人參低聚肽改善老齡db/db小鼠疾病狀態(tài)和延長(zhǎng)壽命的研究

樊蕊 郝云濤 劉欣然 胡佳妮 徐美虹 李勇

摘?要：目的：評(píng)價(jià)人參低聚肽（GOP）改善老齡db/db小鼠血糖水平和延長(zhǎng)壽命的效果。 方法：采用db/db小鼠作為2型糖尿病模型。對(duì)老齡db/db（生長(zhǎng)至70周齡）小鼠攝食量、體重、飲水量和尿量以及血糖水平進(jìn)行測(cè)定，并且對(duì)老齡db/db小鼠存活率進(jìn)行評(píng)價(jià)，表征GOP對(duì)疾病狀態(tài)和壽命的改善效果。結(jié)果：GOP可以降低小鼠體重、攝食量、飲水量和尿量，改善老齡db/db小鼠的生存狀態(tài)，同時(shí)，相比于模型對(duì)照組，GOP可以顯著減少老齡db/db小鼠腎周脂肪指數(shù)和睪周脂肪指數(shù)（P<0.05）。通過(guò)GOP干預(yù)，可以降低老齡db/db小鼠的血糖水平，GOP干預(yù)組AUC為20mmol/（L·h），顯著低于模型對(duì)照組小鼠AUC[50 mmol/（L·h）]。當(dāng)db/db小鼠增長(zhǎng)至80周齡時(shí)，GOP干預(yù)組小鼠存活率為50%，大于模型對(duì)照組存活率（20%）。結(jié)論：GOP干預(yù)小鼠生存質(zhì)量較高，并且壽命較長(zhǎng)，說(shuō)明GOP可以在一定程度上改善老齡db/db小鼠血糖情況，延長(zhǎng)其壽命。本研究為利用GOP開(kāi)展糖尿病的營(yíng)養(yǎng)治療提供了科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：db/db小鼠;老齡;人參低聚肽;血糖;壽命

隨著社會(huì)發(fā)展和人們生活水平的提高，2型糖尿病的患病率逐漸上升，糖尿病并發(fā)癥引起的死亡人數(shù)是繼心腦血管和癌癥后發(fā)達(dá)國(guó)家中的第三位，引起了全球重視[1]。db/db 小鼠的發(fā)病機(jī)制類似于人類 2 型糖尿病，是研究人類 2 型糖尿病的理想動(dòng)物模型[2]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明，人參具有良好的降血糖作用。尚文斌等[3]研究發(fā)現(xiàn)，人參達(dá)到降糖作用是通過(guò)可增加胰島素敏感性、抑制基礎(chǔ)脂分解實(shí)現(xiàn)的。張南等[4]研究證實(shí)，人參與刺加五配伍提取物可促進(jìn)胰島素分泌、改善機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性。低聚肽是指由10個(gè)及以下氨基酸組成的小分子肽，可直接被人體吸收，并且能夠直接參與蛋白質(zhì)的合成，提高機(jī)體對(duì)蛋白質(zhì)的利用率。目前針對(duì)GOP的研究相對(duì)較少，本課題組之前的研究證明GOP具有調(diào)節(jié)血糖的功能[5]，但對(duì)于其改善db/db小鼠的糖尿病以及對(duì)其壽命的延長(zhǎng)并未有所報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以前期實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，采用GOP調(diào)節(jié)血糖的有效劑量對(duì)db/db小鼠進(jìn)行干預(yù)，觀察GOP的降血糖效果，以及延長(zhǎng)db/db小鼠壽命的功效。

目前學(xué)者對(duì)于db/db小鼠生命特征的研究多集中在20周齡以下，而對(duì)于db/db小鼠生命特征和生存質(zhì)量并未見(jiàn)報(bào)道，同時(shí)對(duì)于該模型小鼠的實(shí)際壽命的報(bào)道結(jié)果不一。在對(duì)糖尿病以及糖尿病患者的研究中，糖尿病患者的生存狀態(tài)是研究領(lǐng)域中的關(guān)鍵問(wèn)題和難點(diǎn)問(wèn)題。在目前GOP對(duì)糖尿病小鼠生存狀態(tài)研究空白下，本研究對(duì)db/db小鼠喂養(yǎng)終生，對(duì)其期間的生存狀態(tài)以及生存質(zhì)量予以探析，評(píng)價(jià)其改善db/db小鼠血糖的效果，以期對(duì)充分恰當(dāng)?shù)膽?yīng)用該模型小鼠提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)為開(kāi)展糖尿病的營(yíng)養(yǎng)治療提供新思路和參考。

1?材料與方法

1.1?實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與受試物

選取45只空腹血糖水平≥11.1mmol /L 的db /db 小鼠，按空腹血糖水平隨機(jī)分為3組：1 個(gè)模型對(duì)照組、?1個(gè)陽(yáng)性對(duì)照組[鹽酸二甲雙胍腸溶片225mg /kg·BW]、1 個(gè)GOP干預(yù)組（0.50 g/kg·BW），每組15只。另取15只db /m 小鼠作為正常對(duì)照組，各組小鼠均給予普通飼料，自由飲食、飲水。每天灌胃1次，飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室符合國(guó)標(biāo)清潔級(jí)，溫度（25±1）℃，相對(duì)濕度50%～60%，室內(nèi)照明控制在12 h /12 h 光暗周期節(jié)律。持續(xù)飼養(yǎng)，終生干預(yù)。飼養(yǎng)至70w以后，進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)。

GOP，由吉林肽谷生物工程有限責(zé)任公司提供。GOP為淺黃色固體粉末，利用生物酶解、超濾技術(shù)從人參中分離得到的小分子活性肽的混合物。經(jīng)HPLC?MS分析，混合物中小分子低聚肽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)95%以上。

1.2?儀器

安穩(wěn)血糖儀，三諾公司;安穩(wěn)血糖試紙，三諾公司。

1.3?;指標(biāo)測(cè)定

（1）動(dòng)物一般狀態(tài)觀察及體格指標(biāo)測(cè)定：每周觀測(cè)并記錄動(dòng)物活動(dòng)情況、毛發(fā)光澤、攝食和飲水量、體重。（2）尿液收集：將正常飼養(yǎng)71、75、79、83w的小鼠置于代謝籠中，收集24h 尿液，尿液采集后，立即混勻，測(cè)定體積。（3）脂肪和腓腸肌指數(shù)：各組小鼠飼養(yǎng)臨近至壽命終點(diǎn)時(shí)，小鼠稱重后脫頸椎處死，無(wú)菌快速分離腎周脂肪、睪周脂肪，剝離腓腸肌，稱重;計(jì)算脂肪系數(shù)和腓腸肌系數(shù)。[腓腸肌/脂肪指數(shù)=臟器重（g）/體重（kg）×100%]。（4）隨機(jī)空腹血糖檢測(cè)：每隔4w監(jiān)測(cè)隨機(jī)空腹血糖，測(cè)定前禁食6h，測(cè)定時(shí)剪尾取血，采用血糖儀測(cè)定及記錄。（5）糖耐量實(shí)驗(yàn)觀察指標(biāo)及檢測(cè)：將飼養(yǎng)80w的小鼠在測(cè)定前1d禁食12h（自由飲水），禁食結(jié)束時(shí)灌胃給予葡萄糖溶液（50%質(zhì)量分?jǐn)?shù)），劑量為4μg/g· BW，測(cè)定給葡萄糖后0、0.5、1、2h 的血糖值，并按式（1）計(jì)算血糖曲線下面積。

血糖曲線下面積（AUC）=1/2×（0h 血糖值+0.5h 血糖值）×0.5+1/2×（0.5h 血糖值+1h 血糖值）×0.5+1/2×（1h 血糖值+2h 血糖值）×1（1）

1.4?統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，結(jié)果以±s表示，采用單因素方差分析，差異顯著者進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

2?結(jié)果與分析

2.1?老齡糖尿病小鼠體重和攝食量的變化

由圖1可以看出，老齡db/db小鼠隨著生長(zhǎng)周齡的增加，其攝食量呈現(xiàn)持續(xù)降低的趨勢(shì)，而模型對(duì)照組的小鼠攝食量曲折增加。從整體情況來(lái)看，模型對(duì)照組小鼠的攝食量顯著高于正常對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組和GOP干預(yù)組。老齡db/db小鼠隨著生長(zhǎng)周齡的增加，各組小鼠體重呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。從整體趨勢(shì)來(lái)看，4組小鼠的體重高低順序依次為：模型對(duì)照組>GOP干預(yù)組>陽(yáng)性對(duì)照組>正常對(duì)照組。其中，模型對(duì)照組小鼠的體重顯著高于正常對(duì)照組。

2.2?老齡糖尿病小鼠飲水量和尿量的變化

由表1可知，從整體趨勢(shì)看，干預(yù)期間隨著小鼠周齡的增加，各組小鼠飲水量無(wú)明顯變化，其中模型對(duì)照組小鼠飲水量顯著高于正常對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組和GOP干預(yù)組（P<0.05）。同樣，各組老鼠的尿量的變化情況與飲水量相似，整個(gè)干預(yù)期間，變化量不明顯，但從整體而言，模型對(duì)照組的小鼠尿量顯著高于正常對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組和GOP干預(yù)組（P<0.05），其分別是正常對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組和GOP干預(yù)組的4、2.5、1.5倍。

2.3?老齡糖尿病小鼠脂肪和腓腸肌系數(shù)

由圖2可以看出，模型對(duì)照組小鼠的腎周脂肪和睪周脂肪的指數(shù)均大于正常對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組和GOP干預(yù)組，其中與正常對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而模型對(duì)照組腓腸肌系數(shù)最低，顯著低于模型對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組（P<0.05）。

2.4?老齡糖尿病小鼠血糖變化情況

由表2可以看出，隨著周齡的增加，僅僅模型對(duì)照組小鼠空腹血糖呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，其余組未呈現(xiàn)規(guī)律變化。從整體趨勢(shì)來(lái)看，4組中血糖最高的為模型對(duì)照組，其余各組未呈現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。由圖3a可知，正常對(duì)照組、GOP干預(yù)組和陽(yáng)性對(duì)照組的小鼠灌胃葡萄糖后，血糖呈現(xiàn)先增加會(huì)降低的趨勢(shì)，而僅僅模型對(duì)照組的血糖趨勢(shì)并未呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)，并且模型對(duì)照組血糖水平高于其余3組。通過(guò)圖3b可以看出，各個(gè)組AUC大小依次為：模型對(duì)照組>陽(yáng)性對(duì)照組>GOP干預(yù)組>正常對(duì)照組，并且模型對(duì)照組血糖曲線下面積（AUC）顯著大于正常對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組和GOP干預(yù)組（P<0.05）。

2.5?糖尿病小鼠存活率

由圖4可以看出，隨著小鼠周齡的增加，其存活率下降。當(dāng)小鼠小于79周齡時(shí)，正常對(duì)照組小鼠存活率恒定為100%，GOP干預(yù)組和模型對(duì)照組的存活率雖然有所降低，但降低緩慢，當(dāng)大于81周齡后，正常對(duì)照組小鼠開(kāi)始出現(xiàn)死亡，其存活率始終恒定為80%，而模型對(duì)照組小鼠存活率低于20%，GOP干預(yù)組小鼠的存活率也大幅度下降，氮?dú)馊员Ａ粼?0%左右。綜上發(fā)現(xiàn)，GOP干預(yù)組和陽(yáng)性對(duì)照組小鼠的壽命長(zhǎng)于模型對(duì)照組小鼠，說(shuō)明GOP和二甲雙胍干預(yù)均能一定程度延長(zhǎng)老齡db/db小鼠壽命。

3?討論

db/db 小鼠是美國(guó) Jackson 實(shí)驗(yàn)室在 1966 年從C57BL/6J 小鼠中篩選出的一株突變系，該小鼠突變基因（db）位于 4 號(hào)染色體，由于長(zhǎng)鏈?zhǔn)菟厥荏w Ob/Rb 被替換成了短鏈?zhǔn)菟厥荏w Ob/Ra，導(dǎo)致具有自發(fā)糖尿病特性，純合子（db/db）小鼠是研究人類 2 型糖尿病的理想動(dòng)物模型，其肥胖、高血糖、高血脂和胰島素抵抗等癥狀于出生4w后開(kāi)始出現(xiàn)，隨后血糖持續(xù)升高，直至出現(xiàn)慢性并發(fā)癥和胰島 β 細(xì)胞功能衰竭，10 個(gè)月左右死亡[6?7]。 圖1顯示，模型對(duì)照組小鼠體重顯著高于正常對(duì)照組小鼠，而圖2也可以發(fā)現(xiàn)，模型對(duì)照組腎周脂肪和睪周脂肪含量也顯著高于正常對(duì)照組小鼠。而通過(guò)表1～2也可以看到，模型對(duì)照組小鼠飲水量和尿量顯著高于正常對(duì)照組小鼠，可見(jiàn)即使老齡db/db小鼠仍然具有典型的多飲、多食、多尿、肥胖等癥狀。同時(shí)通過(guò)圖1、表1、圖2可以發(fā)現(xiàn)，通過(guò)干預(yù)，陽(yáng)性對(duì)照組和GOP干預(yù)組的小鼠的體重較模型對(duì)照組有了改善，同時(shí)攝食量、飲水量和尿量也有了明顯的降低，說(shuō)明GOP可以顯著改善db/db小鼠多食、多飲、多尿的癥狀，同時(shí)改善db/db小鼠肥胖的狀態(tài)。

本研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)GOP進(jìn)行干預(yù)，小鼠空腹血糖有所降低，其對(duì)db/db小鼠改善血糖的效果與二甲雙胍相當(dāng)，并且GOP干預(yù)組小鼠的糖耐量顯著改善，其AUC顯著低于模型對(duì)照組小鼠，且效果優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照組。早在1980年，日本學(xué)者Ando[8]從人參中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)14肽，隨后證實(shí)其具有治療糖尿病的效果。國(guó)內(nèi)學(xué)者也得到過(guò)相似結(jié)論，王本祥等[9]通過(guò)研究人參多肽灌胃小鼠，發(fā)現(xiàn)其能降低正常小鼠的血糖和肝糖原。據(jù)推測(cè)，GOP降低血糖的機(jī)制可能與其富含精氨酸相關(guān)，研究表明，精氨酸能有效改善胰島素抵抗及血脂代謝紊亂[10]。

對(duì)于db/db小鼠壽命的報(bào)道，本研究取得了重大突破，文獻(xiàn)報(bào)道，純合子糖尿病小鼠db/db于3～8周齡時(shí)開(kāi)始貪食及發(fā)胖，體重快速增加，屬于肥胖型高血糖糖尿病模型。一般在10個(gè)月內(nèi)死亡，其平均壽命約為?6～8個(gè)月，但也有個(gè)別報(bào)道，其可以活到12月齡[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論db/db小鼠或db/m小鼠，其壽命均顯著長(zhǎng)于文獻(xiàn)報(bào)道的12個(gè)月。本研究發(fā)現(xiàn)，即使不經(jīng)過(guò)任何干預(yù)，自然生長(zhǎng)的db/db小鼠70周齡的生存率為78%。而通過(guò)GOP干預(yù)，其壽命延長(zhǎng)，70周齡的生存率為83%，生長(zhǎng)至80周齡，其存活率仍為50%，顯著高于模型對(duì)照組的生存率19%。劉清秀[12]證實(shí)了紅參蛋白可以延長(zhǎng)果蠅壽命。張婉迎等[13]研究發(fā)現(xiàn)，人參水提物可以顯著延緩果蠅衰老，延長(zhǎng)其壽命。劉光潔等[14]研究發(fā)現(xiàn)，甜菜堿在一定程度上通過(guò)改善脂類代謝紊亂和肝功能來(lái)顯著改善db/db小鼠的衰老進(jìn)程。

綜上所述，GOP可以改善老齡db/db小鼠的血糖及糖耐量，并且在一定程度上延長(zhǎng)其壽命，但是GOP降低血糖的的作用機(jī)制將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中開(kāi)展研究，對(duì)于GOP對(duì)db/db小鼠壽命的延長(zhǎng)機(jī)理值得進(jìn)一步探討?！?/p>

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Improving Effects of Ginseng Oligopeptide on Disease State and Prolonging Life in Aging db/db Mice

FAN Rui，HAO Yun?tao，LIU Xin?ran，HU Jia?ni，XU Mei?hong，LI Yong

（Department of Nutrition and Food Hygiene，School of Public Health，Peking University，Beijing 100191，China）

Abstract：?Objective To get the evaluation of ginseng oligopeptides （GOP）improved blood glucose levels in aging db/db mice and prolong life in older db/db mice. Method We used db/db mice as a type 2 diabetes model.The food intake，body weight，water intake and urine volume，and blood glucose levels of db/db growth to 70 weeks old were measured，and the survival rate of db/db mice was evaluated，which were used to characterize the effects of GOP on the disease state and life span in db/db mice. Result GOP could decrease the body weight，food intake，water intake and urine output of mice，improve the survival status of aging db/db mice，and the perirenal and testis fat index in GOP intervention group were lower than those in the model group （P<0.05）.The blood glucose level of in the GOP intervention group showed the relative lower，and the AUC of the GOP intervention group was 20 mmol/（L·h），which was significantly lower than that of the model control group[50 mmol/（L·h）].When the db/db mice grew to 80 weeks，the survival rate of the GOP intervention group was 50%，which was larger than that in the model control group （20%）. Conclusion The quality of life of GOP intervention mice was higher and the lifespan was longer，which indicated that GOP could improve the blood glucose status and prolong the life of aging db/db mice.This paper provided a theoretical basis for the use of ginseng oligopeptides for the nutritional treatment of diabetes.

Keywords：db/db mice;aging;ginseng oligopeptide（GOP）;blood sugar;life span