運(yùn)用逆流技術(shù)高效提取紫薯花青素

張瓊月，李冰寒， 李林輝

（西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川南充 637009）

花青素是一類水溶性較好的植物源性類黃酮類色素[1-2]，通常分布在多種顏色較深的水果、蔬菜細(xì)胞組織之中，參與植物花和果實(shí)顏色的決定[3-4]，如葡萄、黑枸杞、藍(lán)莓、紫甘薯、桑葚等。目前的研究已知，花青素不僅具有較強(qiáng)的抗氧化和清除人體自由基的能力，還有良好的防治癌癥、增強(qiáng)記憶、改善視力、控制體重、心血管保護(hù)等作用，在食品、藥品、保健和美容等行業(yè)均有應(yīng)用[5-11]。

紫薯（Solanum tuberdsm） 又叫紫甘薯、黑薯，因其薯肉呈紫色或深紫色而得名。除了具備普通紅薯所含的營(yíng)養(yǎng)成分外，還富含硒元素和花青素[12]?；ㄇ嗨胤植荚谧鲜淼膲K根和莖葉中，尤其在塊根中含量豐富，所以紫薯塊根是工業(yè)提取花青素的主要原料之一[13]。目前，提取紫薯花青素有多種方式[14]。王兆雨等人[15]運(yùn)用直接浸提法，提取條件為體積分?jǐn)?shù)50%乙醇提取劑、50 ℃恒溫水浴60 min，pH 值3.5，此時(shí)花青素的提取率為5.8%。Sun Y Z 等人[16]運(yùn)用微波提取法，通過(guò)響應(yīng)面法確定最優(yōu)工藝為鹽酸乙醇提取紫薯花青素，料液比1∶5，在71 ℃下提取53 min，花青素含量為363.90 μg/g?；鼐У热薣17]運(yùn)用超聲波輔助提取法，將鹽酸乙醇作為提取液，料液比1∶40，50 ℃恒溫提取25 min，最終得到的花青素為324.87 μg/g。但這些方法效率并非很高。

動(dòng)態(tài)逆流提取[18]，即將提取溶劑和待提取物料分別從設(shè)備兩端連續(xù)加入，待提取物料向出渣口方向逐級(jí)向后移動(dòng)，最后作為殘?jiān)懦?，在這個(gè)移動(dòng)過(guò)程中，待提取物料中的有效成分濃度越來(lái)越低，而用于提取待提取物料中有效成分的提取溶劑從出渣口一側(cè)加入，逐級(jí)向前移動(dòng)，隨著提取劑的逐級(jí)向前移動(dòng)，存在于提取劑中的有效提取物濃度越來(lái)越高，直到從第一級(jí)流出。動(dòng)態(tài)逆流提取的級(jí)數(shù)依據(jù)二者間的反應(yīng)效率來(lái)定，理論上級(jí)數(shù)越多，提取量越多，但在實(shí)際生產(chǎn)中，還需考慮再增加提取級(jí)數(shù)是否還具有經(jīng)濟(jì)效益，如果增加了級(jí)數(shù)，不再產(chǎn)生更多的效益，那就不再增加。

逆流提取方法在中藥活性成分的工業(yè)提取上獲得了廣泛應(yīng)用[19-25]，從枸杞、姜黃、甘草、茶樹(shù)紫芽、赤靈芝等眾多中藥材中提取活性物質(zhì)的研究均有報(bào)道，但尚未見(jiàn)其應(yīng)用于紫薯花青素的提取研究中。以新鮮紫薯為原料，利用逆流提取技術(shù)進(jìn)行紫薯花青素提取工藝的研究，并獲得了較為理想的效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綿紫薯9 號(hào)塊莖，實(shí)驗(yàn)室栽培所得。

莧菜紅標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)于索萊寶公司；無(wú)水乙醇、鹽酸，均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 紫薯預(yù)處理

選取大小均勻、質(zhì)量相近、表皮無(wú)明顯破損的新鮮紫薯洗凈，室溫下晾干表面水分，切成薄片，于60 ℃下烘干至恒質(zhì)量，研磨成粉，過(guò)50 目篩，密封后4 ℃下避光保存[26]。

1.2.2 逆流提取級(jí)數(shù)的設(shè)定

在正式試驗(yàn)開(kāi)始前，對(duì)樣品粉末進(jìn)行重復(fù)靜置提取，并分別測(cè)定提取液中的花青素含量，以此對(duì)逆流提取的最佳級(jí)數(shù)進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證。參考畢云楓等人[27]的研究結(jié)果設(shè)置試驗(yàn)條件，對(duì)樣品進(jìn)行重復(fù)靜置提取試驗(yàn)。預(yù)試驗(yàn)結(jié)果如下：第1 次提取所得濾液中的花青素含量為0.288 mg/g；第2 次提取液中含量為0.182 mg/g；第3 次提取含量為0.092 mg/g；第4 次提取含量為0.049 mg/g；第5 次提取含量為0.039 mg/g。由此結(jié)果可看出，第4 次與第5 次提取后所得的濾液中花青素含量極少，無(wú)法帶來(lái)更多效益，即基本沒(méi)有試驗(yàn)意義，故最終選擇以三級(jí)逆流的方式開(kāi)展后續(xù)試驗(yàn)操作。

1.2.3 試驗(yàn)裝置及運(yùn)行過(guò)程

根據(jù)逆流提取理論[18]設(shè)置反應(yīng)容器，紫薯粉末在每一級(jí)提取容器中與酸性乙醇溶液反應(yīng)，并安裝冷凝回流裝置，以減少提取過(guò)程中的酒精損耗。啟動(dòng)反應(yīng)前調(diào)節(jié)容器溫度，并在整個(gè)提取過(guò)程中保持恒溫。在每次提取結(jié)束后，將反應(yīng)混合物靜置至室溫，以減少試驗(yàn)誤差。用漏斗和濾紙進(jìn)行固液分離操作，將濾紙上的紫薯粉末固形物用提取溶劑全部沖洗到下一級(jí)反應(yīng)容器中。

三級(jí)逆流提取裝置示意圖見(jiàn)圖1。

在反應(yīng)過(guò)程中，新的紫薯粉末從第一級(jí)加入，與提取溶劑反應(yīng)并分離后的固形物（P1） 順次向下一級(jí)轉(zhuǎn)移，同理，第二級(jí)反應(yīng)后，固液分離所得的粉末固形物（P2） 將被全部轉(zhuǎn)移到第三級(jí)提取容器中，第三級(jí)反應(yīng)結(jié)束后，移除粉末固形物（P3）。而提取溶劑運(yùn)動(dòng)方向相反，第三級(jí)反應(yīng)容器是添加新提取溶劑的地方，且第三級(jí)提取反應(yīng)并分離后的濾液（L3） 將作為第二級(jí)反應(yīng)的提取溶劑。同理，第二級(jí)提取反應(yīng)后的濾液（L2） 將用于第一級(jí)提取反應(yīng)，而第一級(jí)的提取溶劑經(jīng)過(guò)濾后，即為最終的花青素粗提液（L1）。

1.2.4 提取紫薯花青素的單因素分析

以一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液作為提取溶劑，在一定提取溫度、料液比、提取時(shí)間下，將紫薯花青素溶解于其中，是常用的提取方法，試驗(yàn)也采用乙醇溶液作為提取溶劑，以逆流提取方法，探索其最優(yōu)提取條件及提取效率。

（1） 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)紫薯花青素提取的影響。稱取適量紫薯粉末從第一級(jí)容器中加入，按照1∶10的料液比在第三級(jí)提取容器中分別加入體積分?jǐn)?shù)為30%，40%，50%，60%，70%的乙醇溶液（鹽酸調(diào)節(jié)pH 值至1.5），在反應(yīng)過(guò)程中保持60 ℃恒溫，每份粉末的總反應(yīng)時(shí)間為2 h，即每一級(jí)反應(yīng)持續(xù)時(shí)間為2/3 h。 從提取溶劑加入第三級(jí)容器起，在其經(jīng)歷了第三級(jí)提取、第二級(jí)提取、第一級(jí)提取后，到第一級(jí)固液分離得到花青素粗提液為止的過(guò)程為一整個(gè)逆流提取流程。將經(jīng)歷整個(gè)逆流提取流程后得到的花青素粗提液以轉(zhuǎn)速6 000 r/min 離心1 min，收集上清液（即花青素溶液） 進(jìn)行后續(xù)分析。重復(fù)3 次，以平均值代表該因素下的提取效率。

（2） 料液比對(duì)紫薯花青素提取的影響。稱取適量紫薯粉末從第一級(jí)容器中加入，分別按照1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25 的料液比在第三級(jí)提取容器中加入體積分?jǐn)?shù)為40%的乙醇溶液（鹽酸調(diào)節(jié)pH 值至1.5），于60 ℃下恒溫，每份粉末的總反應(yīng)時(shí)間為2 h，即每一級(jí)反應(yīng)持續(xù)時(shí)間為2/3 h。然后，將經(jīng)歷整個(gè)逆流提取流程后得到的花青素粗提液以轉(zhuǎn)速6 000 r/min 離心1 min，收集所得上清液進(jìn)行后續(xù)分析。將以上流程重復(fù)3 次，以平均值代表該因素下的提取效率。

（3） 提取溫度對(duì)紫薯花青素提取的影響。稱取適量紫薯粉末從第一級(jí)容器中加入，按料液比1∶20在第三級(jí)提取容器中加入體積分?jǐn)?shù)為40%的乙醇溶液（鹽酸調(diào)節(jié)pH 值至1.5），分別設(shè)置試驗(yàn)提取溫度為50，60，70，80，90 ℃，并在提取過(guò)程中保持恒溫，每份粉末的總反應(yīng)時(shí)間為2 h，即每一級(jí)反應(yīng)持續(xù)時(shí)間為2/3 h。然后，將經(jīng)歷整個(gè)逆流提取流程后得到的花青素粗提液以轉(zhuǎn)速6 000 r/min 離心1 min，收集所得上清液進(jìn)行后續(xù)分析。將以上流程重復(fù)3 次，以平均值代表該因素下的提取效率。

（4） 提取時(shí)間對(duì)紫薯花青素提取的影響。稱取適量紫薯粉末從第一級(jí)容器中加入，按料液比1∶20在第三級(jí)提取容器中加入體積分?jǐn)?shù)為40%的乙醇溶液（鹽酸調(diào)節(jié)pH 值至1.5），設(shè)置試驗(yàn)提取溫度為80 ℃，每份粉末的總反應(yīng)時(shí)間分別設(shè)置為2.0，2.5，3.0，3.5，4.0 h，即每一級(jí)反應(yīng)持續(xù)時(shí)間分別為2/3，5/6，1，7/6，4/3 h。將經(jīng)歷整個(gè)逆流提取流程后得到的花青素粗提液以轉(zhuǎn)速6 000 r/min 離心1 min，收集所得上清液進(jìn)行后續(xù)分析。將以上流程重復(fù)3 次，以平均值代表該因素下的提取效率。

1.2.5 提取紫薯花青素的多因素分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，綜合考查乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取溫度和提取時(shí)間4 個(gè)因素對(duì)逆流提取法提取紫薯花青素的影響，以花青素得率為指標(biāo)，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，以期得到從紫薯中提取花青素的較好工藝。

L9（34）正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 L9（34）正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

1.2.6 超聲波提取法

超聲波提取法是近年來(lái)研究紫薯花青素提取領(lǐng)域中的一大熱點(diǎn)，多項(xiàng)研究圍繞超聲波法提取紫薯花青素展開(kāi)[14，17，27]，并認(rèn)為是目前提取紫薯花青素最好的方法。紫薯品種不同，其中花青素含量也存在差異，由于缺乏不同提取方法對(duì)同一紫薯品種提取花青素效率的參考文獻(xiàn)，在進(jìn)行該項(xiàng)工作時(shí)，張衛(wèi)波等人[28]用超聲波法提取花青素的工藝被選擇，用于與該試驗(yàn)方法進(jìn)行比較，評(píng)判二者的優(yōu)劣。其最佳提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，超聲溫度30 ℃，超聲時(shí)間10 min，紫薯與提取劑的料液比1∶25，提取完畢后將粗提液以轉(zhuǎn)速6 000 r/min 離心1 min，對(duì)上清液即為花青素溶液進(jìn)行含量測(cè)定。將以上流程重復(fù)3 次，結(jié)果取平均值。

1.3 花青素含量測(cè)定

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

莧菜紅標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制參照文獻(xiàn)[29]，具體操作為精密稱取0.100 g （準(zhǔn)確至0.001 g） 莧菜紅標(biāo)準(zhǔn)品100 mL 容量瓶中，加去離子水（pH 值7.0） 定容，得到質(zhì)量濃度1 mg/mL 的莧菜紅標(biāo)準(zhǔn)液。分別移取0.50，1.00，1.50，2.00，2.50，3.00，3.50 mL 至50 mL容量瓶中，用去離子水（pH 值7.0） 定容。于波長(zhǎng)520 nm 處測(cè)吸光度，以莧菜紅溶液為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制莧菜紅標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為Y=0.288 4X+ 0.060 9，R2=0.999 6。

莧菜紅標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2。

1.3.2 花青素含量的測(cè)定

將待測(cè)花青素溶液用乙醇溶液（pH 值1.5） 進(jìn)行稀釋，于波長(zhǎng)520 nm 處測(cè)吸光度[30]，每組試驗(yàn)設(shè)置3 次平行，結(jié)果取平均數(shù)。再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算出提取液質(zhì)量濃度C （10-5g/mL），計(jì)算紫薯花青素得率P，計(jì)算公式為：

式中：V——提取液體積，mL；

n——稀釋倍數(shù)；

M——紫薯粉末質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)紫薯花青素含量的影響乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)花青素含量的影響見(jiàn)圖3。

由圖3 可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%時(shí)花青素含量最高。一定范圍內(nèi)，乙醇體積分?jǐn)?shù)越大提取效果越差，推測(cè)可能因?yàn)榛ㄇ嗨貙儆谒苄陨?，乙醇體積分?jǐn)?shù)越高其水占比越小，反而不利于花青素的提取。而在體積分?jǐn)?shù)為70%之后得率又有上升，可能是高體積分?jǐn)?shù)乙醇對(duì)細(xì)胞有了殺傷作用，從而使得細(xì)胞內(nèi)的花青素被提取出來(lái)。

2.1.2 料液比對(duì)紫薯花青素含量的影響

料液比對(duì)花青素含量的影響見(jiàn)圖4。

圖4 料液比對(duì)花青素含量的影響

由圖4 可知，在料液比過(guò)小時(shí)，提取液容易達(dá)到相對(duì)飽和，并且量相對(duì)更少，所以不利于花青素的工業(yè)提??；而在料液比過(guò)大時(shí)，提取液內(nèi)花青素濃度變化不大，但原料用量增加，出現(xiàn)不必要的浪費(fèi)。由此得知，當(dāng)料液比為1∶20 時(shí)，花青素的提取效果最好。

2.1.3 提取溫度對(duì)紫薯花青素含量的影響

提取溫度對(duì)花青素含量的影響見(jiàn)圖5。

由圖5 可知，提取溫度為80 ℃時(shí)，花青素含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他提取溫度。在一定范圍內(nèi)，提取溫度的升高有利于分子運(yùn)動(dòng)，還可起到破壞細(xì)胞的作用，從而有利于花青素的釋放。但超過(guò)一定提取溫度界限，花青素受熱被破壞[7]，提取到的量反而減少。

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)紫薯花青素含量的影響

提取時(shí)間對(duì)花青素含量的影響見(jiàn)圖6。

由圖6 可知，一定范圍內(nèi)，花青素含量隨著提取時(shí)間增加而增加，可能是因?yàn)橛谐渥愕臅r(shí)間利于花青素從細(xì)胞內(nèi)充分釋放。當(dāng)提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，一是花青素容易分解，二是時(shí)間成本增加。因此，3.5 h是提取花青素的最佳時(shí)間。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見(jiàn)表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

由表2 可以得知，各個(gè)因素影響試驗(yàn)結(jié)果的主次順序?yàn)镈＞C＞A＞B，即料液比＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取溫度＞提取時(shí)間。由此結(jié)果可知，料液比對(duì)于逆流提取效果的影響是最大的，設(shè)置合適的料液比不僅能將提取效果最大化，還能提高原料利用率，避免成本浪費(fèi)。乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)于逆流提取也有較大的影響作用，選擇合適的體積分?jǐn)?shù)能夠促使提取效果達(dá)到最好。相對(duì)而言，提取溫度和提取時(shí)間對(duì)最終提取效果的影響不如前2 項(xiàng)，但保持適宜的提取溫度、設(shè)置最佳的提取時(shí)間，也能進(jìn)一步提高逆流提取的效率。

最終得出逆流提取法在提取紫薯花青素時(shí)的最佳工藝條件為A3B2C1D3，即酸性乙醇體積分?jǐn)?shù)30%，料液比1∶25，提取溫度80 ℃，提取時(shí)間3.5 h，此時(shí)花青素含量為1.245 mg/g。

2.3 超聲波提取試驗(yàn)結(jié)果與分析

在文獻(xiàn)所示的最佳試驗(yàn)條件下[28]，對(duì)同一批次紫薯粉末進(jìn)行超聲波提取，所得花青素含量為0.513 mg/g，而運(yùn)用逆流提取法的花青素含量為1.245 mg/g。由結(jié)果得知，逆流提取法的提取效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于超聲波提取法。

3 結(jié)論

直接提取法是最原始的提取方法之一，操作時(shí)只需將原料和提取溶劑充分混合后，進(jìn)行一次性靜置提取即可。王兆雨等人[15]以體積分?jǐn)?shù)50%乙醇為提取劑，提取溫度50 ℃，提取時(shí)間60 min，pH 值調(diào)節(jié)至3.5 為提取條件，進(jìn)行了紫薯花青素的直接提取試驗(yàn)。此時(shí)，原料中花青素的提取率為5.8%。直接提取法操作簡(jiǎn)單易行，但也有提取時(shí)間較長(zhǎng)、原料利用率低、提取效率低等缺點(diǎn)。

用纖維素酶和果膠酶進(jìn)行輔助從紫薯粉末中提取花青素也是常用方法之一。這2 種酶都有破壞植物細(xì)胞壁的作用[16]，能促使花青素從細(xì)胞中大量釋放并在萃取劑中迅速溶解。雖然酶輔助法提取效果優(yōu)于直接提取法，但其實(shí)質(zhì)并未發(fā)生改變，仍然是一次性靜置提取。并且酶解法提取成本較高，對(duì)試驗(yàn)的溫度要求也較嚴(yán)格。因此，不適合于工業(yè)提取花青素。

微波法的原理是原料粉末吸收了微波能量，使細(xì)胞內(nèi)的溫度迅速升高，細(xì)胞內(nèi)的壓力超過(guò)細(xì)胞壁的膨脹能力，從而導(dǎo)致植物細(xì)胞破裂，其內(nèi)的活性成分自由流出。Sun Y Z 等人[16]通過(guò)響應(yīng)面法探究微波法提取紫甘薯花青素的最佳條件，結(jié)果是以鹽酸乙醇作為提取劑，料液比1∶5，提取溫度71 ℃，提取時(shí)間53 min，得到的最終含量為363.90 μg/g。 然而，微波法在溶劑的選擇上有一定的局限性，這也在一定程度上限制了微波在工業(yè)提取紫薯花青素中的應(yīng)用。

與微波法不同的是，超聲波法在提取過(guò)程中產(chǎn)生高速?gòu)?qiáng)烈的空化作用和攪拌作用，破壞植物細(xì)胞，使溶劑大量滲透到細(xì)胞中，從而大大提高了提取效率。超聲波法不僅提取時(shí)間短，而且提取溫度低、提取范圍廣泛。這就決定了超聲波法在近年來(lái)眾多紫薯花青素提取研究中的重要地位?；鼐У热薣17]使用鹽酸乙醇作為提取劑，料液比1∶40，提取溫度50 ℃，提取時(shí)間25 min，花青素的最終含量為324.87 μg/g。關(guān)于2 種提取方法聯(lián)合作用的研究也有發(fā)表[31]，研究者將超聲波和纖維素酶共同作用于紫薯花青素的提取過(guò)程，其在最適條件下的花青素得率為8.77%。

試驗(yàn)選取了當(dāng)前應(yīng)用最為廣泛的超聲波提取法與逆流提取法相比較[32]。在參考文獻(xiàn)所示的最適條件下[28]，超聲波提取法與逆流提取法使用同一批次紫薯粉末分別進(jìn)行花青素提取試驗(yàn)，其中花青素含量的測(cè)定與計(jì)算方式均相同，試驗(yàn)得出的最終結(jié)論為逆流提取的花青素含量為1.245 mg/g，而超聲波提取法的花青素含量為0.513 mg/g。由此可知，相較于其他方法，逆流提取在花青素得率方面有著無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)，這也給紫薯花青素提取工業(yè)帶來(lái)了新方向。因此，逆流提取法在紫薯花青素的工廠化提取中具有極大的應(yīng)用前景。