富含莫納可林K 燕麥紅曲的快速發(fā)酵

李堅(jiān)華， 徐 方， 吳佩芝， 胡 婷， 馮艷麗

（1. 湖北師范大學(xué) 食用野生植物保育與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 湖北 黃石435002；2. 湖北師范大學(xué) 生物學(xué)國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，湖北 黃石435002；3. 湖北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 黃石435002）

燕麥?zhǔn)巧贁?shù)同時(shí)具有營(yíng)養(yǎng)、保健和藥用價(jià)值的糧食作物之一。 燕麥富含淀粉、蛋白質(zhì)、膳食纖維、亞油酸、維生素E 和多酚等物質(zhì)[1]。 1997年，美國食品藥品管理局認(rèn)定燕麥為功能性食物，它具有降低膽固醇、平穩(wěn)血糖等功效[2]。 燕麥主要分為2 種，一種是帶稃型的皮燕麥， 另一種是無稃型的裸燕麥。其中裸燕麥的蛋白質(zhì)、脂肪、氨基酸、黃酮等營(yíng)養(yǎng)和功能活性物質(zhì)含量顯著高于皮燕麥[3]。 燕麥中蛋白質(zhì)、油脂和可溶性纖維素含量均居谷物之首，其淀粉含量在50.0%～65.0%之間，比玉米和小麥等所含淀粉更易于糊化，且其含有大量膳食纖維使其具有較高的持水性和膨脹力， 是良好的微生物發(fā)酵基質(zhì)，可用于紅曲菌等的固態(tài)發(fā)酵[4-5]。

紅曲菌（Monascus spp.）是我國具有傳統(tǒng)特色的藥食兩用微生物資源。 紅曲是指將紅曲菌接種于淀粉質(zhì)原料發(fā)酵而成的產(chǎn)品，其成品的顏色多呈赤紅色或紫紅色。 因紅曲菌可發(fā)酵產(chǎn)生多種功能性代謝產(chǎn)物如莫納可林K （Monacolin K，MK）、 紅曲色素（Monascus pigments，MPs）、γ-氨基丁酸、 麥角甾醇等而被廣泛應(yīng)用于食品著色和防腐、 營(yíng)養(yǎng)保健、釀造及醫(yī)藥等領(lǐng)域[6]。MK 可作為HMG-CoA 還原酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，進(jìn)而抑制膽固醇的合成[7]，在調(diào)節(jié)血壓、血脂等方面得到廣泛應(yīng)用[8]。 MPs 是紅曲菌產(chǎn)生的一系列色素的混合物， 它不僅可用作天然著色劑，還具有多種生理功能如抗癌、調(diào)節(jié)血糖、減肥等[6，9]。 目前有關(guān)紅曲發(fā)酵產(chǎn)MK 的研究較多，但普遍存在產(chǎn)量低、周期長(zhǎng)、質(zhì)量不穩(wěn)定、成本高等問題。

目前， 我國燕麥的加工形式主要包括燕麥片、燕麥粉等，對(duì)燕麥的精深加工和綜合利用較少。 雖有部分地區(qū)如臺(tái)灣等地銷售紅曲燕麥片等，但大都以紅曲米為原料添加至燕麥片中制成，而完全利用燕麥為基質(zhì)生產(chǎn)的功能性燕麥紅曲產(chǎn)品極少[10]。 盧穎[11]在燕麥培養(yǎng)基中添加酵母粉、甘油等，研究了燕麥紅曲固態(tài)發(fā)酵中MK、蛋白質(zhì)、多糖、黃酮等物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化，在優(yōu)化后的培養(yǎng)基參數(shù)下發(fā)酵14 d 后MK 產(chǎn)量可達(dá)15.00 mg/g。減少發(fā)酵基質(zhì)中非常規(guī)食用物質(zhì)的添加，是開發(fā)新型功能紅曲的努力方向。

本研究中以裸燕麥 （文中涉及燕麥均指裸燕麥）為原料，以可高產(chǎn)MK 且不產(chǎn)桔霉素的叢毛紅曲菌（Monascus pilosus）MS-1 為實(shí)驗(yàn)菌株，從裸燕麥的預(yù)處理、酸度及微量元素等方面優(yōu)化燕麥紅曲固態(tài)培養(yǎng)基。 在此基礎(chǔ)上，通過添加營(yíng)養(yǎng)因子刺激MK 的產(chǎn)生。 該研究擬在獲得富含MK 燕麥紅曲的基礎(chǔ)上，與已有報(bào)道相比，縮短發(fā)酵周期。 該研究結(jié)果可為燕麥精深加工提供新思路，對(duì)提高功能性紅曲的生產(chǎn)效率也具有借鑒意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株叢毛紅曲菌 （Monascus pilosus）MS-1 （中國典型培養(yǎng)物保藏中心， 編號(hào)CCTCC M 2013295） 是由紅曲產(chǎn)品中分離獲得的可高產(chǎn)MK不產(chǎn)桔霉素的紅曲菌株。

1.1.2 儀器設(shè)備Agilent 1260 高效液相色譜儀：安捷倫科技有限公司產(chǎn)品；UV754N 紫外分光光度計(jì)： 上海儀電分析儀器有限公司產(chǎn)品；Anke TJL-18G-C 離心機(jī)：上海安亭有限公司產(chǎn)品；HZQ-F160振蕩培養(yǎng)箱：哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司產(chǎn)品；BCM-1300A 生物潔凈工作臺(tái)：蘇凈集團(tuán)安泰公司產(chǎn)品；LRH-80 生化培養(yǎng)箱：武漢—恒蘇凈科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；DHG-9070A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥機(jī)：武漢—恒蘇凈科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 試劑及溶液MK 標(biāo)準(zhǔn)品：購于Sigma 公司；常規(guī)試劑乙腈、磷酸、葡萄糖、瓊脂、蛋白胨、無水乙醇、七水硫酸鎂、氯化鈣、七水硫酸鋅、硫酸錳、七水硫酸亞鐵、氫氧化鈉、磷酸二氫銨、冰乙酸和乳酸中除乙腈為色譜純外均為分析純：主要購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基PDA 培養(yǎng)基：土豆200 g/L（煮制成土豆汁，棄去殘?jiān)?，葡萄?0 g/L，瓊脂粉20 g/L；pH 自然， 以每瓶約100 mL 的量分裝至茄形瓶中。于121 ℃滅菌20 min 后擺斜面?zhèn)溆?。此培養(yǎng)基用于紅曲菌的傳代培養(yǎng)。

種子液培養(yǎng)基[12]：葡萄糖80 g/L，蛋白胨10 g/L，NH4H2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L， 無 水CaCl20.1 g/L， 土豆汁替代水溶解試劑；pH 自然， 以每瓶150 mL 的量分裝至500 mL 三角瓶中，121 ℃滅菌20 min 冷卻備用。 此培養(yǎng)基用于制備紅曲菌種子液。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：250 mL 三角瓶的裝樣量為75 g（不包括酸及無機(jī)鹽），燕麥干質(zhì)量50 g，蒸餾水25 g，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要添加酸、無機(jī)鹽等，在121 ℃下滅菌20 min，趁熱打散后備用。 此培養(yǎng)基用于燕麥紅曲固態(tài)發(fā)酵。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 種子液的制備以無菌水將在30 ℃培養(yǎng)10 d的紅曲菌孢子洗下，調(diào)整孢子懸液濃度為106CFU/mL，以10 mL/hg 的接種量將上述孢子懸液接入1.1.4 的種子液培養(yǎng)基中，在30 ℃、120 r/min 培養(yǎng)48 h。

1.2.2 MK 的檢測(cè)將發(fā)酵后的燕麥紅曲于55 ℃烘干12 h，粉碎后充分混勻。 準(zhǔn)確稱取0.3 g 試樣于50 mL 離心管中， 加入10 mL 體積分?jǐn)?shù)75%乙醇。在室溫下超聲提取1 h，靜置10 min，取4 mL 上清液在8000 r/min 離心10 min。 取上清液過0.22 μm濾膜，收集濾液待測(cè)。采用HPLC 法檢測(cè)分析樣品中MK 含量， 其色譜條件為：HPLC 系統(tǒng)為安捷倫1260， 色譜柱：Inertsil ODS-3 （5 μm，4.6 mm×250 mm）。 檢測(cè)波長(zhǎng)為238 nm，流動(dòng)相為乙腈∶水∶體積分?jǐn)?shù)0.5%磷酸＝60∶37∶3（體積比），流速為1 mL/min，柱溫為25 ℃，進(jìn)樣量為20 μL[13-14]。 紅曲樣品中MK質(zhì)量分?jǐn)?shù)的計(jì)算公式為：

式（1）中，A0為酸式MK 峰面積；A1為內(nèi)酯式MK 峰面積；C0為標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度（μg/mL）；I 為稀釋倍數(shù)；A 為標(biāo)準(zhǔn)品峰面積；10 為提取液總體積（mL）；0.3 為稱樣質(zhì)量（g）。

1.2.3 MPs 的檢測(cè)檢測(cè)樣品的預(yù)處理同1.2.2。取上清液1 mL 并用75%乙醇稀釋至合適的濃度后于505 nm 處測(cè)光吸收（OD）值[15]，計(jì)算色價(jià)。 色價(jià)計(jì)算公式為：

式（2）中，M 為稀釋倍數(shù)。

1.2.4 燕麥浸泡時(shí)間對(duì)紅曲菌產(chǎn)MK 的影響根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)得知，以蒸餾水浸泡燕麥8、10、12 h 后，含水質(zhì)量分?jǐn)?shù)基本恒定。 每個(gè)250 mL 三角瓶中分裝50 g 燕麥， 分別用蒸餾水浸泡燕麥8 h 和12 h，瀝干后在121 ℃滅菌20 min 并趁熱打散。將培養(yǎng)好的種子液按10 mL/hg 的接種量接入固態(tài)培養(yǎng)基中，先在30 ℃培養(yǎng)3 d，再調(diào)至25 ℃培養(yǎng)至14 d[12]，分析發(fā)酵產(chǎn)物中MK 的含量，其檢測(cè)方法同1.2.2。

1.2.5 燕麥粉碎處理對(duì)紅曲菌產(chǎn)MK 的影響以未處理的燕麥為對(duì)照， 將燕麥分別粉碎至20 目和10 目。 燕麥紅曲的接種及培養(yǎng)條件同1.2.4，分析發(fā)酵產(chǎn)物中MK 的含量，其檢測(cè)方法同1.2.2。

1.2.6 加水方式對(duì)紅曲菌產(chǎn)MK 的影響在1.2.5實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，設(shè)置固體培養(yǎng)基加水方式分別為滅菌前、后各加質(zhì)量分?jǐn)?shù)16.67%的水分和滅菌前一次加質(zhì)量分?jǐn)?shù)33.34%的水分，燕麥紅曲的接種及培養(yǎng)條件同1.2.4， 分析發(fā)酵產(chǎn)物中MK 的含量，其檢測(cè)方法同1.2.2。

1.2.7 滅菌前加水質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)紅曲菌產(chǎn)MK 的影響在1.2.6 的基礎(chǔ)上， 將固體培養(yǎng)基滅菌前加水質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別調(diào)整為16.67%、20.00%、23.33%、26.67%、30.00%， 經(jīng)滅菌后將各培養(yǎng)基的加水質(zhì)量分?jǐn)?shù)補(bǔ)足至33.34%。燕麥紅曲的接種及培養(yǎng)條件同1.2.4，分析發(fā)酵產(chǎn)物中MK 的含量，其檢測(cè)方法同1.2.2。

1.2.8 乳酸、 冰乙酸添加量對(duì)紅曲菌MK 的影響在1.2.7 的基礎(chǔ)上， 在固態(tài)培養(yǎng)基中分別加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL/hg 的乳酸、冰乙酸，滅菌和發(fā)酵培養(yǎng)方法同1.2.4。檢測(cè)紅曲發(fā)酵產(chǎn)物中MK 的含量，具體檢測(cè)方法1.2.2。 為比較冰乙酸和乳酸的穩(wěn)定性，用pH 計(jì)測(cè)定培養(yǎng)基提取液的pH，并采用酸堿滴定的方法測(cè)定培養(yǎng)基中乳酸、 冰乙酸含量。以0.1 g/dL 酚酞溶液為指示劑， 用0.1 mol/L 的NaOH 溶液滴定滅菌前后樣品提取液。

乳酸、冰乙酸酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的計(jì)算公式：

式中：X 為每千克樣品中總酸的克數(shù)，g/kg；C 為氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度，mol/L；V1為滴定試液時(shí)消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積，mL；V2為空白試驗(yàn)消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積，mL；V3為樣品稀釋液總體積，mL；V4為滴定時(shí)吸取的樣液體積，mL；m 為樣品質(zhì)量，g；K 為酸的換算系數(shù) （乳酸：0.090；冰乙酸：0.060）

1.2.9 金屬離子對(duì)紅曲菌產(chǎn)MK 的影響在1.2.8的基礎(chǔ)上， 在固態(tài)培養(yǎng)基中分別添加0.007 mol/kg的ZnSO4·7H2O、MgSO4·7H2O、MnSO4、FeSO4·7H2O和CaCl2，燕麥紅曲的接種及培養(yǎng)條件同1.2.4，分析發(fā)酵產(chǎn)物中MK 的含量，其檢測(cè)方法同1.2.2。

1.2.10 鎂離子添加量對(duì)紅曲菌產(chǎn)MK 的影響在1.2.9 的基礎(chǔ)上，將固體培養(yǎng)基中MgSO4·7H2O 的添加量分別調(diào)整為0、0.002、0.007、0.012、0.017、0.022 mol/kg，燕麥紅曲的接種及培養(yǎng)條件同1.2.4，分析發(fā)酵產(chǎn)物中MK 的含量，其檢測(cè)方法同1.2.2。

1.2.11 大豆分離蛋白添加量對(duì)紅曲菌產(chǎn)MK 的影響在1.2.10 的基礎(chǔ)上，將固體培養(yǎng)基中的大豆分離蛋白分別調(diào)整為0%、1%、2%、3%、4%、5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），燕麥紅曲的接種及培養(yǎng)條件同1.2.4，分析發(fā)酵產(chǎn)物中MK 的含量，其檢測(cè)方法同1.2.2。

1.2.12 發(fā)酵時(shí)間對(duì)紅曲菌產(chǎn)MK 和MPs 的影響在1.2.11 優(yōu)化得到的固體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，監(jiān)測(cè)發(fā)酵32 d 內(nèi)紅曲菌產(chǎn)MK 和MPs 的變化趨勢(shì)，以發(fā)酵5 d 為取樣起始天數(shù)，間隔3 d 取樣。 燕麥紅曲的接種及培養(yǎng)條件同1.2.4，發(fā)酵產(chǎn)物中MK 和MPs 的檢測(cè)方法同1.2.2 和1.2.3。

2 結(jié)果與分析

2.1 燕麥浸泡時(shí)間對(duì)紅曲菌產(chǎn)MK 的影響

預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，燕麥浸泡8、10 h 及12 h 時(shí)，其含水質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（32.85±0.07）%，說明浸泡8 h 時(shí)燕麥的吸水量已達(dá)到飽和。 因水分在燕麥組織中的分布及存在狀態(tài)可隨浸泡時(shí)間的長(zhǎng)短而改變，探究燕麥含水量達(dá)到飽和后， 浸泡時(shí)間對(duì)燕麥紅曲MK產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖1 所示。

圖1 浸泡時(shí)間對(duì)紅曲菌產(chǎn)MK 的影響Fig. 1 Effects of soaking time on MK production by Monascus spp.

由圖1 可知，浸泡8 h 與12 h 的燕麥，經(jīng)發(fā)酵14 d 后MK 產(chǎn)量無顯著差異（p＞0.05），表明燕麥吸水量達(dá)到飽和后，浸泡時(shí)間對(duì)紅曲菌產(chǎn)MK 沒有影響。 此外，嘗試在浸泡液中添加冰乙酸、金屬離子等，發(fā)現(xiàn)MK 產(chǎn)量偏低，即MK 的最高產(chǎn)量不超過5 mg/g（數(shù)據(jù)未列出），且發(fā)酵所得的燕麥紅曲米心呈乳白色。 表明紅曲菌只沿物料表面生長(zhǎng)，不能充分利用粒狀燕麥。 故在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，將對(duì)燕麥基質(zhì)進(jìn)行適當(dāng)?shù)姆鬯樘幚怼?/p>

2.2 燕麥粉碎處理對(duì)紅曲菌產(chǎn)MK 的影響

為探究粉碎度對(duì)燕麥紅曲固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK 的影響，對(duì)燕麥進(jìn)行不同細(xì)度的粉碎處理后進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，結(jié)果如圖2 所示。 對(duì)燕麥進(jìn)行粉碎處理可顯著促進(jìn)紅曲菌發(fā)酵產(chǎn)MK（p＜0.05），其中粉碎度為20 目時(shí)效果最好，MK 產(chǎn)量最高可達(dá)7.95 mg/g，比對(duì)照提升了1.59 倍。這是由于粉碎處理增大了紅曲菌與物料的接觸面積， 同時(shí)有利于燕麥淀粉的糊化，但粉碎細(xì)度過小會(huì)使基質(zhì)不易被打散（預(yù)實(shí)驗(yàn)中粉碎粒度小于20 目時(shí)滅菌后培養(yǎng)基質(zhì)難以打散，數(shù)據(jù)未列出）。 故選擇粉碎度為20 目的燕麥進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 粉碎度對(duì)紅曲菌產(chǎn)MK 的影響Fig. 2 Effects of crushing degree on MK production by Monascus spp.

2.3 加水方式對(duì)紅曲菌產(chǎn)MK 的影響

在2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上， 考察固體培養(yǎng)基的加水方式即分2次加水或1次加水對(duì)紅曲菌產(chǎn)MK的影響，結(jié)果如圖3 所示。

圖3 加水方式對(duì)紅曲菌產(chǎn)MK 的影響Fig. 3 Effects of water adding mode on MK production by Monascus spp.

由圖3 可知，加水方式對(duì)MK 產(chǎn)量無顯著影響（p＞0.05），其平均產(chǎn)量均為8 mg/g 左右。 但在固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，1次加水的燕麥固體培養(yǎng)基因結(jié)塊而不能被充分打散，這在一定程度上減少了基質(zhì)內(nèi)氣體交換并導(dǎo)致熱量積累，菌體僅在物料表面生長(zhǎng)，原料利用率低[16]。 2 種加水方式所得MK 產(chǎn)量相當(dāng)，主要與燕麥的糊化程度有關(guān)，即1次加水的培養(yǎng)基因含水質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高使其糊化程度較好。故繼續(xù)考察滅菌前加水質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)紅曲菌產(chǎn)MK的影響。

2.4 滅菌前加水質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)紅曲菌產(chǎn)MK 的影響

根據(jù)滅菌后物料疏松或結(jié)塊對(duì)紅曲發(fā)酵的影響，在保證燕麥基質(zhì)不結(jié)塊的前提下，探究滅菌前加水質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)紅曲菌產(chǎn)MK 的影響， 結(jié)果如圖4所示。

圖4 滅菌前加水質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)紅曲菌產(chǎn)MK 的影響Fig. 4 Effects of water addition on MK production by Monascus spp. before sterilization

由圖4 可知，在保證培養(yǎng)基均能被打散的前提下， 當(dāng)滅菌前加水質(zhì)量分?jǐn)?shù)從16.67%增加至30%時(shí)， 燕麥紅曲中MK 質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，加水質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為23.33%、26.67%和30%時(shí)MK產(chǎn)量下降最顯著（p＜0.05）。 滅菌前燕麥固體培養(yǎng)基加水量過高，易造成培養(yǎng)基質(zhì)結(jié)塊，進(jìn)而影響通氧量，不利于紅曲菌的生長(zhǎng)及MK 的產(chǎn)生。結(jié)合2.3 和2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別在固體培養(yǎng)基滅菌前、后各加質(zhì)量分?jǐn)?shù)16.67%的水分進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.5 乳酸、冰乙酸添加量對(duì)紅曲菌產(chǎn)MK 的影響

培養(yǎng)基的初始pH 可影響紅曲菌生長(zhǎng)及代謝[12]。 在2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，探究乳酸及冰乙酸的添加量對(duì)燕麥紅曲固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK 的影響，結(jié)果如圖5 所示。

由圖5 可知，不同添加量的冰乙酸及乳酸對(duì)紅曲菌產(chǎn)MK 無顯著影響（p＞0.05）。 當(dāng)乳酸添加量為0.6 mL/hg 時(shí)MK 的產(chǎn)量最高， 可達(dá)10.27 mg/g，比對(duì)照提高25.31%。 與對(duì)照相比無顯著差異，主要與實(shí)驗(yàn)的平行性相對(duì)較差有關(guān)。

圖5 冰乙酸和乳酸質(zhì)量濃度對(duì)紅曲菌產(chǎn)MK 的影響Fig. 5 Effects of acetic acid and lactic acid concentrations on MK production by Monascus spp.

此外， 分析滅菌前后固體培養(yǎng)基的pH 值及冰乙酸和乳酸含量的結(jié)果表明，添加冰乙酸的培養(yǎng)基滅菌后pH 值及冰乙酸含量均降低， 而滅菌對(duì)培養(yǎng)基中乳酸影響不大， 表明乳酸穩(wěn)定性比冰乙酸好。大量研究表明，紅曲菌偏愛乳酸[17]，且紅曲菌生長(zhǎng)速度相對(duì)較慢，發(fā)酵初期添加酸，利于抑制雜菌生長(zhǎng)。故選擇添加0.6 mL/hg 乳酸進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.6 金屬離子對(duì)紅曲菌產(chǎn)MK 的影響

金屬離子是微生物細(xì)胞中各種酶的活性成分，在微生物生長(zhǎng)代謝過程中具有調(diào)節(jié)并維持細(xì)胞的滲透壓、保持氧化還原電位等作用。 考察了金屬離子對(duì)燕麥紅曲固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK 的影響， 結(jié)果如圖6所示。

圖6 金屬離子對(duì)紅曲菌產(chǎn)MK 的影響Fig. 6 Effects of metal ions on MK production by Monascus spp.

由圖6 可知，添加Mg2+的燕麥紅曲MK 產(chǎn)量最高，可達(dá)13.53 mg/g，比對(duì)照提高了26.06%。 Mg2+作為微生物生長(zhǎng)所需的微量元素，不僅是微生物細(xì)胞的成分，也是細(xì)胞內(nèi)多種酶的活性激活劑[10]。故繼續(xù)探究Mg2+的添加量對(duì)紅曲菌發(fā)酵燕麥產(chǎn)MK 的影響。

2.7 鎂離子添加量對(duì)紅曲菌產(chǎn)MK 的影響

在2.6 實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上， 探究Mg2+添加量對(duì)燕麥紅曲固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK 的影響， 結(jié)果如圖7 所示。當(dāng)Mg2+添加量為0.007 mol/kg 和0.017 mol/kg 時(shí)均可顯著促進(jìn)紅曲菌產(chǎn)MK（p＜0.05），而Mg2+添加量為0.007 mol/kg 時(shí)MK 產(chǎn)量最大。 故選擇0.007 mol/kg為Mg2+的最適添加量。

圖7 鎂離子添加量對(duì)紅曲菌產(chǎn)MK 的影響Fig. 7 Effects of Mg2 + addition on MK production by Monascus spp.

2.8 大豆分離蛋白對(duì)紅曲菌產(chǎn)MK 的影響

本課題組前期研究結(jié)果表明，在以大米為基質(zhì)的固體培養(yǎng)基中添加大豆分離蛋白可顯著促進(jìn)紅曲菌產(chǎn)MK（數(shù)據(jù)未列出）。 為在相同發(fā)酵周期內(nèi)獲取更高的MK 產(chǎn)量，在優(yōu)化后的裸燕麥培養(yǎng)基中添加大豆分離蛋白，考察大豆分離蛋白添加量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）對(duì)紅曲菌產(chǎn)MK 的影響，結(jié)果如8 所示。

圖8 大豆分離蛋白添加量對(duì)紅曲菌產(chǎn)MK 的影響Fig. 8 Effects of soybean protein isolate on MK production by Monascus spp.

由圖8 可知， 隨著大豆分離蛋白添加量的增加，MK 的產(chǎn)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。 其中，當(dāng)大豆分離蛋白添加量為2%時(shí)MK 產(chǎn)量比對(duì)照提高32.63%。結(jié)果表明，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%大豆分離蛋白可促進(jìn)紅曲菌產(chǎn)MK， 即有望通過添加大豆分離蛋白，在較短的發(fā)酵周期獲取較高的MK 產(chǎn)量。

2.9 發(fā)酵時(shí)間對(duì)紅曲菌產(chǎn)MK 和MPs 的影響

在優(yōu)化后的燕麥固體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，考察發(fā)酵32 d 內(nèi)燕麥紅曲中MPs 及MK 含量的變化趨勢(shì)，結(jié)果如圖9 所示。

圖9 發(fā)酵時(shí)間對(duì)紅曲菌產(chǎn)MPs 和MK 的影響Fig. 9 Effects of fermentation time on MK and MP production by Monascus spp.

由圖9（a）可知，在發(fā)酵前17 d，MK 的產(chǎn)量逐漸上升，其中發(fā)酵至11 d 與2.8 中未添加大豆分離蛋白 （對(duì)照） 發(fā)酵14 d 時(shí)MK 的產(chǎn)量相同， 均為13.45 mg/g， 而添加大豆分離蛋白后發(fā)酵14 d 可達(dá)19.77 mg/g。 由此可知，添加大豆分離蛋白，燕麥紅曲中MK 產(chǎn)量達(dá)13.45 mg/g 可比未添加時(shí)的樣品縮短3 d 發(fā)酵周期。 發(fā)酵至17～23 d，MK 產(chǎn)量先下降后上升，但變化不顯著（p＞0.05）。發(fā)酵至26 d 時(shí)MK的產(chǎn)量最高，達(dá)41.85 mg/g，而后呈下降趨勢(shì)，發(fā)酵至32 d 時(shí)MK 產(chǎn)量為30.53 mg/g。 由圖9（b）可知，與MK 的變化趨勢(shì)類似，在發(fā)酵過程中MPs 產(chǎn)量呈現(xiàn)2次先升后降趨勢(shì)，推測(cè)紅曲菌在發(fā)酵32 d 過程中進(jìn)行了二次發(fā)酵，當(dāng)發(fā)酵至26 d 即MK 產(chǎn)量最高時(shí)，色價(jià)達(dá)到664.53 U/g。

3 結(jié) 語

作者以燕麥為固體培養(yǎng)基，主要探究了燕麥的預(yù)處理和含水質(zhì)量分?jǐn)?shù)、營(yíng)養(yǎng)因子、微量元素對(duì)燕麥紅曲固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK 的影響。 在優(yōu)化后燕麥紅曲固體培養(yǎng)基中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%大豆分離蛋白，發(fā)酵14 d 后MK 產(chǎn)量可達(dá)19.77 mg/g， 發(fā)酵26 d 后MK 產(chǎn)量高達(dá)41.85 mg/g。該研究通過向優(yōu)化后燕麥培養(yǎng)基中添加大豆分離蛋白，在同等發(fā)酵時(shí)間內(nèi)獲得更高的MK 產(chǎn)量， 即達(dá)到某MK 產(chǎn)量所需發(fā)酵時(shí)間縮短。 結(jié)合已有文獻(xiàn)，Zhang 等人[18]以小米為發(fā)酵基質(zhì)，以紅色紅曲菌（Monascus ruber）為實(shí)驗(yàn)菌株，在優(yōu)化后的發(fā)酵條件下發(fā)酵20 d，MK 的產(chǎn)量可達(dá)19.81 mg/g。 該產(chǎn)量與本研究中發(fā)酵紅曲燕麥14 d后MK 產(chǎn)量基本一致。盧穎[11]以燕麥為發(fā)酵基質(zhì)，在優(yōu)化后的工藝條件下， 發(fā)酵14 d 后MK 產(chǎn)量為15.00 mg/g， 該產(chǎn)量低于本研究中發(fā)酵14 d 后燕麥紅曲中MK 的產(chǎn)量。 綜上，通過優(yōu)化燕麥紅曲培養(yǎng)基組分并添加食品級(jí)營(yíng)養(yǎng)因子，達(dá)到在較短的發(fā)酵周期獲取MK 含量較高的燕麥紅曲。 該研究結(jié)果可為提高功能性紅曲的生產(chǎn)效率及燕麥精深加工提供思路和參考。