基于UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術鑒定藤梨根的化學成分

陳方超 高守紅 王志鵬 楊宏 順慶生 宋新華 徐一新

中圖分類號 R282;R284.1 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2020）14-1725-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.14.12

摘 要 目的：快速鑒定藤梨根的化學成分，為該藥材后續(xù)的物質基礎和質量控制等研究提供參考。方法：運用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間串聯(lián)質譜技術（UHPLC-Q-TOF-MS/MS）進行藤梨根的化學成分檢測。色譜柱為Waters XSelect HSS T3，流動相為0.1%甲酸乙腈溶液-0.1%甲酸水溶液（梯度洗脫），柱溫為40 ℃，流速為0.3 mL/min，進樣量為3 μL;采用電噴霧離子源，以負離子模式采集數(shù)據(jù)，掃描范圍為m/z 50～1 500，干燥氣溫度為350 ℃，霧化氣壓力為45 psi，毛細管電壓為3 500 V，鞘氣溫度為350 ℃。根據(jù)準分子離子和二級碎片離子信息，結合相關文獻以及對照品的保留時間和質譜裂解規(guī)律對檢出的化學成分進行結構鑒定。結果與結論：共鑒定出58個化學成分，包括16個五環(huán)三萜類化合物（如羥基積雪草酸、積雪草酸、山楂酸、科羅索酸、齊墩果酸、熊果酸等）、12個黃酮類化合物（如蘆丁、槲皮苷、木犀草苷、紫云英苷等）、17個有機酸類化合物（如隱綠原酸、綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C等）等，有9個化合物（如原花青素B1、B2，木犀草素等）為首次從藤梨根中鑒定出來。UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術可快速鑒定藤梨根中的化學成分。

關鍵詞 藤梨根;超高效液相色譜-四極桿-飛行時間串聯(lián)質譜技術;化學成分;鑒定

Identification of Chemical Components in Actinidia chinensis Root by UHPLC-Q-TOF-MS/MS

CHEN Fangchao1，2，GAO Shouhong3，WANG Zhipeng3，YANG Hong3，SHUN Qingsheng2， SONG Xinhua4，XU Yixin2（1. Graduate School， Shanghai University of TCM， Shanghai 201213， China; 2. School of Pharmacy， Shanghai University of Medicine & Health Sciences， Shanghai 201318， China; 3. Dept. of Pharmacy， Changzheng Hospital Affiliated to Naval Medical University， Shanghai 200003， China; 4. College of Chemistry and Bio-engineering， Yichun University， Jiangxi Yichun 336000， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To identify chemical components of Actinidia chinensis root rapidly， and to provide reference for further material basis and quality control study of the crude medicine. METHODS： UHPLC-Q-TOF-MS/MS technique was used to detect chemical components of A. chinensis root. The separation was performed on Waters XSelect HSS T3 column with mobile phase consisted of 0.1% formic acid acetonitrile solution-0.1% formic acid water solution （gradient elution） at the flow rate of 0.3 mL/min. The column temperature was set at 40 ℃，and sample size was 3 μL. Electrospray ion source was adopted， the data was collected under negative ion mode; the scanning range was m/z 50-1 500; the drying gas temperature was 350 ℃， the atomizing air pressure was 45 psi， the capillary voltage was 3 500 V，and sheath gas temperature was 350 ℃. According to the information of excimer ion and secondary fragment ion， the chemical components were identified by combining with the relevant literature， the retention time of the reference substance and the law of mass spectrometry cracking. RESULTS & CONCLUSIONS： Totally 58 chemical components was identified，which included 16 pentacyclic triterpenes （such as hydroxyasiatic acid，asiatic acid，maslinic acid，corosolic acid，oleanic acid，ursolic acid，etc.），12 flavonoids （such as rutin，quercitrin，cynaroside，astragalin，etc.），17 organic acids （such as cryptochlorogenic acid，chlorogenic acid，isochlorogenic acid A，isochlorogenicacid C， etc.）. There were 9 components （such as procydanidin B1， B2 and luteolin， etc.） identified for the first time in A. chinensis root. UHPLC-Q-TOF-MS/MS technique can be used for the rapid identification of chemical components in A. chinensis root.

KEYWORDS? ?Actinidia chinensis root; UHPLC-Q-TOF-MS/MS; Chemical component; Identification

藤梨根為獼猴桃科獼猴桃屬植物中華獼猴桃（Actinidia chinensis Planch.）的干燥根，又名陽桃根，其味苦、澀，性涼，具有清熱解毒、活血散結、祛風利濕等功效[1-2]。藤梨根是浙江等地區(qū)常用的抗腫瘤中藥，臨床上多用于治療胃癌、肝癌、食管癌、結腸癌等消化道系統(tǒng)腫瘤，還用于治療風濕痹痛、黃疸、痢疾、淋濁帶下、瘰疬、水腫等癥[3]。現(xiàn)代化學成分研究表明，其化學成分主要為五環(huán)三萜類、黃酮類、蒽醌類、苯丙素類、甾體類、生物堿類、有機酸類等，其主要活性成分為五環(huán)三萜類成分[4-7]。現(xiàn)代藥理學研究表明，藤梨根具有明顯的抗腫瘤、抗菌、抗氧化、保肝、降血脂、抗病毒、免疫調節(jié)等作用[8-11]。

目前對藤梨根的研究主要集中在化學成分的分離以及藥理作用的研究等方面，但藤梨根的化學成分復雜、分析方法單一，尤其是在質量控制方面的研究鮮有報道，缺乏有效的質量控制標準。近年來，液質聯(lián)用技術發(fā)展迅速，以其分析時間短、分離度高、靈敏度高和準確度高等特點在中藥成分分析鑒定中具有獨特優(yōu)勢[12]。基于此，本研究采用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間串聯(lián)質譜技術（UHPLC-Q-TOF-MS/MS）對藤梨根的化學成分進行快速鑒別，為進一步研究其物質基礎以及質量控制提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

1290型UHPLC儀（配備在線脫氣機、二元泵、自動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器）、6530型高分辨飛行時間質譜儀[配備Dual AJS 電噴霧離子源（ESI）、 MassHunter Data Acquisition 7.1工作站、Qualitative Analysis B 10.0定性分析軟件和PCDL Manager 8.0數(shù)據(jù)庫軟件]均購自美國Agilent公司;CPA 225D型十萬分之一電子分析天平（德國Sartorius公司）;VortexKB3型渦旋混勻器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）;Mini Spin個人型高速離心機、移液器（德國Eppendorf公司）;SK7200H 型超聲波清洗器（上海科導超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

熊果酸等45種對照品信息詳見表1;甲醇、乙腈（質譜純，德國Merck公司）;甲酸（色譜純，上海麥克林生物化學有限公司）;無水乙醇（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）;純凈水（廣州屈臣氏有限公司）。

12批藤梨根藥材均于2018年10月采自于大別山地區(qū)（編號：1801-1812），經海軍軍醫(yī)大學藥學院黃寶康教授鑒定為獼猴桃科獼猴桃屬植物中華獼猴桃（A. chinensis Planch.）的干燥根。標本存放于上海中醫(yī)藥大學科創(chuàng)中心中藥資源與生物技術中心實驗室。

2 方法

2.1 混合對照品溶液的制備

精密稱取45種對照品各10.0 mg，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成質量濃度均為1.0 mg/mL的單一對照品貯備液，于-20 ℃條件下保存，備用。臨用前，取各對照品貯備液100 μL，置于同一10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，制成各成分質量濃度均為10 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

取藤梨根藥材適量，粉碎，過40目篩后，精密稱取粉末1.0 g，置于100 mL具塞錐形瓶中，加入80%甲醇30 mL，超聲（功率：400 W，頻率：40 kHz）提取60 min，搖勻，濾紙濾過后再經0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 色譜條件

色譜柱：Waters XSelect HSS T3（100 mm×2.1 mm，2.5 μm）;流動相：0.1%甲酸乙腈溶液（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0 min，5%A;3 min，15%A;13 min，41%A;23 min，70%A;25～30 min，95%A）;流速：0.3 mL/min;柱溫：40 ℃;進樣量：3 μL。

2.4 質譜條件

采用ESI離子源，在負離子模式（MSI-）條件下采集數(shù)據(jù)，掃描范圍為m/z 50～1 500。具體質譜參數(shù)：干燥氣溫度為350 ℃;干燥氣流速為10 L/min;霧化氣壓力為45 psi;毛細管電壓為3 500 V;鞘氣溫度為350 ℃;鞘氣流速為11 L/min;碎裂電壓為140 V;錐孔電壓為65 V;八極桿電壓為750 V;參比離子分別為m/z 112.985 1、1 033.988 1;二級能量（CE）分別10、20、40 V。

2.5 藤梨根化學成分數(shù)據(jù)庫和二級質譜數(shù)據(jù)庫的建立

2.5.1 化學成分數(shù)據(jù)庫 根據(jù)國內外專業(yè)數(shù)據(jù)庫PubMed、SciFinder、ChemSpider、中科院化學專業(yè)數(shù)據(jù)庫、Sci-Hub、中國知網等平臺中的國內外相關文獻研究，收集了藤梨根中目前已經報道的166個化合物。同時，根據(jù)Qualitative Analysis B 10.0定性分析軟件中的“Formular-database-generator”工具（含各元素精確質量數(shù)），結合所測得的各成分所含碳、氫、氧等元素的數(shù)量，計算出相應的精確分子量，并建立了包括化合物名稱（含英文名稱）、分子式、CAS號在內的化學成分數(shù)據(jù)庫。

2.5.2 二級質譜數(shù)據(jù)庫 通過MassHunter Data Acquisition 7.1工作站采集45種對照品的二級質譜數(shù)據(jù)[包含分子離子、碎片離子m/z信息和保留時間（tR）等]，導入PCDL Manager 8.0數(shù)據(jù)庫軟件中，建立二級質譜數(shù)據(jù)庫。

2.6 藤梨根化學成分分析

采用Qualitative Analysis B 10.0定性分析軟件進行數(shù)據(jù)處理。首先，將所采集的藤梨根化學成分一級質譜數(shù)據(jù)與“2.5.1”項下建立的化學成分數(shù)據(jù)庫進行比對，根據(jù)其匹配得分（>90）、精確分子量的誤差（±5 ppm以內）以及同位素分布，初步對藤梨根藥材中的成分進行定性篩查。然后，根據(jù)各成分的保留時間和精確分子量，與已有對照品進行對比后推測出待測成分結構;若無相應對照品，則通過二級質譜數(shù)據(jù)對待測成分的碎片離子進行解析，再結合相關文獻推測出該成分結構。最后，在MassHunter Data Acquisition 7.1工作站的“Target MS/MS”采集模式下采集樣品和對照品的二級質譜數(shù)據(jù)，對其主要碎片離子進行比對分析，推測其裂解方式，進一步確定化學成分結構。

3 結果

3.1 化學成分的鑒定分析

藤梨根供試品溶液的總離子流圖見圖1。通過與“2.5.1”“2.5.2”項下建立的數(shù)據(jù)庫進行對比，結合相關文獻信息以及質譜裂解規(guī)律進行分析，鑒定出58個化學成分，其中包括16個五環(huán)三萜類化合物、12個黃酮類化合物、17個有機酸類化合物等;有9個化合物為首次從藤梨根中鑒定出來，詳見表2。

3.2 化合物裂解規(guī)律解析

3.2.1 黃酮類化合物 本研究在藤梨根中共鑒定出12個黃酮類成分，主要是黃酮類和黃酮苷類化合物。以部分化合物為例進行分析，結果發(fā)現(xiàn)黃酮單糖苷類化合物在裂解電壓下，多失去1分子糖，二級質譜中碎片離子峰多為[M-H-Rha（146）]-、 [M-H-Glu（162）]-，其m/z分別為301、285。解析示例如下。

化合物12、18：準分子離子峰均為m/z 577[M-H]-，根據(jù)Qualitative Analysis B 10.0定性分析軟件（下同）推測其分子式為 C30H26O12;二級質譜中出現(xiàn)明顯的碎片離子峰m/z 289[M-H-C15H12O6]-，再通過與文獻報道[13-14]比對，最終鑒定化合物12、18分別為原花青素B1、B2。

化合物16、21：準分子離子峰均為 m/z 289[M-H]-，二級質譜中出現(xiàn)明顯的碎片離子峰m/z 245[M-H-CO2]-、205[M-H-C4H4O2]-，且化合物21圖譜上還有碎片離子179[M-H-C6H6O2]-，推測其分子式為 C15H14O6;再通過與兒茶素和表兒茶素對照品進行比對，并結合其保留時間，最終鑒定化合物16、21分別為兒茶素和表兒茶素。

化合物25：準分子離子峰為m/z 609[M-H]-，二級質譜中出現(xiàn)明顯的碎片離子峰m/z 301[M-H-Rha（146）-Glu（162）]-、300[M-2H-Rha（146）-Glu（162）]-，推測其分子式為C27H30O16;再通過與蘆丁對照品進行比對，最終鑒定化合物25為蘆丁。

化合物30、31、32：準分子離子峰均為m/z 447 [M-H]-，其中化合物30、32的二級質譜中出現(xiàn)明顯的碎片離子峰m/z 301[M-H-Rha（146）]-，推測其分子式為C21H20O11;再通過與槲皮苷和木犀草苷對照品進行對比，最終鑒定化合物30、32分別為槲皮苷和木犀草苷?；衔?1的二級質譜中出現(xiàn)明顯的碎片離子峰m/z 285[M-H-Glu（162）]-、284[M-2H-Glu（162）]-，推測其分子式為 C21H20O11，再通過與紫云英苷對照品進行比對，最終鑒定化合物31為紫云英苷。

黃酮類成分二級質譜圖和裂解途徑解析見圖2、圖3（以槲皮苷、紫云英苷為例）。

3.2.2 五環(huán)三萜類化合物 本研究在藤梨根中共鑒定出16個五環(huán)三萜類成分，該類成分主要分為兩大類，即熊果酸類和齊墩果酸類;根據(jù)其羥基數(shù)目的不同，可分為一羥基、二羥基、三羥基、四羥基、五羥基等五環(huán)三萜酸類;在不同裂解電壓下，其結構均較穩(wěn)定，產生的碎片離子峰多為m/z 455、471、487、503、519等。以部分化合物為例，解析如下。

化合物35：準分子離子峰為m/z 665[M-H]-、711[M+HCOO]-，二級質譜中出現(xiàn)明顯的碎片離子峰m/z 503[M-H-Glu（162）]-，即失去了1分子葡萄糖，故鑒定化合物35是一個四羥基三萜酸苷類成分，分子式為 C36H58O11。

化合物40：準分子離子峰為 m/z 519[M-H]-，二級質譜中出現(xiàn)碎片離子峰m/z 501[M-H-H2O]-，即失去了1分子水，故鑒定化合物40是一個五羥基三萜酸成分，其分子式為C30H48O7。

化合物41：準分子離子峰為m/z 503[M-H]-，二級質譜中出現(xiàn)碎片離子峰m/z 485[M-H-H2O]-，即失去了1分子水，故鑒定化合物41是一個四羥基三萜酸成分，其分子式為C30H48O6。

化合物42：準分子離子峰為 m/z 503[M-H]-，二級質譜中出現(xiàn)碎片離子峰m/z 485[M-H-H2O]-、457[M-H-H2O-CO]-，故鑒定化合物42是一個四羥基三萜酸成分，其分子式為C30H48O6。

化合物45、47：準分子離子峰分別為 m/z 503[M-H]-、487[M-H]-，二級質譜中出現(xiàn)碎片離子峰m/z 503[M-H]-、487[M-H]-，故鑒定化合物45、47分別為一個四羥基三萜酸成分和一個三羥基三萜酸成分，其分子式分別為C30H48O6、C30H48O5。

化合物43：準分子離子峰為m/z 503[M-H]-，二級質譜中出現(xiàn)明顯的碎片離子峰m/z 487[M-H]-、485[M-H-H2O]-、457[M-H-H2O-CO]-，推測其分子式為 C30H48O6;再通過與羥基積雪草酸對照品進行比對，最終鑒定化合物43為羥基積雪草酸。

化合物46：準分子離子峰為m/z 487[M-H]-，二級質譜中出現(xiàn)碎片離子峰m/z 487[M-H]-，推測其分子式為C30H48O5;再通過與積雪草酸對照品進行比對，最終鑒定化合物46為積雪草酸。

化合物51、52：準分子離子峰均為m/z 471[M-H]-，二級質譜中均出現(xiàn)碎片離子峰m/z 471[M-H]-，推測其分子式為 C30H48O4;再通過與山楂酸和科羅索酸對照品進行比對，最終鑒定化合物51、52分別為山楂酸和科羅索酸。

化合物55、56：準分子離子峰均為 m/z 455[M-H]-，二級質譜中均出現(xiàn)碎片離子峰m/z 455[M-H]-，推測其分子式為 C30H48O3;再通過與齊墩果酸和熊果酸對照品進行比對，最終鑒定化合物55、56分別為齊墩果酸和熊果酸。

三萜類成分二級質譜圖和裂解途徑解析見圖4、圖5（以積雪草酸、羥基積雪草酸為例）。

3.2.3 有機酸類化合物 本研究在藤梨根中共鑒定出17個有機酸類成分，以部分化合物為例，解析如下。

化合物15、17：準分子離子峰均為 m/z 353[M-H]-，二級質譜中均出現(xiàn)明顯的碎片離子峰m/z 191[M-H-C9H6O3]-，推測其分子式為 C16H18O9;再通過與隱綠原酸、綠原酸對照品進行比對，最終鑒定化合物15、17分別為隱綠原酸和綠原酸。

化合物29、33：準分子離子峰均為 m/z 515[M-H]-，二級質譜中出現(xiàn)明顯的碎片離子峰m/z 353[M-H-C9H6O3]-、191[M-H-2（C9H6O3）]-、179[M-H-C16H16O8]-等，推測其分子式為 C25H24O12;再通過與異綠原酸A、異綠原酸C對照品進行比對，最終鑒定化合物29、33分別為異綠原酸A和異綠原酸C。

有機酸類成分二級質譜圖和裂解途徑見圖6、圖7（以異綠原酸A、異綠原酸C為例）。

4 討論

現(xiàn)有研究表明，藤梨根中的主要成分為五環(huán)三萜類化合物，且多互為同分異構體，采用常規(guī)的定性分析手段難以進行分離。本研究采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術，該技術具有高分辨率、高靈敏度的分離特點[12]，可實現(xiàn)對藤梨根藥材化學成分的快速鑒定;此外，對其中的同分異構體化合物，該技術可通過比對對照品信息及保留時間差異實現(xiàn)有效的定性鑒定。

由于藥材中成分較為復雜，故本研究對實驗條件進行了綜合考察，對提取方法（回流、超聲）、提取溶劑（水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇、無水乙醇）、提取時間（30、60、90 min）等進行了篩選。根據(jù)總離子流的響應度，最終確定提取方法為：以80%乙醇為提取溶劑、超聲提取60 min。此外，本課題組還對色譜條件中的流動相體系（乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液、0.1%甲酸乙腈溶液-0.1%甲酸水溶液）進行考察，根據(jù)不同流動相條件所得圖譜的總離子流的響應度及色譜峰的峰分離效果，最終確定以0.1%甲酸乙腈溶液-0.1%甲酸水溶液為流動相。

綜上所述，本研究共從藤梨根中鑒定出58個化學成分，其中包括16個五環(huán)三萜類化合物（如羥基積雪草酸、積雪草酸、山楂酸、科羅索酸、齊墩果酸、熊果酸等）、12個黃酮類化合物（如蘆丁、槲皮苷、木犀草苷、紫云英苷等）、17個有機酸類化合物（如隱綠原酸、綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C等）等;有9個化合物（如原花青素B1、B2，木犀草素等）為首次從藤梨根中鑒定出來。UHPLC- Q-TOF-MS/MS 技術可快速鑒定藤梨根中的化學成分。

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（收稿日期：2020-02-01 修回日期：2020-05-31）

（編輯：段思怡）