)，對各目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性影響顯著。在相同的線性范圍下，選擇不同內(nèi)標(biāo)物所獲得的線性相關(guān)系數(shù)見表2。結(jié)果表明，選擇與自身結(jié)構(gòu)及性質(zhì)盡可能相似的內(nèi)標(biāo)，可以很好地校正因不穩(wěn)定和源內(nèi)裂解產(chǎn)生的誤差問題。內(nèi)標(biāo)物的影響在文獻(xiàn)＼[13]中也有提及。

3.4 固相萃取前處理的條件優(yōu)化

3.4.1 固相萃取柱的選擇 比較了C18、HLB柱和MCX柱對三苯甲烷類物質(zhì)的萃取效率，結(jié)果表明，MCX對三苯甲烷類物質(zhì)有較好的萃取率，而采用C18、HLB柱進(jìn)行萃取時，5種物質(zhì)的回收率較低（10%～50%）。 由于MG， CV， BG屬于堿性離子型化合物，LMG和LCV在酸性溶液中也是離子型化合物， 陽離子交換柱適合堿性離子型化合物的富集與分離，這與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合。

3.4.2 固相萃取柱的活化溶劑的選擇 三苯甲烷類物質(zhì)在酸性條件下易形成陽離子。根據(jù)陽離子固相萃取柱上樣條件，樣品溶液pH值要小于其pKa兩個單位，保證上樣溶液帶正電荷[2]。

本實(shí)驗(yàn)分別用乙腈、水和乙腈、甲酸 水活化固相萃取柱，進(jìn)行比較。結(jié)果表明，如果選用乙腈、純水活化，對于顯性物質(zhì)MG， CV， BG回收率約為65%，而隱性物質(zhì)LMG、LCV回收率則低于50%。而固相萃取柱的活化溶液用酸性溶液酸化后，萃取效率明顯好轉(zhuǎn)，回收率達(dá)到70%以上。所以陽離子交換柱采用酸性溶液活化，上樣水樣調(diào)節(jié)為酸性，有利于陽離子交換柱對目標(biāo)化合物的富集。

三苯甲烷類物質(zhì)極性較大，水樣用離子對試劑對甲苯磺酸酸化，有利于三苯甲烷類物質(zhì)形成離子對，增加提取效率。同時MG、LMG、CV、LCV、BG對光、熱、氧氣敏感，易甲基化、氧化，所以，在樣品提取時加入還原劑鹽酸羥胺[16]，有利于防止待測物的降解。

3.4.3 洗脫溶劑的優(yōu)化 為中和分析物的電荷，陽離子交換柱的洗脫溶液pH值要大于其pKa兩個單位，所以洗脫溶劑采用堿性溶液洗脫。在文獻(xiàn)＼[15，16]基礎(chǔ)上，比較了氨水 乙腈（5∶95，V/V）、氨水 甲醇（5∶95，V/V）、氨水 甲醇 乙酸乙酯（5∶45∶50，V/V）3種洗脫液的洗脫效果（見圖7）。氨水 乙腈（5∶95，V/V）回收率很好；氨水 甲醇（5∶95，V/V）對大部分物質(zhì)回收率低于40%；氨水 甲醇 乙酸乙酯（5∶45∶50，V/V）對BG損失較大，回收率僅30%。最終洗脫溶劑選擇氨水 乙腈（5∶95，V/V）。

3.5 方法的分析性能

3.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限 以各組分的峰面積（y）對濃度（x， μg/L）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，MG， LCV， BG，LMG和CV線性范圍為0.02～10.0 μg/L，質(zhì)量濃度在線性范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，r>0.998。表3列出三苯甲烷類物質(zhì)的線性關(guān)系及相關(guān)系數(shù)。

根據(jù)國家環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)[20]空白實(shí)驗(yàn)未檢出目標(biāo)物質(zhì)的檢出限測定方法，本實(shí)驗(yàn)測定5.0 ng/L 水樣，配制7份平行水樣，水樣體積為100 mL。經(jīng)全過程分析，計(jì)算其濃度的標(biāo)準(zhǔn)偏差s。以3.14 s為檢出限（LOD），4倍檢出限為定量下限（LOQ），5種物質(zhì)的檢出限為0.32～2.18 ng/L（表3），方法具有較高的靈敏度，完全滿足水體中三苯甲烷類的分析測定。

3.5.2 精密度與回收率 方法采用空白水樣加標(biāo)方式，在濃度水平分別為0.5， 1.0和2.0 μg/L的空白加標(biāo)水樣進(jìn)行回收率測定，每個加標(biāo)水樣平行配制6份樣品，其加標(biāo)回收率及精密度結(jié)果見表4。

3.6 實(shí)際樣品的分析

應(yīng)用本方法對南京地區(qū)、常州地區(qū)、蘇州地區(qū)、無錫地區(qū)及太湖流域等不同來源80個點(diǎn)位的地表水、廢水環(huán)境水樣進(jìn)行分析測定。結(jié)果表明，各水域在一定程度上檢出，濃度在ng/L水平。其中物質(zhì)濃度最高的是靠近某化工廠池塘水樣MG的濃度為3.64 ng/L，某化工廠長江廢水排出口CV的濃度為12.5 ng/L。結(jié)果表明，在環(huán)境水域中已存在三苯甲烷類物質(zhì)不同程度的污染。

結(jié)果表明， 本方法具有操作簡便，靈敏度高、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好的特點(diǎn)，適合水質(zhì)監(jiān)測應(yīng)用，且雜質(zhì)干擾少，定性和定量分析更加精確可靠，適合大批量復(fù)雜水樣的分析。

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3.5 方法的分析性能

3.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限 以各組分的峰面積（y）對濃度（x， μg/L）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，MG， LCV， BG，LMG和CV線性范圍為0.02～10.0 μg/L，質(zhì)量濃度在線性范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，r>0.998。表3列出三苯甲烷類物質(zhì)的線性關(guān)系及相關(guān)系數(shù)。

根據(jù)國家環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)[20]空白實(shí)驗(yàn)未檢出目標(biāo)物質(zhì)的檢出限測定方法，本實(shí)驗(yàn)測定5.0 ng/L 水樣，配制7份平行水樣，水樣體積為100 mL。經(jīng)全過程分析，計(jì)算其濃度的標(biāo)準(zhǔn)偏差s。以3.14 s為檢出限（LOD），4倍檢出限為定量下限（LOQ），5種物質(zhì)的檢出限為0.32～2.18 ng/L（表3），方法具有較高的靈敏度，完全滿足水體中三苯甲烷類的分析測定。

3.5.2 精密度與回收率 方法采用空白水樣加標(biāo)方式，在濃度水平分別為0.5， 1.0和2.0 μg/L的空白加標(biāo)水樣進(jìn)行回收率測定，每個加標(biāo)水樣平行配制6份樣品，其加標(biāo)回收率及精密度結(jié)果見表4。

3.6 實(shí)際樣品的分析

應(yīng)用本方法對南京地區(qū)、常州地區(qū)、蘇州地區(qū)、無錫地區(qū)及太湖流域等不同來源80個點(diǎn)位的地表水、廢水環(huán)境水樣進(jìn)行分析測定。結(jié)果表明，各水域在一定程度上檢出，濃度在ng/L水平。其中物質(zhì)濃度最高的是靠近某化工廠池塘水樣MG的濃度為3.64 ng/L，某化工廠長江廢水排出口CV的濃度為12.5 ng/L。結(jié)果表明，在環(huán)境水域中已存在三苯甲烷類物質(zhì)不同程度的污染。

結(jié)果表明， 本方法具有操作簡便，靈敏度高、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好的特點(diǎn)，適合水質(zhì)監(jiān)測應(yīng)用，且雜質(zhì)干擾少，定性和定量分析更加精確可靠，適合大批量復(fù)雜水樣的分析。

References

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3.5 方法的分析性能

3.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限 以各組分的峰面積（y）對濃度（x， μg/L）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，MG， LCV， BG，LMG和CV線性范圍為0.02～10.0 μg/L，質(zhì)量濃度在線性范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，r>0.998。表3列出三苯甲烷類物質(zhì)的線性關(guān)系及相關(guān)系數(shù)。

根據(jù)國家環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)[20]空白實(shí)驗(yàn)未檢出目標(biāo)物質(zhì)的檢出限測定方法，本實(shí)驗(yàn)測定5.0 ng/L 水樣，配制7份平行水樣，水樣體積為100 mL。經(jīng)全過程分析，計(jì)算其濃度的標(biāo)準(zhǔn)偏差s。以3.14 s為檢出限（LOD），4倍檢出限為定量下限（LOQ），5種物質(zhì)的檢出限為0.32～2.18 ng/L（表3），方法具有較高的靈敏度，完全滿足水體中三苯甲烷類的分析測定。

3.5.2 精密度與回收率 方法采用空白水樣加標(biāo)方式，在濃度水平分別為0.5， 1.0和2.0 μg/L的空白加標(biāo)水樣進(jìn)行回收率測定，每個加標(biāo)水樣平行配制6份樣品，其加標(biāo)回收率及精密度結(jié)果見表4。

3.6 實(shí)際樣品的分析

應(yīng)用本方法對南京地區(qū)、常州地區(qū)、蘇州地區(qū)、無錫地區(qū)及太湖流域等不同來源80個點(diǎn)位的地表水、廢水環(huán)境水樣進(jìn)行分析測定。結(jié)果表明，各水域在一定程度上檢出，濃度在ng/L水平。其中物質(zhì)濃度最高的是靠近某化工廠池塘水樣MG的濃度為3.64 ng/L，某化工廠長江廢水排出口CV的濃度為12.5 ng/L。結(jié)果表明，在環(huán)境水域中已存在三苯甲烷類物質(zhì)不同程度的污染。

結(jié)果表明， 本方法具有操作簡便，靈敏度高、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好的特點(diǎn)，適合水質(zhì)監(jiān)測應(yīng)用，且雜質(zhì)干擾少，定性和定量分析更加精確可靠，適合大批量復(fù)雜水樣的分析。

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