新疆紫草的HPLC指紋圖譜建立、化學(xué)模式識別分析及其含量測定

馬留純 馬生軍 朱金芳 楊建波 周明聰 宋曉雨

中圖分類號 R284.1; R286.0 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2020）14-1732-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.14.13

摘 要 目的：建立新疆紫草的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，進行化學(xué)模式識別分析，并測定其中3種成分的含量。方法：采用HPLC法。以乙酰紫草素為參照，繪制34批不同來源新疆紫草藥材樣品的HPLC指紋圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012A 版）》進行相似度評價，確定共有峰;采用SPSS 19.0、SIMCA 14.1統(tǒng)計軟件進行聚類分析、主成分分析和正交偏最小二乘法-判別分析，以變量投影重要性值大于1為標(biāo)準(zhǔn)，篩選影響新疆紫草藥材質(zhì)量的差異標(biāo)志物，并以相同HPLC法測定其中3種成分的含量。結(jié)果：34批新疆紫草藥材共有12個共有峰;除市售樣品中的3批藥材相似度低于0.72外，其余藥材的相似度均高于0.86;共指認(rèn)出左旋紫草素、乙酰紫草素、β，β′-二甲基丙烯酰阿卡寧等3個共有峰。34批新疆紫草藥材可聚為2 類，其中S1、S4～S6、S13、S15～S20、S22、S26～S34聚為一類，其余聚為一類。前3個主成分因子的方差貢獻(xiàn)率分別為52.834%、18.600%、8.387%，累積方差貢獻(xiàn)率為79.821%。左旋紫草素、乙酰紫草素、β，β′-二甲基丙烯酰阿卡寧等 6 個成分為影響其質(zhì)量的差異標(biāo)志物。左旋紫草素、乙酰紫草素、β，β′-二甲基丙烯酰阿卡寧檢測質(zhì)量濃度的線性范圍分別為0.72～90、2.05～410、2.50～500 ?g/mL（r均大于0.999）;定量限分別為0.132、0.135、0.118 ?g/mL，檢測限分別為0.040、0.041、0.036 ?g/mL;精密度、穩(wěn)定性（24 h）、重復(fù)性、耐用性試驗的RSD均小于3%;加樣回收率分別為95.959%～100.201%（RSD=1.669%，n=6）、97.818%～102.698%（RSD=1.788%，n=6）、95.831%～99.344%（RSD=1.600%，n=6）。含量分別為0.002%～0.134%、0.025%～1.388%、0.022%～0.881%。結(jié)論：所建HPLC指紋圖譜和含量測定方法簡便、穩(wěn)定性好，可用于新疆紫草藥材的質(zhì)量評價和定量分析;左旋紫草素、乙酰紫草素、β，β′-二甲基丙烯酰阿卡寧等成分的含量各有不同，為不同來源新疆紫草的差異標(biāo)志物。

關(guān)鍵詞 新疆紫草;高效液相色譜法;指紋圖譜;主成分分析;聚類分析;正交偏最小二乘法-判別分析;含量測定

HPLC Fingerprint Establishment， Chemistry Pattern Recognition Analysis and Content Determination of Arnebia euchroma

MA Liuchun1，MA Shengjun1，ZHU Jinfang1，2，YANG Jianbo3，ZHOU Mingcong1，SONG Xiaoyu1（1. College of Food and Pharmaceutical Science， Xinjiang Agricultural University， Urumqi 830052， China; 2. Xinjiang Technical Institute of Physics and Chemistry， Chinese Academy of Sciences， Urumqi 830011， China; 3. Institute for Traditional Chinese Medicine and Ethnic Medicine Control， National Institute for Food and Drug Control， Beijing 100050， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish the HPLC fingerprint of Arnebia euchroma， analyze them with chemical pattern recognition technology， and determine the contents of 3 components. METHODS： HPLC method was adopted. Using acetylshikonin as reference， HPLC fingerprint of 34 batches of A. euchroma from different sources were drawn. Similarity Evaluation System for TCM Chromatographic Fingerprint （2012A edition） was used to evaluate the similarity of the samples， and common peaks were determined. SPSS 19.0 and SIMCA 14.1 statistical software was used for cluster analysis， principle component analysis and orthogonal partial least squares-discriminate analysis. According to the standard of the variable importance in the project greater than 1， the differential markers affecting the quality difference of A. euchroma were screened. Meanwhile， the contents of 3 components were determined by the same HPLC method. RESULTS： There were 12 common peaks in HPLC fingerprints for 34 batches of A. euchroma. The similarity of other samples were more than 0.86， except that the three batches of medicinal herbs on the market were less than 0.72; 3 common peaks were identified， such as shikonin， acetylshikonin， β，β′-dimethylacrylic acanine. These 34 batches of samples could be classified into two categories. S1， S4-S6， S13， S15-S20， S22， S26-S34 were clustered into one category， and others clustered into the other category. By principal component analysis， the contribution rates of three principle components were 52.834%，18.600% and 8.387%. Accumulative contribution rate was 79.821%. Six constituents， such as shikonin， acetylshikonin and β，β'-dimethylacrylic acanine were screened as differential markers， representing the major differences of A. euchroma. The linear range of above three components were 0.72-90， 2.05-410， 2.50-500 ?g/mL（r all more than 0.999）， respectively. The limits of quantification were 0.132， 0.135， 0.118 ?g/mL， respectively. The limits of detection were 0.040， 0.041， 0.036 ?g/mL， respectively. RSDs of precision， stability （24 h）， reproducibility and durability tests were all lower than 3%. Recoveries were 95.959%-100.201% （RSD=1.669%， n=6）， 97.818%-102.698% （RSD=1.788%， n=6）， 95.831%-99.344% （RSD=1.600%， n=6）. The contents of above three components were 0.002%-0.134%， 0.025%-1.388%， 0.022%-0.881%. CONCLUSIONS： Established HPLC fingerprint and content determination method are simple and stable， can be used for quality evaluation and quantitative analysis of A. euchroma. Shikonin， acetylshikonin and β，β'-dimethylacrylic acanine are different in the content and are differential markers of A. euchroma from different source.

KEYWORDS? ?Arnebia euchroma; HPLC; Fingerprint; Principle component analysis; Cluster analysis; Orthogonal partial least squares discriminate analysis; Content determination

紫草為我國傳統(tǒng)中藥材，其種類豐富，藥性因產(chǎn)地來源不同而存在明顯差異[1]。在眾多種類的紫草藥材中，屬產(chǎn)自新疆地區(qū)的新疆紫草質(zhì)量最優(yōu)，有道地藥材之譽[2]。新疆紫草[Arnebia euchroma（Royle） Johnst.]又名新疆軟紫草，屬紫草科軟紫草屬，為我國二級保護植物，是維醫(yī)常用藥材，被收載于2015版《中國藥典》（一部）中[3]。該藥的主要活性成分為脂溶性的萘醌類天然色素——紫草素及其衍生物，此外還含有多糖、生物堿、苯醌等化學(xué)成分，具有抗癌、抑菌、抗炎、保肝護肝等活性[4-8]。近年來，隨著醫(yī)藥行業(yè)的科技創(chuàng)新，新疆紫草不僅被用于臨床治療，還作為天然色素被廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、印染工業(yè)等行業(yè)中[9-11]。由于新疆紫草生長周期長，對環(huán)境要求苛刻，市場上供應(yīng)的藥材幾乎皆為野生品，加之多年掠奪式采挖嚴(yán)重，導(dǎo)致其野生資源日益減少，且至今尚無成熟技術(shù)應(yīng)用于該藥材的大規(guī)模人工種植，供需矛盾突出，以致市場上出現(xiàn)以假亂真、以次充好等現(xiàn)象[2]。因此，深入研究新疆紫草的質(zhì)量監(jiān)控方法，對于確保紫草藥材的療效和提高其藥用價值具有重要意義。

指紋圖譜和化學(xué)模式識別技術(shù)是評價中藥材質(zhì)量的有效手段。其中，指紋圖譜主要關(guān)注整體性，可全面揭示藥材中含有活性成分的數(shù)量與種類;化學(xué)模式識別技術(shù)則強調(diào)差異性，可對指紋圖譜數(shù)據(jù)信息進行充分的整合和校正;兩者結(jié)合可更加準(zhǔn)確、客觀地反映中藥的質(zhì)量差異，進而整體描述和合理評價其質(zhì)量，已廣泛應(yīng)用于種子鑒定、食品特征成分分析、中藥鑒別及質(zhì)量控制等領(lǐng)域[12-15]。目前，新疆紫草的相關(guān)研究主要為化學(xué)成分測定、提取和生物活性分析，而對其指紋圖譜的研究較少，且多集中于不同產(chǎn)地野生品或市售品指紋圖譜方法的建立[16-20]，對于新疆紫草栽培品及其化學(xué)模式識別的研究尚未見報道。此外，新疆紫草的相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)也僅有2015年版《中國藥典》（一部）中規(guī)定了“β，β′-二甲基丙烯酰阿卡寧含量不得少于0.3%”[3]?；诖?，本研究采用高效液相色譜法（HPLC）建立了34批不同來源新疆紫草藥材的指紋圖譜，并結(jié)合化學(xué)模式識別技術(shù)研究其化學(xué)組分特征，以篩選其質(zhì)量差異標(biāo)志物;同時，測定了其中3種萘醌類成分（左旋紫草素、乙酰紫草素、β，β′-二甲基丙烯酰阿卡寧）的含量，旨在從生產(chǎn)源頭確保藥材品質(zhì)，亦為新疆紫草質(zhì)量評價標(biāo)準(zhǔn)的完善提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC20-AB型HPLC儀，包括LC-20AB型二元泵、SIL-20AC型自動進樣器、SPD-M20A型二極管陣列檢測器（日本Shimadzu公司）; AL204-IC型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司];JBT/C-YCL400T/3P（D） 型超聲波藥品處理機（濟寧金百特工程機械有限公司）;RE-52B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司）;UVS-1型渦旋振蕩器（北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

左旋紫草素對照品（批號：R18D8F50911，純度：≥98%）、乙酰紫草素對照品（批號：R21J7F16576，純度：≥98%）、β，β′-二甲基丙烯酰阿卡寧對照品（批號：Y02A9H67135，純度：≥98%）均購自上海源葉生物科技有限公司;甲酸、乙腈為色譜純，石油醚（60～90 ℃）為分析純，水為純凈水。

34批新疆紫草藥材（編號：S1～S34，其中S1～S14為野生品、S15～S24為栽培品、S25～S34為市售品），經(jīng)新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院馬生軍副教授鑒定均為紫草科植物新疆紫草[A. euchroma（Royle） Johnst.]的干燥根。樣品信息來源見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC指紋圖譜的建立

2.1.1 供試品溶液的制備 取樣品適量，粉碎。精密稱取上述粉末0.5 g，加入石油醚25 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率：250 W，頻率：33 kHz） 提取30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用石油醚補足減失的質(zhì)量，混勻，濾過。取續(xù)濾液10 mL，置于錐形瓶中，蒸干，殘渣加乙腈適量溶解，渦旋30 s，加乙腈定容至10 mL量瓶中，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.2 混合對照品溶液的制備 取左旋紫草素、乙酰紫草素、β，β′-二甲基丙烯酰阿卡寧對照品各適量，精密稱定，加乙腈制成上述3種成分質(zhì)量濃度分別為90、410 、500 ?g/mL的單一對照品貯備液。取各單一對照品貯備液適量，置于5 mL棕色量瓶中，加乙腈定容，搖勻，即得上述3種成分質(zhì)量濃度分別為36、164、333 ?g/mL的混合對照品溶液。

2.1.3 色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相：乙腈（A）- 0.05%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～5 min，66%A→70%A;5～20 min，70%A→80%A;20～25 min，80%A→85%A;25～38 min，85%A;38～40 min，85%A→66%A;40～50 min，66%A）;檢測波長：275 nm;流速：0.8 mL/min;柱溫：30 ℃;進樣量：20 μL。

2.1.4 精密度試驗 取“2.1.1”項下供試品溶液（編號：S6）適量，按“2.1.3”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，以乙酰紫草素為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，12個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3%（n=6），表明方法精密度良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗 取“2.1.1”項下供試品溶液（編號：S6）適量，分別于室溫下放置0、4、8、12、16、24 h時按“2.1.3”項下色譜條件進樣測定，以乙酰紫草素為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，12個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3%（n=6），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗 取藥材樣品（編號：S6）適量，粉碎。精密稱取上述粉末0.5 g，共6份，按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.3”項下色譜條件進樣測定，以乙酰紫草素為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，12個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.1.7 指紋圖譜的生成 取34批藥材樣品適量，按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.3”項下色譜條件進樣測定，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012A 版）》，以S13為參照圖譜，建立34批藥材樣品的指紋圖譜。疊加指紋圖譜見圖1、對照指紋圖譜見圖2。

2.1.8 共有峰的指認(rèn) 34批樣品共有12個共有峰，與混合對照品色譜圖（見圖3A）進行比對，指認(rèn)2號峰為左旋紫草素、4號峰為乙酰紫草素、11號峰為β，β′-二甲基丙烯酰阿卡寧。本研究前期試驗確認(rèn)，新疆紫草藥材中乙酰紫草素含量較高，且出峰穩(wěn)定，加之分離度較好，故以其為參照，計算其他峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，34批樣品相對保留時間的RSD為0～0.79%，相對峰面積的RSD為0～96.41%。

2.1.9 相似度分析 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012A版）》，以軟件生成的新疆紫草的共有模式圖為參照圖譜，進行相似度評價，結(jié)果見表2。結(jié)果，除S26、S29、S31的相似度小于0.72外，其余樣品的相似度均大于0.86;其中，野生品（編號：S1～S14）相似度0.902～0.996，栽培品（編號：S15～S24）相似度0.864～0.983，市售品（編號：S25～S34）相似度0.536～0.990;表明野生品、栽培品與對照指紋圖譜的相似度較高;而市售品與對照指紋圖譜的相似度較低，化學(xué)成分存有一定的差異。

2.2 聚類分析

以34批藥材樣品的12個共有峰峰面積為變量，采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，以組間聯(lián)接平方歐式距離為測度進行聚類分析，結(jié)果見圖 4。由圖4可知，34 批藥材樣品可聚為兩類，S1、S4～S6、S13、S15～S20、S22、S26～S34聚為Ⅰ類，其余聚為Ⅱ類，其中Ⅰ類又可聚為兩類，S5、S15、S26、S27、S29～S31、S34為Ⅰa類，S1、S4、S6、S13、S16～S20、S22、S28、S32～S33為Ⅰb類;Ⅱ類也可聚為兩類，S7～S12為Ⅱa類，S2、S3、S14、S21、S23～S25為Ⅱb類;提示野生品、栽培品及市售品存在交叉現(xiàn)象。

2.3 主成分分析

以共有峰的峰面積為變量，采用SIMCA 14.1統(tǒng)計軟件進行主成分分析。結(jié)果，前3個主成分的方差貢獻(xiàn)率分別為52.834%、18.600%、8.387%，累積方差貢獻(xiàn)率為79.821%，表明前3個主成分可揭示藥材來源與12個共有成分的相關(guān)性，可反映藥材中大部分的差異信息。根據(jù)主成分分析結(jié)果，構(gòu)建主成分分析得分圖，詳見圖5。由圖5可知，各樣品并未按其來源區(qū)分，大部分野生品（S2、S3、S7～S12、S14）分布于得分圖的右側(cè);市售品（S26～S34）除S25外，其余均處于得分圖的左側(cè);栽培品均勻分布在兩側(cè)，其中S15、S17～S20在左側(cè)，S16、S21～S24在右側(cè)。野生品中S1、S4～S6、S13和市售品中 S25未按來源歸類，其結(jié)果與聚類分析結(jié)果基本一致。此外，野生品中來自于巴州的S1、S4與伊犁州的S7～S12 區(qū)分開;栽培品中來自烏魯木齊市的S21、S23、S24與來自伊犁州的S16～S19 區(qū)分開;市售品較集中地聚在一起。

2.4 正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）

OPLS-DA擬合效果的評價指標(biāo)主要是累積解釋能力參數(shù)（R2X、R2Y）和預(yù)測能力參數(shù)（Q2），若R2Y、Q2均大于0.5，則表示擬合效果較好，且越接近1越好[21]。將34批藥材樣品按來源分為野生組、栽培組、市售組，采用SIMCA 14.1統(tǒng)計軟件進行OPLS-DA分析，其得分散點圖見圖6。由圖6可知，野生組與栽培組分別分布于得分散點圖的兩側(cè)，R2X=0.608，R2Y=0.903，Q2=0.858;栽培組與市售組分別分布于得分散點圖的兩側(cè)，R2X=0.678，R2Y=0.869，Q2=0.811;野生組與市售組分別分布于得分散點圖的兩側(cè)，R2X=0.760，R2Y=0.722，Q2=0.611，均超過0.5。這表明，OPLS-DA預(yù)測模型可用于區(qū)分不同來源的新疆紫草，3組樣品的化學(xué)成分含量存在差異。

提取OPLS-DA模型中12個共有峰峰面積的變量投影重要性（VIP）值，并選擇其中VIP值大于1的共有峰[22]，結(jié)果見圖7。由圖7可知，VIP值大于1的色譜峰分別為11號峰（β，β′-二甲基丙烯酰阿卡寧，VIP值為1.155 9）、10號峰（VIP值為1.153 3）、12號峰（VIP值為1.113 9）、6號峰（VIP值為1.104 6）、2號峰（左旋紫草素，VIP值為1.071 2）、4號峰（乙酰紫草素，VIP值為1.049 2），表明這6種化學(xué)成分是影響新疆紫草質(zhì)量的差異標(biāo)志物。

2.5 含量測定

2.5.1 色譜條件 同“2.1.3”項。

2.5.2 溶液的制備 供試品溶液的制備同“2.1.1”項;混合對照品溶液的制備同“2.1.2”項;以乙腈為陰性對照溶液。

2.5.3 系統(tǒng)適用性試驗 取“2.5.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各適量，按“2.5.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，結(jié)果見圖3。由圖3可知，3種待測成分色譜峰的分離度均大于1.5，理論板數(shù)均不低于10 000，陰性對照無干擾，表明方法專屬性好。

2.5.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.1.2”項下各單一對照品貯備液適量，加乙腈制成系列質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，按“2.5.1”項下色譜條件進樣測定，以各待測成分質(zhì)量濃度 （X，?g/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進行回歸分析。結(jié)果，左旋紫草素的回歸方程為Y=27 811X-7 826.8（r=0.999 9），乙酰紫草素的回歸方程為Y=31 222X-95 144（r=0.999 8），β，β′-二甲基丙烯酰阿卡寧的回歸方程為Y=34 776X-94 892（r=0.999 9）;上述3種成分檢測質(zhì)量濃度的線性范圍分別為0.72～90、2.05～410、2.50～500 ?g/mL。

2.5.5 定量限與檢測限考察 分別精密吸取“2.5.2”項下混合對照品溶液適量，加乙腈倍比稀釋，按“2.5.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以信噪比10 ∶ 1、3 ∶ 1分別計算定量限、檢測限。結(jié)果，左旋紫草、乙酰紫草素、β，β′-二甲基丙烯酰阿卡寧的定量限分別為0.132、0.135、0.118 ?g/mL，檢測限分別為0.040、0.041、0.036 ?g/mL。

2.5.6 精密度試驗 取“2.5.2”項下混合對照品溶液適量，按“2.5.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，左旋紫草素、乙酰紫草素和β，β′-二甲基丙烯酰阿卡寧峰面積的RSD分別為0.667%、0.538%、0.742%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.5.7 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液（編號：S6）適量，分別于室溫下放置0、2、6、12、18、24 h時按“2.5.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，左旋紫草素、乙酰紫草素和β，β′-二甲基丙烯酰阿卡寧峰面積的RSD分別為1.660%、0.139%、0.103%（n=6），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.8 重復(fù)性試驗 取藥材樣品（編號：S6）適量，粉碎。精密稱定上述粉末0.5 g，共6份，按“2.5.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.5.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算樣品含量。結(jié)果，左旋紫草素、乙酰紫草素和β，β′-二甲基丙烯酰阿卡寧含量的RSD分別為1.888%、1.863%、1.709%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.5.9 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的藥材樣品粉末（編號：S6），每份約0.25 g，共6份，分別加入等量的“2.1.2”項下各單一對照品貯備液，混勻，按“2.5.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.5.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率。結(jié)果，左旋紫草素、乙酰紫草素和β，β′-二甲基丙烯酰阿卡寧的加樣回收率分別為95.959%～100.201%（RSD=1.669%，n=6）、97.818%～102.698%（RSD=1.788%，n=6）、95.831%～99.344%（RSD=1.600%，n=6）。

2.5.10 耐用性試驗 精密稱取藥材樣品粉末（編號：S6）適量，按“2.5.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.5.1”項下色譜條件，分別以不同流動相（B）濃度（0.02%、0.05%、0.08%）、流 速（0.7、0.8、0.9 mL/min）、 柱 溫（25、30、35 ℃）進樣測定，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算樣品含量。結(jié)果，左旋紫草素、乙酰紫草素、β，β′-二甲基丙烯酰阿卡寧含量的RSD均小于3%（n=3），表明該方法能夠滿足試驗要求，耐用性良好。

2.5.11 樣品含量測定 取34批藥材樣品粉末適量，按“2.5.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.5.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算樣品含量。每樣品平行操作3次，結(jié)果見表3。

3 討論

本研究前期預(yù)試驗比較了冷浸、回流和超聲等3種提取方法對待測成分色譜峰的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，超聲提取的樣品色譜峰峰形好、響應(yīng)強且雜質(zhì)干擾少，故選擇超聲提取制備供試品溶液。同時，本研究又比較了以乙腈-0.05%磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.2%乙酸水溶液和乙腈-0.05%甲酸水溶液等為流動相的分離效果。結(jié)果顯示，當(dāng)以乙腈-0.05%甲酸水溶液進行梯度洗脫時，色譜圖基線平穩(wěn)，色譜峰數(shù)量多且對稱性、分離度較好，故選擇乙腈-0.05%甲酸水溶液為流動相。此外，本研究通過在200～800 nm波長范圍內(nèi)對供試品溶液進行掃描后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)檢測波長為275 nm時，各色譜峰均有較強吸收，且分離度較好，故選擇275 nm為檢測波長。

中藥材來源廣泛，具有地域性、有限性和復(fù)雜性等特點，除自然因素外，采收加工等人為因素也會對其品質(zhì)產(chǎn)生影響，造成藥材質(zhì)量參差不齊[23]。本研究結(jié)果顯示，34批新疆紫草樣品的相似度為0.536～0.996，其中野生品和栽培品的相似度較高，表明樣品質(zhì)量穩(wěn)定;市售品中有3批樣品相似度較低（均小于0.72），表明市售樣品間質(zhì)量存在差異。34批樣品相對峰面積的RSD差異較大（RSD為0～96.41%），表明其含量存在差異。

指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識別是科學(xué)評價和合理控制中藥材質(zhì)量優(yōu)劣的有效技術(shù)手段[22]。指紋圖譜的建立需要廣泛的中藥資源，因此采集時應(yīng)兼顧野生、傳統(tǒng)產(chǎn)區(qū)和基地樣品，從而進行正確的模式識別[24]。本研究結(jié)果顯示，34批樣品可分為兩類，S1、S4～S6、S13、S15～S20、S22、S26～S34聚為一類，S2、S3、S7～S12、S14、S21、S23～S25聚為一類;主成分分析結(jié)果與該結(jié)果基本一致。左旋紫草素、乙酰紫草素、β，β′-二甲基丙烯酰阿卡寧等 6 個成分為影響新疆紫草藥材質(zhì)量的差異標(biāo)志物。含量測定結(jié)果顯示，34批藥材樣品中，左旋紫草素、乙酰紫草素和β，β′-二甲基丙烯酰阿卡寧的含量分別為0.002%～0.134%、0.025%～1.388%、0.022%～0.881%，各樣品間含量差異明顯。筆者分析原因可能為不同種植管理、采收加工等導(dǎo)致化學(xué)成分含量發(fā)生改變，不同產(chǎn)地新疆紫草的種質(zhì)來源、栽培技術(shù)、地理環(huán)境及貯存運輸?shù)纫蛩貢Υ紊x成分的積累造成影響，從而導(dǎo)致差異性[25]。

綜上所述，本研究所建HPLC指紋圖譜和含量測定方法簡便、穩(wěn)定性好，可為新疆紫草藥材質(zhì)量的評價及控制提供參考;左旋紫草素、乙酰紫草素、β，β′-二甲基丙烯酰阿卡寧等成分的含量各有不同，為不同來源新疆紫草的差異標(biāo)志物。

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（收稿日期：2020-03-09 修回日期：2020-05-07）

（編輯：陳 宏）