喹諾酮類抗生素對(duì)兩種水生生物氧化應(yīng)激系統(tǒng)的影響研究

鄭棟赫 楊雷 沈洪艷

摘 要：為探究水生生物受喹諾酮類抗生素影響的作用機(jī)制，選取2種典型的喹諾酮類抗生素——氧氟沙星和諾氟沙星，將斜生柵藻和斑馬魚分別置于其溶液中暴露，在第5，10，15 d，檢測(cè)并比較氧氟沙星和諾氟沙星質(zhì)量濃度為0，30，60，120，360 mg/L時(shí)對(duì)斑馬魚和斜生柵藻體內(nèi)SOD和CAT氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響。結(jié)果表明：喹諾酮類抗生素對(duì)斑馬魚和斜生柵藻SOD活性的影響趨勢(shì)相似，說(shuō)明斑馬魚和斜生柵藻SOD活性受影響的程度基本相同;喹諾酮類抗生素對(duì)斑馬魚和斜生柵藻CAT活性的影響呈現(xiàn)不同趨勢(shì)，說(shuō)明不同水生生物維持體內(nèi)細(xì)胞抗氧化環(huán)境平衡的能力不同;喹諾酮類抗生素對(duì)斑馬魚試驗(yàn)組SOD活性、CAT活性影響的最大值及最小值均高于斜生柵藻試驗(yàn)組，說(shuō)明2種喹諾酮抗生素對(duì)斑馬魚和斜生柵藻SOD活性和CAT抗氧化應(yīng)激反應(yīng)強(qiáng)度的影響存在明顯差異。研究結(jié)果為進(jìn)一步研究喹諾酮類抗生素對(duì)水生生物的生態(tài)毒性效應(yīng)提供了科學(xué)根據(jù)。

關(guān)鍵詞：環(huán)境毒理學(xué);斑馬魚;斜生柵藻;氧氟沙星;諾氟沙星;SOD;CAT

中圖分類號(hào)：X171.5?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008-1542（2020）04-0374-07

doi：10.7535/hbkd.2020yx04011

氧氟沙星（OFXL）和諾氟沙星（NFXL）都屬于喹諾酮類抗生素，普遍用于疾病防治[1]。環(huán)境中的抗生素一方面來(lái)源于工業(yè)污染[2]，另一方面來(lái)源于生活和生產(chǎn)，科研人員對(duì)此進(jìn)行了大量研究。例如，李彥文等[3]檢測(cè)出廣州市蔬菜中含有喹諾酮藥物殘留;章強(qiáng)等[4]發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖業(yè)用于生物體治療的抗生素隨糞便等進(jìn)入了環(huán)境中。在海洋水體環(huán)境[5]、水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)廢水[6]、山東境內(nèi)地表水[7]及深圳河[8]都曾檢出過(guò)喹諾酮類抗生素且處于高濃度水平范圍[9-11]。此外，土壤中的抗生素對(duì)土壤生態(tài)也有著重要影響[12]。

2011年，王荻等[13]研究了諾氟沙星對(duì)鱘魚體內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響。結(jié)果表明，當(dāng)諾氟沙星質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40 mg/kg時(shí)，SOD活性出現(xiàn)最大值。喹諾酮抗生素容易引起動(dòng)物細(xì)胞活性發(fā)生變化[14]，導(dǎo)致人類SOD含量顯著下降[15]?？股厥俏⑸锏拇x產(chǎn)物，對(duì)藻類具有抑制作用和毒性[16-18]。陳柳芳[19]采用不同濃度的氧氟沙星處理斜生柵藻，發(fā)現(xiàn)其半數(shù)致死量均高于50 mg/L，安全質(zhì)量濃度為5 mg/L以下。研究表明，抗氧化防御系統(tǒng)能夠保持機(jī)體內(nèi)自由基的平衡[20-22]，使系統(tǒng)內(nèi)的SOD將氧自由基轉(zhuǎn)化成H2O2和O2[23]?？寡趸烙到y(tǒng)對(duì)于活性氧自由基的清除能力也反映出機(jī)體的生理生化狀況[24]。

SOD活性和過(guò)氧化氫酶（CAT）活性是生物氧化應(yīng)激系統(tǒng)的重要指標(biāo)。本文采用室內(nèi)試驗(yàn)方法，將斜生柵藻和斑馬魚分別置于諾氟沙星和氧氟沙星溶液中暴露，通過(guò)測(cè)定并比較斜生柵藻和斑馬魚SOD活性和CAT活性2項(xiàng)生化指標(biāo)，分析喹諾酮類抗生素對(duì)水生生物氧化應(yīng)激系統(tǒng)的影響。

1?試驗(yàn)材料

1.1?試驗(yàn)生物

斑馬魚，購(gòu)自當(dāng)?shù)厮a(chǎn)市場(chǎng)，平均體長(zhǎng)為（4.0±0.2）cm，平均體質(zhì)量為（0.22±0.03）g，試驗(yàn)前用曝氣3 d的脫氯自來(lái)水馴養(yǎng)斑馬魚7 d，水溫為（25±1）℃，pH值為6.8～7.5。

斜生柵藻（FACHB-13），購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院淡水藻種庫(kù)，采用BG-11型培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，置于人工氣候培養(yǎng)箱中，設(shè)置水溫為（25±1）℃，pH值為6.8～7.5，光照晝夜比為12 h/12 h。

1.2?喹諾酮類抗生素

氧氟沙星，購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，CAS：100986-85-4，純度大于98%;諾氟沙星，購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，CAS：70458-96-7，純度大于98%。

1.3?測(cè)定試劑盒

SOD試劑盒（羥胺法）、CAT可見光試劑盒（可見光法）、蛋白定量測(cè)定試劑盒（考馬斯亮藍(lán)法），均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

2?試驗(yàn)方法

2.1?生物培養(yǎng)

設(shè)置喹諾酮類抗生素的質(zhì)量濃度為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 g/L，試驗(yàn)周期為96 h，探究斑馬魚急性毒性96 h-EC50。利用Origin 8.0軟件對(duì)斑馬魚死亡率進(jìn)行線性擬合，進(jìn)而求得喹諾酮類抗生素對(duì)斑馬魚在不同質(zhì)量濃度的死亡率。

由喹諾酮類抗生素對(duì)斑馬魚的急性致死作用可見，隨著藥物質(zhì)量濃度的增大，斑馬魚死亡率顯著上升。諾氟沙星和氧氟沙星對(duì)斑馬魚的96 h-EC50分別為0.229 g/L和0.427 g/L。結(jié)合本試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，設(shè)置抗生素質(zhì)量濃度為0，30，60，120，360 mg/L。

采用暴露染毒法，將斑馬魚直接暴露在一定質(zhì)量濃度的抗生素脫氯自來(lái)水中。配制抗生素溶液：用0.1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）的鹽酸溶液溶解制備成1 mmol/L的母液，然后用NaOH調(diào)節(jié)pH值為6.8～7.5。隨機(jī)選取生長(zhǎng)健康的斑馬魚分為5組，每組30尾。每組脫氯自來(lái)水4 L，分別設(shè)置0，30，60，120，360 mg/L 5個(gè)濃度組進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)期間不投喂食物。于試驗(yàn)的第5，10，15 d測(cè)定斑馬魚內(nèi)臟團(tuán)中的SOD活性和CAT活性。

在無(wú)菌條件下，將斜生柵藻接種入盛有BG-11培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為3 500 lux，晝夜光照周期為（12 h光照+12 h黑暗），溫度設(shè)置為（25±1）℃，每日定時(shí)人工搖晃4次。配制抗生素溶液：用0.1%鹽酸溶液溶解制備成1 mmol/L的母液，然后用NaOH調(diào)節(jié)pH值為6.8～7.5。將配制完畢的抗生素母液按照一定比例混入斜生柵藻培養(yǎng)基中，分別設(shè)置0，30，60，120，360 mg/L 5個(gè)濃度組進(jìn)行試驗(yàn)。于試驗(yàn)的第5，10，15 d測(cè)定斜生柵藻的SOD活性和CAT活性。

2.2?指標(biāo)測(cè)定

從各試驗(yàn)組取10尾斑馬魚，解剖取出內(nèi)臟團(tuán)，用0.9%生理鹽水清洗，稱重后按質(zhì)量（g）∶體積（mL）=1∶9的比例，加入9倍體積的生理鹽水，并置于勻漿器進(jìn)行充分勻漿，2 500 r/min離心10 min。采用考馬斯亮藍(lán)總蛋白試劑盒測(cè)定斑馬魚內(nèi)臟團(tuán)蛋白質(zhì)的含量，然后分別用SOD試劑盒、CAT可見光試劑盒測(cè)定相應(yīng)指標(biāo)。

取藻液20 mL進(jìn)行離心 （5 000 r/min，5 min），棄去上清液，用PBS緩沖溶液清洗底部藻泥3次。取20 mL藻液，在冰浴條件下使用超聲波進(jìn)行細(xì)胞破碎，單次超聲時(shí)間為5 s，使用2 mm探頭，設(shè)置功率為300 W，破碎時(shí)間為10 min。隨后在低溫條件下進(jìn)行離心（8 000 r/min，10 min）。取上清液，檢測(cè)SOD活性和CAT活性。

2.3?數(shù)據(jù)處理

采用SPSS17.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Origin8.0進(jìn)行作圖處理，結(jié)果以（平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示。其中：*（P<0.05）表示與空白對(duì)照組相比有顯著差異;**（P<0.01）表示與空白對(duì)照組相比有極顯著差異。

3?結(jié)果與分析

3.1?諾氟沙星對(duì)斑馬魚內(nèi)臟團(tuán)及斜生柵藻SOD和CAT的影響

暴露期間，斑馬魚SOD活性出現(xiàn)先誘導(dǎo)后抑制的變化趨勢(shì)（見圖1）。與對(duì)照組相比，最大誘導(dǎo)率為19.7%，試驗(yàn)組呈現(xiàn)極顯著差異（P<0.01）;最大抑制率為36.4%，并呈現(xiàn)極顯著差異（P<0.01）。

斑馬魚CAT活性出現(xiàn)逐漸抑制的趨勢(shì)（見圖2）。與對(duì)照組相比，最大抑制率為30.3%，并呈現(xiàn)極顯著差異（P<0.01）。

暴露期間，斜生柵藻SOD活性出現(xiàn)先誘導(dǎo)后抑制的變化趨勢(shì)（見圖3）。與對(duì)照組相比，最大誘導(dǎo)率為64.9%，試驗(yàn)組呈現(xiàn)極顯著差異（P<0.01）;最大抑制率為19.4%，并呈現(xiàn)極顯著差異（P<0.01）。

斜生柵藻CAT活性出現(xiàn)逐漸誘導(dǎo)的趨勢(shì)（見圖4）。與對(duì)照組相比，最大誘導(dǎo)率為152.6%，并呈現(xiàn)極顯著差異（P<0.01）。

3.2?氧氟沙星對(duì)斑馬魚內(nèi)臟團(tuán)及斜生柵藻SOD和CAT的影響

斑馬魚SOD活性出現(xiàn)先誘導(dǎo)后抑制的變化趨勢(shì)（見圖5）。與對(duì)照組相比，最大誘導(dǎo)率為21.8%，呈現(xiàn)極顯著差異（P<0.01）;最大抑制率為27.5%，并呈現(xiàn)顯著差異（P<0.05）。

斑馬魚CAT活性出現(xiàn)逐漸抑制的趨勢(shì)（見圖6），最大抑制率為26.2%，試驗(yàn)組呈現(xiàn)極顯著差異（P<0.01）。

暴露期間，斜生柵藻SOD活性出現(xiàn)先誘導(dǎo)后抑制的變化趨勢(shì)（見圖7）。與對(duì)照組相比，最大誘導(dǎo)率為124.3%，試驗(yàn)組呈現(xiàn)極顯著差異（P<0.01），最大抑制率為5.27%。

斜生柵藻CAT活性出現(xiàn)逐漸誘導(dǎo)的趨勢(shì)（見圖8）。與對(duì)照組相比，最大誘導(dǎo)率為98.0%，并呈現(xiàn)極顯著差異（P<0.01）。

研究發(fā)現(xiàn)，在試驗(yàn)周期和抗生素質(zhì)量濃度相同的條件下，諾氟沙星對(duì)斑馬魚抗氧化指標(biāo)的影響均大于斜生柵藻，其中斑馬魚CAT活性的最小值大于斜生柵藻CAT活性的最小值，兩者最大值差距15.08倍。氧氟沙星對(duì)斑馬魚抗氧化指標(biāo)的影響均大于斜生柵藻，其中斑馬魚CAT活性的最小值大于斜生柵藻CAT活性的最小值，兩者最大值差距27.38倍。這可能表明喹諾酮類抗生素在藻類和魚類所引起的抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的強(qiáng)度不同。受試生物抗氧化指標(biāo)見表1。

4?討論與分析

隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，諾氟沙星對(duì)斑馬魚內(nèi)臟團(tuán)和斜生柵藻SOD活性的影響均表現(xiàn)為先誘導(dǎo)后抑制的趨勢(shì)，這可能是由于前期受試生物的氧化應(yīng)激系統(tǒng)被激活，從而能適應(yīng)環(huán)境中的諾氟沙星。第15 d，由于諾氟沙星的積累，細(xì)胞受到一定的氧化損傷，無(wú)法清除多余的活性氧并造成SOD活性的降低，使受試生物受到一定的損害[25]。氧氟沙星對(duì)斑馬魚內(nèi)臟團(tuán)和斜生柵藻SOD活性的影響表現(xiàn)為先誘導(dǎo)后抑制的趨勢(shì)。其對(duì)斑馬魚和斜生柵藻氧化應(yīng)激系統(tǒng)的作用效果如下：前期斑馬魚體內(nèi)受到氧氟沙星的影響，產(chǎn)生大量機(jī)體活性自由基激活氧化應(yīng)激系統(tǒng)，SOD活性被誘導(dǎo);后期組織細(xì)胞受到一定氧化損傷，氧自由基過(guò)量積累導(dǎo)致SOD活性被抑制。由此可見，受脅迫的斑馬魚和斜生柵藻SOD的活性變化趨勢(shì)具有一定的相似性，喹諾酮類抗生素對(duì)不同水生生物的抗氧化作用效果可能也相同。

諾氟沙星試驗(yàn)組中斑馬魚CAT活性出現(xiàn)逐漸抑制的趨勢(shì)，試驗(yàn)第15 d時(shí)360 mg/L質(zhì)量濃度組的抑制率為30.3%。CAT能夠清除SOD和機(jī)體長(zhǎng)鏈脂肪酸代謝產(chǎn)生的H2O2[26]，由于SOD誘導(dǎo)率比抑制率低，可能未引起CAT活性的增加;第15 d時(shí)SOD活性抑制效果顯著，產(chǎn)生的H2O2含量降低，從而引起CAT活性降低。氧氟沙星試驗(yàn)組中CAT活性出現(xiàn)逐漸抑制的趨勢(shì)，試驗(yàn)第15 d時(shí)360 mg/L質(zhì)量濃度組的抑制率為26.2%。這可能是在后期SOD活性受到極顯著抑制（P<0.01），使CAT活性逐漸降低的緣故。研究指出，機(jī)體內(nèi)抗氧化酶類如CAT可以反映機(jī)體受損傷的狀態(tài)[27]。本研究中諾氟沙星和氧氟沙星造成斜生柵藻CAT活性上升，表明當(dāng)藻細(xì)胞受到脅迫時(shí)，CAT增多用于清除H2O2，保持藻細(xì)胞抗氧化環(huán)境平衡;但后期斜生柵藻CAT活性沒(méi)有下降，可能是試驗(yàn)期間內(nèi)藻細(xì)胞內(nèi)多余的H2O2未清除完畢，這表明斑馬魚和斜生柵藻受脅迫后氧化應(yīng)激系統(tǒng)中CAT的作用強(qiáng)度有所不同。

5?結(jié)?論

1）喹諾酮類抗生素對(duì)斑馬魚和斜生柵藻SOD活性的影響趨勢(shì)相似，表明喹諾酮類抗生素對(duì)斑馬魚和斜生柵藻SOD活性的影響程度相同。由于斑馬魚和斜生柵藻SOD活性的最大值和最小值出現(xiàn)較大差異，且喹諾酮類抗生素對(duì)斑馬魚SOD活性的影響均高于對(duì)斜生柵藻SOD活性的影響，說(shuō)明喹諾酮類抗生素對(duì)不同水生生物氧化應(yīng)激反應(yīng)的強(qiáng)度存在明顯差異。

2）喹諾酮類抗生素對(duì)斑馬魚和斜生柵藻CAT活性的影響呈現(xiàn)不同趨勢(shì)，其中對(duì)斑馬魚CAT活性的影響有抑制作用，對(duì)斜生柵藻CAT活性的影響有誘導(dǎo)作用，說(shuō)明不同水生生物維持體內(nèi)細(xì)胞抗氧化環(huán)境平衡的能力存在差異。由于喹諾酮類抗生素對(duì)斑馬魚CAT活性最大值和最小值的影響均高于對(duì)斜生柵藻CAT活性的影響，說(shuō)明喹諾酮類抗生素對(duì)不同水生生物氧化應(yīng)激反應(yīng)的強(qiáng)度存在明顯差異。

3）喹諾酮類抗生素對(duì)水生生物氧化應(yīng)激系統(tǒng)的影響過(guò)程非常復(fù)雜，本文僅比較了斑馬魚和斜生柵藻受喹諾酮類抗生素影響的作用機(jī)制，并對(duì)SOD活性和CAT活性的最大值和最小值進(jìn)行了分析。今后將進(jìn)一步采用更加系統(tǒng)全面的分析方法，探究更多種類抗生素對(duì)水生生物氧化應(yīng)激系統(tǒng)的影響。

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