兩種海藻內(nèi)生菌的分離及其抗氧化活性研究

馮書珍， 謝廣燕， 劉南英， 徐 暢， 盧宇鳳， 馮學(xué)珍

（廣西科技大學(xué) 醫(yī)學(xué)部，廣西 柳州545006）

香山科學(xué)會(huì)議第396次學(xué)術(shù)討論會(huì)與《全國(guó)海洋經(jīng)濟(jì)發(fā)展“十三五”規(guī)劃》中明確指出，海洋微生物將是今后獲得創(chuàng)新藥物的重要資源[1-2]。 海藻作為海洋中最大的植物類群，其內(nèi)生細(xì)菌與真菌是海洋微生物的重要組成部分[3]。 近年研究表明，內(nèi)生菌的生理活性物質(zhì)因具有抗氧化[4-6]、抗菌[7]、抗凝血[8]、抗炎[9]、抑制癌細(xì)胞[10]等作用，漸成為篩選與研究的熱點(diǎn)；其中，抗氧化對(duì)于預(yù)防許多由自由基引起的生物衰老及相關(guān)疾病如心血管疾病及癌癥等非常重要[11]。董玉潔等[4]從黃渤海銜接處的長(zhǎng)島海洋生物中分離內(nèi)生真菌，通過清除二苯代苦味?；杂苫―PPH：2，2-二苯基-1-苦 肼基自由基，2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl） 能力的抗氧化活性進(jìn)而篩選獲得阿爾茨海默?。ˋlzhei-mer’s disease，AD）活性菌株；Zheng 等[5]從Artemisia annua L.中分離篩選內(nèi)生細(xì)菌（Bacillus cereus SZ-1）， 其清除DPPH自由基的能力超過50%；Huang 等[6]在29 種植物如夾竹桃等中分離內(nèi)生菌大多內(nèi)生菌都能產(chǎn)生抗氧化物質(zhì)， 但不同種植物內(nèi)生菌具有種群多樣性，且同一種植物不同微生物種群間亦呈現(xiàn)多樣性。 目前，關(guān)于海藻內(nèi)生菌的研究大多集中于單一物種類型，不同海藻內(nèi)生菌間及內(nèi)生細(xì)菌與內(nèi)生真菌間抗氧化活性的差異研究還較少；這對(duì)于在海洋中正確遴選高生物活性的海藻內(nèi)生菌具有重要意義。

作者以廣西北部灣綠藻門石莼（Ulva lactuca L.）與褐藻門裙帶菜（Undaria pinnatifida Suringar）為研究對(duì)象，分離其內(nèi)生細(xì)菌與內(nèi)生真菌，并通過清除DPPH、羥基自由基、超氧陰離子的能力指征其體外抗氧化活性，探討不同海藻內(nèi)生菌間及內(nèi)生細(xì)菌與內(nèi)生真菌間抗氧化活性的差異，最終篩選抗氧化活性較高的菌株并加以鑒定，以期為海藻內(nèi)生菌的篩選及其抗氧化的天然生物活性成分研究提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 海藻樣品的采集與鑒定于2018年1月采自廣西北部灣海域 （20°54′10″ -21°40′30″ N，109°05′20″-109°11′35″ E），經(jīng)大連海洋大學(xué)邢坤副教授依次鑒定為綠藻門石莼屬黑石礁石莼（Ulva lactuca L.）、 褐藻門裙帶菜屬裙帶菜 （Undaria pinnatifida Suringar）。

1.1.2 培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基，LB（Luria-Bertani）瓊脂培養(yǎng)基分別用于海藻內(nèi)生真菌及細(xì)菌的分離；同時(shí)，選取去瓊脂的液體培養(yǎng)基用于發(fā)酵與培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 海藻內(nèi)生菌的分離將采集的海藻樣品用蒸餾水沖洗去掉表面的泥沙，用無菌濾紙吸干樣品表面的水分。 海藻樣品用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的Tween-20 浸泡5 min， 無菌水沖洗干凈。 體積分?jǐn)?shù)75%的酒精浸泡5 min，無菌水沖洗3次將表面的酒精沖洗干凈。 用體積分?jǐn)?shù)2%的次氯酸鈉消毒5 min，無菌水沖洗3次（保留最后1次沖洗海藻樣品的無菌水，作為對(duì)照）。 將海藻樣品進(jìn)行研磨，在研缽中加入一定量的無菌蒸餾水，靜置后吸取200 μL涂布于PDA 與LB 平板上， 倒置恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[11-12]。

1.2.2 海藻內(nèi)生菌的保存與發(fā)酵從平板培養(yǎng)基中挑取單菌落置1.5 mL 裝有液體培養(yǎng)基的離心管，搖床培養(yǎng)8～10 h，將菌液與體積分?jǐn)?shù)50%已滅菌的甘油1∶1 等體積混合，于-20 ℃冰箱內(nèi)保存（有效期1年，如需長(zhǎng)期保藏進(jìn)而劃線培養(yǎng)）。為獲得發(fā)酵液，可將保藏液再次轉(zhuǎn)接入新的液體培養(yǎng)基中，200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)7～14 d。

1.2.3 海藻內(nèi)生菌樣品溶液的制備獲得的發(fā)酵液，雙層濾紙過濾后得到上清液，用等體積的乙酸乙酯萃取3次，濃縮置于真空干燥箱中干燥，4 ℃保存。 分別精密稱取干燥恒重的乙酸乙酯提取物5 mg，甲醇溶解并定容100 mL，即5.0 mg/mL 的母液，備用。

1.2.4 海藻內(nèi)生菌抗氧化活性的研究

1） 對(duì)DPPH 自由基清除能力的測(cè)定 參照馮學(xué)珍等[13]方法，略做修改。 精確稱取DPPH·粉末用體積分?jǐn)?shù)80%乙醇配制成8 mg/mL 的溶液，避光保存。 取海藻內(nèi)生菌樣品溶液125 μL 加入125 μL DPPH·溶液，渦旋混合均勻，反應(yīng)一定時(shí)間后在517 nm處的吸光度，作為樣品組 （A517nm）；125 μL DPPH·溶液加上125 μL 體積分?jǐn)?shù)80%乙醇作為對(duì)照組（A01）；以125 μL相同質(zhì)量濃度的樣品和125 μL 體積分?jǐn)?shù)80%乙醇混合作為空白組（Amax1）；維生素C 作為陽(yáng)性對(duì)照。 計(jì)算如下式（1）：

2）對(duì)羥基自由基（·OH-）清除能力的測(cè)定 參照張婧涵等[14]方法，稍做修改。 在1.5 mL 離心管中依次加入6 mmol/L 硫酸亞鐵溶液300 μL，6 mmol/L水楊酸—乙醇溶液300 μL 后， 把海藻內(nèi)生菌樣品溶液300 μL 分別加入試管中， 然后加入體積分?jǐn)?shù)0.1%的過氧化氫溶液300 μL，搖勻后37 ℃水浴30 min，7000 r/min 離心3 min，在510 nm 處測(cè)定吸光度值A(chǔ)510nm；以相應(yīng)溶劑代替樣本作為空白對(duì)照，吸光度為Amax2；相應(yīng)樣品溶液的吸光度A02；維生素C作為陽(yáng)性對(duì)照。 計(jì)算如下式（2）：

3）對(duì)超氧陰離子自由基（·O2-）清除能力的測(cè)定參照陳玫等[15]及韓少華等[16]方法，稍做修改。 1.5 mL離心管中依次加入，900 μL pH = 8 的0.05 mol/L 磷酸鹽緩沖液放入25 ℃水浴中加熱20 min， 分別加入200 μL 海藻內(nèi)生菌樣品溶液和80 μL 25 mmol/L鄰苯三酚溶液， 混勻后于25 ℃水浴中反應(yīng)5 min，加入80 mmol/L HCl 200 μL 終止反應(yīng)， 并搖勻，反應(yīng)3 min，7000 r/min 離心3 min，在波長(zhǎng)420 nm 處測(cè)吸光度A420nm； 以相應(yīng)溶劑代替樣品作為空白對(duì)照，測(cè)吸光度為Amax3；相應(yīng)樣品溶液的吸光度A03；維生素C 作為陽(yáng)性對(duì)照。 計(jì)算如下式（3）：

1.2.5 分子生物學(xué)鑒定由于獲得的菌株較多，在經(jīng)抗氧化活性差異分析后，對(duì)清除DPPH、羥基自由基與超氧陰離子的綜合能力相對(duì)最強(qiáng)的菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定（最終篩選為石莼內(nèi)生真菌）。 提取內(nèi)生菌DNA 后進(jìn)行18S rDNA PCR 擴(kuò)增， 引物為Fung（5′-GTAGTCAT ATGCTTGTCTC-3′）和NSI（5′-ATTCCCCGTTACC CGTTG-3′）。 PCR 反應(yīng)體系均為25 μL， 其組成為： 引物各1 μL、2×Taq PCR MasterMix（TIANGEN，China）10 μL、內(nèi)生菌DNA 模板1 μL、加ddH2O 至總體積25 μL。 PCR 循環(huán)參數(shù)如下：95 ℃15 min、95 ℃1 min、57 ℃1 min、72 ℃2 min、35個(gè)循環(huán)；68 ℃延伸保育10 min 后冷卻至4 ℃。 PCR 產(chǎn)物于1.0 g/dL 的瓊脂糖電泳檢測(cè)后用于測(cè)序（諾禾致源），將測(cè)序結(jié)果基于NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)（NCBI：https：//www. ncbi.nlm.nih.gov/） 與已知序列進(jìn)行Blast 比對(duì)分析并繪制進(jìn)化樹。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采 用Excel 2010、Origin 8.0、SPSS （SPSS 20.0 Windows，SPSS Inc，Chicago，USA）、R 語(yǔ) 言 （The R Project for Statistical Computing）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析與作圖，根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果計(jì)算海藻多糖體外抗氧化活性的半數(shù)清除或抑制濃度（IC50），并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)誤差，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（X±SD ）”表示；分別對(duì)海藻內(nèi)生細(xì)菌與真菌的體外抗氧化活性進(jìn)行單因素方差分析 （One-way ANOVA， 置信水平95%、99%），處理間的多重比較用S-N-K 法；基于內(nèi)生菌的抗氧化活性進(jìn)行非度量多維尺度分析 （Nonmetric Multidimensional scaling，NMDS）， 并 利 用ANOSIM 統(tǒng)計(jì)組間差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 海藻內(nèi)生菌的初步分離

經(jīng)海藻內(nèi)生菌的平板培養(yǎng)，共篩選獲得石莼內(nèi)生細(xì)菌單菌落153個(gè)，內(nèi)生真菌單菌落75個(gè)；裙帶菜內(nèi)生細(xì)菌單菌落219個(gè)，內(nèi)生真菌單菌落15個(gè)。

2.2 海藻內(nèi)生菌抗氧化活性的初步測(cè)定

將獲得的內(nèi)生菌進(jìn)行抗氧化活性的測(cè)定，綜合DPPH、羥基自由基、超氧陰離子的清除能力都較強(qiáng)的前12 株菌株進(jìn)行下一步篩選。 由圖1 可知，石莼及裙帶菜內(nèi)生細(xì)菌與真菌均有一定的抗氧化活性，但不同藻類的細(xì)菌與真菌間存在一定差異。 其中，對(duì)3 種自由基的清除作用均表現(xiàn)較好的菌株，分別為石莼的內(nèi)生細(xì)菌SX-2、SX-5、SX-12， 內(nèi)生真菌SZ-5、SZ-7、SZ-8；裙帶菜的內(nèi)生細(xì)菌QX-1、QX-6、QX-8，內(nèi)生真菌QZ-4、QZ-6、QZ-9。

圖1 海藻內(nèi)生細(xì)菌與真菌抗氧化活性的初步測(cè)定Fig. 1 Preliminary determination of antioxidant activities of endophytic bacteria and fungi

2.3 已篩選的海藻內(nèi)生菌抗氧化活性測(cè)定

2.3.1 對(duì)DPPH 自由基的清除作用不同藻類不同內(nèi)生菌的不同質(zhì)量濃度對(duì)清除DPPH 自由基的活性分析，結(jié)果見圖2，可知：石莼與裙帶菜的內(nèi)生細(xì)菌、真菌對(duì)DPPH 的清除活性均隨質(zhì)量濃度增加而升高；除裙帶菜內(nèi)生細(xì)菌QX-8 外，當(dāng)質(zhì)量濃度為5.0 mg/mL 時(shí)，其清除率均可達(dá)到80%以上。 其中，石莼與裙帶菜的內(nèi)生細(xì)菌對(duì)DPPH 的清除IC50均顯著高于內(nèi)生真菌（P＜0.05），說明內(nèi)生細(xì)菌的抗氧化活性顯著低于內(nèi)生真菌；且裙帶菜內(nèi)生真菌QZ-4、QZ-6 的IC50分 別 為 （0.37±0.03） mg/mL、（0.39±0.07） mg/mL，顯著高于其他10 株菌株（P＜0.05）（表1）。 除裙帶菜內(nèi)生細(xì)菌QX-8 外， 當(dāng)質(zhì)量濃度為5.0 mg/mL 時(shí)，其清除率均可達(dá)到80%以上。

圖2 海藻內(nèi)生菌對(duì)DPPH 的清除能力Fig. 2 Scavenging capacity of algal endophytes on DPPH

表1 海藻內(nèi)生菌對(duì)自由基清除的半抑制濃度（IC50）Table 1 IC50 for free radical-scavenging capacity

2.3.2 對(duì)羥基自由基的清除作用由圖3 可知，12株內(nèi)生菌對(duì)·OH-自由基的清除作用均隨質(zhì)量濃度的升高而增強(qiáng)。 石莼內(nèi)生真菌與裙帶菜內(nèi)生細(xì)菌在5.0 mg/mL 時(shí)對(duì)·OH-自由基的清除作用可達(dá)到92%以上，經(jīng)計(jì)算IC50為（（1.02±0.29）～（1.30±0.36））mg/mL（表1）； 其次是石莼內(nèi)生細(xì)菌SX-2、SX-5、SX-12，5.0 mg/mL 時(shí)對(duì)·OH-自由基的清除率分別可達(dá)82%、88%、75%； 裙帶菜的內(nèi)生真菌QZ-4、QZ-6、QZ-9 對(duì)·OH-自由基的清除能力相對(duì)較弱， 在最大質(zhì)量濃度5.0 mg/mL 時(shí)清除率僅為38%～45%，經(jīng)計(jì)算IC50分別為 （6.86±1.52）、（0.20±2.31）、（5.59±1.08） mg/mL。

圖3 海藻內(nèi)生菌對(duì)羥基自由基的清除能力Fig. 3 Scavenging capacity of algal endophytes on hydroxyl radical

圖4 海藻內(nèi)生菌對(duì)超氧陰離子的清除能力Fig. 4 Scavenging capacity of algal endophytes on superoxide anion

2.4 海藻內(nèi)生菌間抗氧化活性的差異分析

以表1 計(jì)算所得的IC50值進(jìn)行下一步的組間分析，非度量多維尺度分析NMDS 與ANOSIM 統(tǒng)計(jì)結(jié)果可知（圖5）：不同藻類，石莼與裙帶菜內(nèi)生菌的抗氧化活性之間能較好地分開， 且差異顯著（globe test：P＜0.05）； 同種藻類不同內(nèi)生菌之間可表現(xiàn)為：石莼內(nèi)生真菌與內(nèi)生細(xì)菌的抗氧化活性之間差異顯著（globe test：P＜0.05）；裙帶菜內(nèi)生真菌與內(nèi)生細(xì)菌間亦能較好地分開，差異顯著（globe test：P＜0.01）。

2.3.3 對(duì)超氧陰離子的清除作用石莼與裙帶菜內(nèi)生細(xì)菌與真菌對(duì)自由基的清除作用表現(xiàn)為質(zhì)量濃度越高，作用越強(qiáng)（圖4）。 其中，石莼真菌SZ-5、SZ-7、SZ-8 在最高質(zhì)量濃度5.0 mg/mL 時(shí)對(duì)自由基的清除率都幾近100%，IC50分別為（1.14±0.35）、（1.14±0.24）、（1.46±0.41） mg/mL，其清除率顯著其他菌株（表1；P＜0.05）；其次，裙帶菜真菌QZ-4、QZ-6、QZ-9 在質(zhì)量濃度為5.0 mg/mL 時(shí)清除率可分別達(dá)88%、89%、88%，IC50分別為 （2.24±0.63）、（1.69±0.35）、（1.66±0.42） mg/mL；在質(zhì)量濃度為5.0 mg/mL 時(shí)， 石莼與裙帶菜內(nèi)生細(xì)菌的清除率均低于60%。 整體來說，石莼與裙帶菜的內(nèi)生細(xì)菌其IC50值均顯著高于內(nèi)生真菌（P＜0.05），說明石莼與裙帶菜內(nèi)生細(xì)菌對(duì)超氧陰離子的清除作用顯著低于內(nèi)生真菌。

圖5 海藻內(nèi)生菌間抗氧化活性的NMDS 分析Fig. 5 Non-metric multidimensional scaling of the algal entophytes

2.5 抗氧化活性菌株的分子鑒定

石莼內(nèi)生真菌SZ-5 菌株在最高質(zhì)量濃度時(shí)的清除DPPH、 羥基自由基與超氧陰離子的綜合能力相對(duì)最強(qiáng)，因此對(duì)其進(jìn)行下一步的分子鑒定。以SZ-5 菌株DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增， 其產(chǎn)物純化后進(jìn)行Sanger 測(cè)序， 并基于NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)與已知序列進(jìn)行Blast 比對(duì)分析。結(jié)果顯示（圖6），菌株SZ-5 的18S rDNA 序 列 與 NCBI 中 出 芽 短 梗 霉（Aureobasidium pullulans ）JX303663.1 的18S 序列，相似度較高；初步確定該分離的菌株為短梗霉菌屬真菌。

圖6 SZ-5 菌株同源性比較的進(jìn)化樹Fig. 6 Homology comparison of 18S rDNA gene from SZ-5 strains

3 結(jié)語(yǔ)

抗氧化活性主要是對(duì)生物在外界條件脅迫下產(chǎn)生的活性氧的消除作用[17]。 現(xiàn)有關(guān)海藻內(nèi)生菌的研究多集中在其抗菌方面：孫好芬等[18]對(duì)青島海域松節(jié)藻、多管藻、裙帶菜中分離純化出18 株內(nèi)生真菌，均具有較好的抑菌活性；孫杰等[19]對(duì)煙臺(tái)淺海處鼠尾藻、裙帶菜、海帶中分離內(nèi)生真菌并檢測(cè)其抑菌活性，結(jié)果表明均有＞50%的抑菌活性；但是相對(duì)于抗氧化活性的研究還較少。 廣西北部灣海域綠藻門石莼、 褐藻門裙帶菜的內(nèi)生細(xì)菌與真菌， 均對(duì)DPPH 自由基、羥基自由基、超氧陰離子具有一定的清除能力，大部分具有良好的抗氧化活性，清除活性均隨濃度增加而升高，說明海藻內(nèi)生菌是抗氧化活性產(chǎn)物尋找的良好資源。

石莼與裙帶菜的內(nèi)生菌抗氧化活性之間存在顯著差異，說明不同藻類內(nèi)生菌存在抗氧化活性的種群多樣性。 孫劍秋等[20]對(duì)北京植物園4 科6 種藥用植物的研究結(jié)果，也同樣發(fā)現(xiàn)不同植物中內(nèi)生真菌種類存在顯著差異。 這可能是由于，植物內(nèi)生菌具有豐富的生物多樣性，宿主植物不同，則分離得到的內(nèi)生菌種類、數(shù)目均有差異[18]；其抗氧化活性也可能存在差異。 目前，宿主與內(nèi)生菌的選擇性和多樣性機(jī)制尚未闡明，但已有研究表明，內(nèi)生菌大多能產(chǎn)生與宿主相似或相同的生物活性[21-22]。 課題組前期研究表明[13]，廣西北部灣石莼等多糖均具有較好的抗氧化活性（DPPH），作者試圖將內(nèi)生菌與宿主間建立耦合關(guān)系，結(jié)果并不理想，仍需深入研究。

同種藻類內(nèi)生菌間， 除裙帶菜內(nèi)生真菌外，整體表現(xiàn)為，石莼與裙帶菜的內(nèi)生細(xì)菌對(duì)DPPH、羥基自由基與超氧陰離子的半抑制濃度IC50值均顯著高于內(nèi)生真菌，說明石莼與裙帶菜內(nèi)生細(xì)菌對(duì)超氧陰離子的清除作用顯著低于內(nèi)生真菌。 石莼與裙帶菜的內(nèi)生真菌整體來說其抗氧化活性顯著高于內(nèi)生細(xì)菌，指示在海藻內(nèi)生菌的抗氧化活性物質(zhì)篩選中可以將內(nèi)生真菌作為優(yōu)先研究的對(duì)象。 其中，石莼內(nèi)生真菌SZ-5 菌株在最高質(zhì)量濃度時(shí)的清除DPPH、 羥基自由基與超氧陰離子的綜合能力相對(duì)最強(qiáng)，按真菌形態(tài)分類鑒定方法進(jìn)行鑒定為短梗霉菌屬真菌Aureobasidium spp.，可以作為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究的對(duì)象，從而為抗氧化藥物的研究與開發(fā)奠定基礎(chǔ)。