降膽固醇益生菌發(fā)酵劑的制備

李大鵬

摘?要：以前期篩選出來的降膽固醇益生菌嗜酸乳桿菌S?59為出發(fā)菌株，對凍干發(fā)酵劑的制備工藝進(jìn)行研究和優(yōu)化。結(jié)果表明：菌懸液的離心收集條件為5 000 r/min、20 min;通過單因素試驗和響應(yīng)面優(yōu)化試驗，確定凍干保護(hù)劑為脫脂乳8.95%、海藻糖5.24%、甘油4.54%，細(xì)胞存活率可達(dá)90.1%。凍干發(fā)酵劑的保藏條件為在真空條件下-4℃保藏。

關(guān)鍵詞：降膽固醇益生菌;真空冷凍干燥;離心;保護(hù)劑;保藏

目前，具有降膽固醇功能的益生菌的研究及功能性食品的開發(fā)主要集中在具有降膽固醇功能的益生菌的篩選、鑒定及體內(nèi)和體外降膽固醇機(jī)理的研究[1?3]，但目前對具有降膽固醇功能的益生菌發(fā)酵劑的制備工藝鮮有研究。在發(fā)酵乳制品中已廣泛使用經(jīng)離心、冷凍、干燥制備的乳酸菌發(fā)酵劑，這種發(fā)酵劑易于保證復(fù)配菌種的比例，可防止菌種失活，可減少雜菌污染和省去菌種擴(kuò)培過程[4]。目前，此類產(chǎn)品在我國及歐美等發(fā)達(dá)國家己得到廣泛研究和應(yīng)用[5]。但未見具有降膽固醇等特殊功能益生菌發(fā)酵劑的生產(chǎn)。本研究以前期篩選具有降膽固醇功能的益生菌嗜酸乳桿菌S?59[6]為出發(fā)菌株，分析凍干菌劑制備過程中的離心條件、凍干保護(hù)劑的種類對菌劑性能的影響，并研究制備的凍干菌劑的保存特性，為降膽固醇功能益生菌發(fā)酵食品的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?菌懸液?嗜酸乳桿菌S?59懸浮液，在優(yōu)化的培養(yǎng)基中和優(yōu)化的條件下制備。

1.1.2?主要試劑?脫脂乳，完達(dá)山牌，市售。甘油、海藻糖，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2?方法

1.2.1?菌懸液離心條件的選擇?將嗜酸乳桿菌S?59在100 mL三角瓶中裝入優(yōu)化的液體培養(yǎng)基中，在最適的培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)后，將培養(yǎng)液移入滅過菌的離心管中，分別在4℃、不同離心條件（轉(zhuǎn)速、時間）下收獲菌體，經(jīng)無菌生理鹽水洗滌2遍后用于活細(xì)胞計數(shù)[7]。

1.2.2?凍干保護(hù)劑的確定

（1）凍干保護(hù)劑的單因素試驗：將培養(yǎng)、離心后制備的嗜酸乳桿菌S?59的菌泥，測定活菌數(shù)N0，按照保護(hù)劑∶菌泥為（w/v）2∶1進(jìn)行配比，充分混勻后，分裝至凍干瓶中，-40℃預(yù)凍6 h，在冷阱溫度-51℃，真空度0.09 MPa下冷凍22～24 h。

分別將脫脂乳配成2%、4%、6%、8%、10%、12%的濃度，將海藻糖配成1%、2%、3%、4%、5%的濃度，將甘油配成1%、2%、3%、4%、5%的濃度，以蒸餾水為空白對照，凍干后將凍干瓶在?20℃保藏48 h后，取出在30℃水浴中解凍后，測定活菌數(shù)N1，計算存活率[8]。

（2）凍干保護(hù)劑的響應(yīng)面法優(yōu)化：根據(jù)單因素試驗結(jié)果設(shè)計三因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

1.2.3?凍干發(fā)酵劑保存性測定?將真空冷凍干燥后的發(fā)酵劑裝入無菌的鋁箔聚酯復(fù)合袋內(nèi)在真空和常壓包裝，分別在-4℃和室溫下保藏2個月和4個月，進(jìn)行活菌計數(shù)。

2?結(jié)果與分析

2.1?離心條件的確定

由表1可以看出，當(dāng)離心轉(zhuǎn)速較低時，4 000 r/min時，細(xì)胞收集過程中有些小細(xì)胞不易被收集，但當(dāng)離心轉(zhuǎn)速較高時，6 000 r/min時，容易導(dǎo)致細(xì)胞的死亡，使活細(xì)胞數(shù)較低，因此，較適宜的離心收集條件為5 000 r/min、20 min。

2.2?凍干保護(hù)劑的確定

2.2.1?凍干保護(hù)劑的單因素試驗

（1）脫脂乳對凍干菌劑細(xì)胞存活率的影響：脫脂乳的成分主要是蛋白質(zhì)和糖類，其水溶液是膠體溶液，其中蛋白質(zhì)的直徑較小，細(xì)菌顆粒處于蛋白質(zhì)分子的包圍之中，可阻止細(xì)胞內(nèi)大的冰晶的形成，有助于保持細(xì)菌活性[9]。由圖1可以看出，當(dāng)脫脂乳濃度小于8%時，隨

著脫脂乳濃度的增加，細(xì)胞存活率顯著增大，當(dāng)脫脂乳濃度大于8%時，隨著脫脂乳濃度的增加，細(xì)胞存活率不再顯著增加，因此，通過單因素確定的脫脂乳適宜濃度為8%。

（2）海藻糖對凍干菌劑活菌數(shù)的影響：海藻糖是一種非還原性雙糖，在蛋白質(zhì)凍干過程中，海藻糖會

填補(bǔ)到因為蛋白質(zhì)失水而產(chǎn)生的空缺當(dāng)中，從而有效地防止微生物及蛋白質(zhì)在凍干過程中發(fā)生的蛋白質(zhì)的變性[10]。由圖2可以看出，海藻糖濃度對細(xì)胞存活率影響顯著，隨著海藻糖濃度的增加細(xì)胞存活率逐漸提高，但當(dāng)海藻糖濃度增加到4%時，隨著海藻糖濃度的增加，細(xì)胞存活率的提高不顯著，因此，通過單因素試驗確定海藻糖適宜濃度為4%。

（3）甘油對凍干菌劑活菌數(shù)的影響：甘油，既能透過微生物的細(xì)胞壁又能透過細(xì)胞膜，在凍干的過程中能通過水合作用使溶液的粘性增加，減弱水的結(jié)晶過程，從而起到保護(hù)細(xì)胞的作用[11]。由圖3可以看出，甘油濃度對細(xì)胞存活率影響顯著，隨著甘油濃度的增加，細(xì)胞存活率逐漸提高，但當(dāng)甘油濃度增加到3%時，隨著甘油濃度的增加，細(xì)胞存活率的提高不顯著，因此，通過單因素試驗確定甘油適宜濃度為3%。

2.2.2?凍干保護(hù)劑的響應(yīng)面優(yōu)化試驗

（1）響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果：以單因素確定的脫脂乳8%、海藻糖4%、甘油3%為中心點，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗（表2、表3）。

（2）回歸分析：由SAS軟件進(jìn)行脊嶺分析，得到保護(hù)劑聯(lián)合使用最大細(xì)胞理論存活率為89.554%，最佳保護(hù)劑配方為脫脂乳8.95%、海藻糖5.24%、甘油4.54%。以最佳保護(hù)劑進(jìn)行3次冷凍干燥試驗，得到平均細(xì)胞存活率為90.1%。

2.2.3?凍干發(fā)酵劑保存性測定?將凍干后的發(fā)酵劑，分別在真空和常壓下包裝，分別在-4℃和室溫下保藏2個月和4個月，進(jìn)行活菌計數(shù)。由表4可以看出，相同的保藏溫度下，真空保藏后發(fā)酵劑中的活菌數(shù)高于常壓保藏，在相同的真空度下，-4℃的低溫保藏后發(fā)酵劑中的活菌數(shù)高于室溫下保藏，因此，確定制備的凍干發(fā)酵劑在真空條件下-4℃保藏。

3?結(jié)論

（1）通過離心轉(zhuǎn)速和時間對細(xì)胞存活率的影響，確定離心收集條件為5 000 r/min、20 min。（2）通過單因素試驗和響應(yīng)面優(yōu)化試驗，確定凍干保護(hù)劑為脫脂乳8.95%、海藻糖5.24%、甘油4.54%，凍干過程中細(xì)胞存活率可達(dá)90.1%。（3）通過對制備的凍干保護(hù)劑保藏條件對細(xì)胞活菌數(shù)的影響，確定了制備的凍干發(fā)酵劑的保藏條件為在真空條件下-4℃保藏。

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Preparation of Fermentation Starter of Probiotics with Cholesterol Lowering Ability

LI Da?peng

（School of Chemistry and Material Engineering，Chaohu University，Hefei 238000，China）

Abstract：Using the probiotics Lactobacillus acidophilus S?59 with cholesterol lowering ability selected in the early as starting strain，the preparation process of the freeze drying fermentation starter was studied and optimized.Results showed that the centrifugal collection conditions of bacterial suspension was 5 000 r/min，20 min.By single factor experiment and response surface optimizing method of strain protective agent in vacuum freeze drying，the optimum protective agent of skimmed milk 8.95%，trehalose 5.24% and glycerin 4.54% was determined.And at these conditions，the cell living rate was reached to 90.1%.The condition store was at -4℃ under the condition of vacuum.

Keywords：probiotics with cholesterol lowering ability;vacuum freeze drying;centrifugal;protective agent;store