頭孢呋辛酯在丙酮溶液中的降解動力學研究

張哲凡 劉寶樹 韓康 張軍立 孫華

摘 要：為了研究頭孢呋辛酯丙酮溶液的穩(wěn)定性，應用高效液相色譜，采用單因素方式考察初始溶液pH值、溫度、氧化劑種類等條件下，頭孢呋辛酯在溶液中的含量隨時間的變化規(guī)律，依據(jù)化學反應動力學方法建立得到了頭孢呋辛酯在不同條件下的降解反應動力學模型，回歸得到了模型參數(shù)、預測半衰期（t1/2）。利用Materials Studio模擬軟件從分子尺度對頭孢呋辛酯的降解機理進行了分析。結果表明：頭孢呋辛酯丙酮溶液的降解符合一級反應動力學;pH值<9.54時頭孢呋辛酯丙酮溶液基本穩(wěn)定，pH值≥9.54時其化學穩(wěn)定性變差，隨著pH值的增大降解速率迅速加快、溶液顏色加深;頭孢呋辛酯丙酮溶液的化學穩(wěn)定性隨溫度的升高而變差。研究結果可為相關產(chǎn)品的生產(chǎn)過程、結晶工藝設計、存儲和應用提供數(shù)據(jù)支撐。

關鍵詞：化學動力學;高效液相色譜;頭孢呋辛酯;穩(wěn)定性;降解

中圖分類號：TQ465.9;R978.1?文獻標識碼：A

文章編號：1008-1542（2020）04-0341-08

doi：10.7535/hbkd.2020yx04007

頭孢呋辛酯，化學名為（6R，7R）-7-[2-呋喃基（甲氧亞氨基）乙酰氨基]-3-氨基甲酰氧甲基-8-氧代-5-硫雜-1-氮雜雙環(huán)[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸，1-乙酰氧基乙酯，CAS No：6544-07-6，結構式見圖1。頭孢呋辛酯易溶于丙酮，略溶于甲醇和乙醇，微溶于乙醚，不溶于水，呈白色或類白色粉末，幾乎無臭[1]。作為頭孢呋辛的前體藥物，頭孢呋辛酯在酯酶作用下水解可以發(fā)揮抗菌療效，具有廣譜、抗菌性強、療效高、副作用小等優(yōu)點。目前臨床上主要用于治療由感染引起的疾病，如呼吸道感染[2]、淋病和尿道感染等[3]。

頭孢呋辛酯主要成分是一對非對映異構體[4]，稱為δ-2異構體;其他雜質(zhì)多為成對非對映異構體，其中主要雜質(zhì)為δ-3異構體，可能來源于原料、合成生產(chǎn)過程及儲存運輸中，結構式見圖2。由構效關系可知，δ-3異構體無生物活性，所以要降低其含量以提高藥物質(zhì)量。

有研究表明，頭孢菌素發(fā)生堿水解或胺解時，通常會生成以7位側(cè)鏈為主的降解產(chǎn)物[5]。頭孢呋辛酯也有類似性質(zhì)，堿性條件會加速其降解。有學者證實：頭孢呋辛酯對光、熱和水分比較敏感[6]，易發(fā)生異構化反應及β-內(nèi)酰胺環(huán)開環(huán)[7-8]，側(cè)鏈易水解，紫外燈照射24 h會產(chǎn)生頭孢呋辛酯E異構體。

已有文獻采用HPLC法研究了頭孢呋辛酯水溶液在254 nm下的光致異構化動力學，結果表明，整體降解是烷氧基亞氨基的異構化與β-內(nèi)酰胺環(huán)的光解之間競爭的結果[9]。在有關頭孢呋辛酯溶液穩(wěn)定性的研究中發(fā)現(xiàn)：頭孢呋辛酯溶液需在配置3 h內(nèi)使用，否則會產(chǎn)生更多的δ-3異構體;溫度會影響溶液的穩(wěn)定性，溫度越高，穩(wěn)定性越差;樣品溶液是否在其穩(wěn)定性范圍內(nèi)進行實驗會影響最終的實驗結果[10]。文獻[11]和文獻[12]報道了運用LC-MS確定原料中所含的8個未知雜質(zhì);還有學者運用HPLC研究了頭孢呋辛酯原料藥的成分，測定了其含量及高分子聚合物的含量等[13-14]。

藥物的化學、物理和生物學3部分基本涵蓋了藥物的穩(wěn)定性內(nèi)容。藥物的穩(wěn)定性見表1。藥物的內(nèi)在結構和客觀的外界環(huán)境等均會對藥物的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響，有學者[15-17]認為可以采用化學反應動力學方法研究藥物的穩(wěn)定性，建立化學反應過程中反應速率與時間的關系，研究影響藥物降解的因素并探討藥物的降解機理以及預測藥物制劑的有效期等。在研究藥物穩(wěn)定性中，藥物有效期通常是指藥物降解10%所需的時間，以t0.9表示。

本文擬通過HPLC分別考察溶液初始pH值、溫度及不同氧化劑對頭孢呋辛酯穩(wěn)定性的影響，得到各個因素下的降解動力學方程，計算其表觀速率常數(shù)，解析不同處理條件下頭孢呋辛酯的降解規(guī)律，為準確測定其濃度或含量、處方設計以及儲存運輸條件提供科學支撐，指導頭孢呋辛酯結晶工藝的研究。

1?實驗部分

1.1?材料

實驗所用頭孢呋辛酯經(jīng)HPLC分析，其純度≥96.77%;甲醇為色譜純;其他試劑均為分析純。

1.2?裝置

實驗降解裝置見圖3，主要由試管、溫度計、恒溫水浴槽及泡沫板組成。

1.3?色譜條件

依據(jù)ChP2015版。

1.4?實驗過程

準確稱量1.000 0 g原料于試管中，向其加入10 mL丙酮并密封好，配制初始濃度c0=0.195 9 mol/L的頭孢呋辛酯丙酮溶液，置于恒溫水浴槽中水浴，向其緩慢滴加稀釋后的酸或堿，用pH計檢測pH值（探究氧化劑對其降解影響時需向溶液中再滴加一定量的氧化劑）。用移液槍定時取樣，先加甲醇，再用流動相稀釋并定容至25 mL，0.45 μm有機膜過濾，得到0 h樣品。借助HPLC分析該條件下頭孢呋辛酯的含量，連續(xù)追蹤40 h內(nèi)的變化趨勢。

1.5?濃度計算方法

依據(jù)物質(zhì)組分的含量與其峰面積成正比來計算不同時刻的取樣濃度，采用式（1）和式（2）進行計算。

2?結果與討論

2.1?初始pH值對頭孢呋辛酯降解的影響

在初始濃度c0=0.195 9 mol/L、溫度T=298.15 K條件下，頭孢呋辛酯隨pH值變化的降解規(guī)律如圖4所示。從圖4可知：頭孢呋辛酯丙酮溶液在pH值<9.54時比較穩(wěn)定，P值基本維持不變，表明該條件下溶液幾乎不發(fā)生降解;pH值=9.54，P值開始減小，表明該條件下溶液開始發(fā)生降解;pH值≥10.76，P值驟降，表明該條件下溶液的降解速率加快，其降解速率遠大于pH值<10.76條件下的降解速率。因此，pH值≥9.54條件下液體藥會失去原有療效，甚至增加藥物毒性?？梢娫诒刑峒冊线^程中須保證pH值<9.54，否則會引入更多雜質(zhì)。

以時間t對-ln c/c0作圖，頭孢呋辛酯殘留濃度隨時間變化的降解規(guī)律如圖5所示。斜率為反應速率常數(shù)k，依次為k9.54=0.012 76 h-1，k10.76=0.015 25 h-1和k11.23=0.031 84 h-1。由圖5可知：在實驗所考察的溫度和pH值范圍內(nèi)，頭孢呋辛酯的降解基本表現(xiàn)為一級反應，即降解速率與濃度的一次方成正比;隨著pH值的升高k值顯著增大，即堿性越強降解速率越快。

pH值對頭孢呋辛酯降解速率常數(shù)k和t0.9的影響如圖6所示。由圖6可知，堿性越強，頭孢呋辛酯丙酮溶液的有效期越短。

圖7是初始溶液pH值=11.23時不同時刻的降解液相圖，經(jīng)HPLC檢測可知，在堿性條件下引入新的雜質(zhì)峰，δ-3雜質(zhì)峰組分的量隨時間的延長逐漸變多。目前普遍認為雙鍵異構是C-3位上的氫受到堿進攻而脫落;雙鍵發(fā)生重排，從2，3位移至3，4位[18-19]。

降解體系的顏色可體現(xiàn)pH值對頭孢呋辛酯降解的快慢。初始溶液pH值<9.54，溶液呈現(xiàn)淡黃色;pH值>9.54，溶液顏色隨pH值的增大逐漸加深，呈現(xiàn)深紅棕色。

2.2?溫度對頭孢呋辛酯降解的影響

選擇初始濃度c0=0.195 9 mol/L，pH值=5.90～11.23，研究頭孢呋辛酯丙酮溶液隨溫度變化的降解規(guī)律。首先在318.15 K，pH值=5.90和7.24條件下進行實驗，溶液濃度隨時間的變化如圖8所示。

由圖8可知，頭孢呋辛酯丙酮溶液在40 h內(nèi)比較穩(wěn)定，溶液依然呈現(xiàn)出透明的淡黃色。因此，沒有進一步研究278.15 K、酸性條件下頭孢呋辛酯在丙酮中的降解規(guī)律。以初始濃度c0=0.195 9 mol/L，pH值=11.23為條件，研究了溫度對頭孢呋辛酯降解速率常數(shù)k的影響，結果見圖9。由圖9可知：隨著溫度不斷升高，頭孢呋辛酯變得越來越不穩(wěn)定，其降解速率常數(shù)lg k呈指數(shù)上升，表明頭孢呋辛酯在該條件下的降解速率比在堿性或加熱條件下更大。因此，在頭孢呋辛酯的生產(chǎn)過程和工藝設計中，須避免溶液處于高溫環(huán)境，否則藥物在短時間內(nèi)會產(chǎn)生更多的雜質(zhì)。

將pH值=11.23下的降解速率常數(shù)k與溫度的關系用Arrhenius方程進行擬合，得到該條件下降解反應的表觀活化能Ea，約為19.79 kJ/mol。

同樣，降解體系的顏色體現(xiàn)了溫度對頭孢呋辛酯降解速率的快慢。相同pH值下，隨著溫度的升高，降解體系的顏色逐漸加深，由淺紅棕色到深紅棕色，最終變?yōu)楹诩t色。

2.3?氧化劑種類對頭孢呋辛酯降解的影響

初始濃度不同的頭孢呋辛酯在H2O2的作用下幾乎不會降解（見圖10），而在

KMnO4和四水過硼酸鈉的作用下，會發(fā)生明顯降解，如圖11、圖12所示。其中KMnO4的降解作用更為明顯。

3?降解機理探析

依據(jù)頭孢呋辛酯丙酮溶液在堿性條件下的液相圖可以看出：出現(xiàn)了2個新的雜質(zhì)峰，δ-3雜質(zhì)含量變多，相對地δ-2異構體含量減少。因此，在該條件下部分δ-2異構體轉(zhuǎn)化為δ-3雜質(zhì)。研究[18-19]表明頭孢呋辛酯在堿性條件下會發(fā)生雙鍵重排，過程機理如圖13所示，但沒有說明具體pH值。因此，應用MS中的DMol3模擬δ-2異構體轉(zhuǎn)化為δ-3雜質(zhì)的機理。

過渡態(tài)理論是1935年由A.G.埃文斯和M.波拉尼提出的，是解釋反應物和生成物之間反應過程的理論[20]。搜索任何一個反應勢能面都需知道反應進程中每一步的結構和能量，尤其是決定反應速率的一步，這就要求確定過渡態(tài)結構。常用的搜索過渡態(tài)結構的方法有線性同步度越（linear synchronous transit，LST）和四極同步度越（quadratic synchronous transit，QST）。

本文使用DMol3模塊中的LST/QST工具搜索δ-2轉(zhuǎn)化為δ-3進程中的過渡態(tài)結構。主要內(nèi)容如下：

1＼*GB3建立反應物和產(chǎn)物的計算模型結構;

2＼*GB3對結構式進行幾何優(yōu)化;

3＼*GB3定義反應物的生成物原子配對;

4＼*GB3用LST/QST方法計算過渡態(tài)。

3.1?建立反應物和產(chǎn)物模型

尋找化學反應過渡態(tài)結構，首先要確定反應物和產(chǎn)物，所以使用MS軟件建立了兩者的球棍模型，如圖14所示。

3.2?幾何優(yōu)化結構

DMol3使用密度泛函理論（DFT）對頭孢呋辛酯的分子結構和能量進行建模。常用泛函理論有GGA，LDA，B3LYP及m-GGA，其中GGA模型下的結果具有最高可靠性。故實驗選取泛函理論GGA下的BP，以此對反應物和產(chǎn)物建模，如圖15所示。再對建模結構進行幾何優(yōu)化，如圖16所示，反應物經(jīng)過48步優(yōu)化結束。由圖17可知，反應物優(yōu)化時對應每一步結構的變化。

3.3?定義原子配對

使用反應預覽功能對反應物和產(chǎn)物中所有原子進行配對，需要在反應物和產(chǎn)物之間建立一條通道。

3.4?用LST/QST的方法計算過渡態(tài)

LST/QST計算結束得到過渡態(tài)結構，如圖18所示。圖19表示過渡態(tài)搜索的進程。

由圖18可知：反應物的雙鍵位置發(fā)生了轉(zhuǎn)移。圖19顯示了LST和CG的路徑坐標變化曲線，LST線監(jiān)測了過渡態(tài)搜索的進程。其中，橫坐標為0時代表反應物，橫坐標為1時代表產(chǎn)物，橫坐標為0.616 55時代表一個過渡態(tài)位置，相應的能量在縱坐標上。

由TS.outmol中的的數(shù)據(jù)可知：反應物能量為-5.632 393×106 kJ/mol，產(chǎn)物能量為-5.632 393×106 kJ/mol，過渡態(tài)能量為-5.632 130×106 kJ/mol，反應能量為1.06 kJ/mol。綜上所述，實現(xiàn)這一過渡態(tài)搜索，可確定過渡態(tài)結構。pH值≥9.54的環(huán)境中，頭孢呋辛酯δ-2異構體形成了不穩(wěn)定的過渡態(tài)，最終轉(zhuǎn)變?yōu)棣?3雜質(zhì)。

4?結?語

頭孢呋辛酯丙酮溶液的降解符合一級反應動力學規(guī)律。在pH值<9.54條件下比較穩(wěn)定;pH值=11.23條件下的降解速率與溫度的關系符合阿侖尼烏斯方程，表觀活化能約為19.79 kJ/mol。頭孢呋辛酯丙酮溶液的降解程度受氧化劑種類的影響。

使用HPLC確定了初始溶液pH值、溫度以及氧化劑種類變化對丙酮溶液中頭孢呋辛酯降解動力學的影響，以優(yōu)化新的生產(chǎn)工藝操作參數(shù)。在頭孢呋辛酯生產(chǎn)過程中，要適當降低溶液溫度，并使溶液盡可能處在pH值<9.54的環(huán)境中。

由HPLC圖可知，頭孢呋辛酯丙酮溶液的降解使δ-3雜質(zhì)變多。采用MS模擬軟件的LST/QST工具搜索得到了δ-2異構體轉(zhuǎn)化為δ-3雜質(zhì)進程中的過渡態(tài)結構，并對部分頭孢呋辛酯的降解機理進行了分子層面的分析。

不同氧化劑對溶液的降解研究還不夠全面，不同氧化劑對初始溶液不同pH值的影響尚未研究，未來將對其進行更加深入的探討。

致謝：感謝天津大學國家工業(yè)結晶工程技術研究中心陳巍博士在MS分子模擬方法的幫助。

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