昆明山海棠提取物對(duì)新西蘭兔的胚胎-胎仔發(fā)育毒性研究

施汀蘭 張莉 黃鶴 梅小利 涂如霞 吳思瀾 蘭波 李恒華

中圖分類號(hào) R285.5;R994.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2020）14-1710-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.14.09

摘 要 目的：研究昆明山海棠提取物對(duì)妊娠動(dòng)物、胚胎及胎仔發(fā)育的影響。方法：取交配成功的新西蘭雌兔，按體質(zhì)量隨機(jī)區(qū)組法分為溶劑對(duì)照組、陽性對(duì)照組（環(huán)磷酰胺，20 mg/kg）和昆明山海棠提取物高、中、低劑量組（15.0、7.50、3.75 g/kg，以生藥量計(jì)），每組均至少18只。溶劑對(duì)照組和昆明山海棠提取物各劑量組雌兔在妊娠第6～18天灌胃水或相應(yīng)昆明山海棠提取物藥液，5 mL/kg，每天1次;陽性對(duì)照組雌兔在妊娠第10～13天于頸部皮下注射環(huán)磷酰胺，1 mL/kg，每天1次。依據(jù)《藥物生殖毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》相關(guān)要求，在實(shí)驗(yàn)期間觀察并記錄雌兔的一般情況、體質(zhì)量和攝食量，并于妊娠第28天時(shí)對(duì)其實(shí)施安樂死，解剖后觀察并記錄其主要臟器、帶胎子宮、胎盤子宮、胎盤、卵巢以及著床腺、吸收胎、死胎、活胎、黃體等相關(guān)指標(biāo)，并對(duì)胎仔進(jìn)行體質(zhì)量、外觀形態(tài)、內(nèi)臟和骨骼發(fā)育等相關(guān)指標(biāo)的檢查。結(jié)果：與溶劑對(duì)照組比較，昆明山海棠提取物各劑量組孕兔的體質(zhì)量、體質(zhì)量增長(zhǎng)、攝食量、主要臟器，孕兔妊娠、生殖功能以及胚胎形成和胎仔的生長(zhǎng)發(fā)育、外觀形態(tài)、內(nèi)臟和骨骼發(fā)育等相關(guān)指標(biāo)均未見明顯異常改變（P>0.05）;陽性對(duì)照組上述指標(biāo)均有顯著變化（P<0.05），表現(xiàn)出明顯的孕兔母體毒性以及胚胎和胎仔發(fā)育毒性。結(jié)論：昆明山海棠提取物在劑量為3.75～15.00 g/kg（以生藥量計(jì)）時(shí)對(duì)新西蘭兔無明顯母體毒性、胚胎或胎仔發(fā)育毒性。

關(guān)鍵詞 昆明山海棠;提取物;新西蘭兔;胚胎;胎仔;生殖毒性

Study on Toxic Effect of the Extract from Tripterygium hypoglaucum on Embryo-fetal Development of New Zealand Rabbits

SHI Tinglan，ZHANG Li，HUANG He，MEI Xiaoli，TU Ruxia，WU Silan，LAN Bo，LI Henghua（Chongqing Academy of Chinese Material Medica/Chongqing Center for Safety Evaluation of Drugs， Chongqing 400065，China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the toxic effect of the extract from Tripterygium hypoglaucum on pregnant animal and embryo-fetal development. METHODS： Successfully mated New Zealand female rabbits were randomly divided into solvent control group， positive control group （cyclophosphamide， 20 mg/kg） and T. hypoglaucum extract high-dose， medium-dose and low-dose groups （15.0， 7.50， 3.75 g/kg， by the amount of crude drug） according to their body weight， with 18 rabbits in each group at least. The female rabbits in solvent control group and T. hypoglaucum extract groups were given water or the corresponding T. hypoglaucum extract solution from 6th to 18th day of pregnancy， 5 mL/kg， once a day. Positive control group was given cyclophosphamide subcutaneously into the neck from 10th to 13th day of pregnancy， 1 mL/kg， once a day. According to the related requirements of Technical Guidelines for the Study of Drug Reproductive Toxicity， the general situation， body weight， body weight increase and food intake of female rabbits were observed and recorded during the experiment， and euthanasia was carried out on 28th day of pregnancy; the relative indexes of main organs， fetal uterus， placenta uterus， placenta， ovary， implantation gland， absorption fetus， stillbirth， live fetus and corpus luteum were observed and recorded after anatomy; the relative indexes of body weight， appearance， visceral and skeletal alterations of the fetus were detected. RESULTS： Compared with solvent control group， the body weight， body weight increase， food intake， main organs， pregnancy of pregnant rabbits， as well as reproductive function， embryo formation， fetal growth and development， appearance， visceral and skeletal development indexes in T. hypoglaucum extract groups had no significant abnormal changes （P>0.05）; above indexes in the positive control group had significant changes （P<0.05）， and significant maternal toxicity and embryotoxicity were found. CONCLUSIONS： T. hypoglaucum extract 15.00-3.75 g/kg （by the amount of crude drug） have no significant maternal toxicity， embryotoxicity or fetal development toxicity to New Zealand rabbits.

KEYWORDS? ?Tripterygium hypoglaucum; Extract; New Zealand rabbits; Embryo; Fetal; Reproductive toxicity

昆明山海棠[Tripterygium hypoglaucum （Lévl.）Hutch.]是衛(wèi)矛科雷公藤屬植物，又名火把花、粉背雷公藤，一般以其根部入藥，具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫、抗生育、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛等多種藥理活性[1-2];其在臨床多用作免疫抑制劑，用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡、血管炎、銀屑病等癥[1，3]，副作用包括引起女子月經(jīng)不調(diào)、閉經(jīng)以及導(dǎo)致男子精子減少、精子活動(dòng)率降低等[4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，昆明山海棠根的水提物（以下簡(jiǎn)稱“昆明山海棠提取物”）對(duì)雄性大鼠具有明顯的生殖毒性，能導(dǎo)致其睪丸和附睪萎縮并降低睪酮水平[5-6]。但目前有關(guān)其對(duì)妊娠動(dòng)物、胚胎及胎仔發(fā)育的影響鮮有報(bào)道?；诖?，本研究通過胚胎-胎仔發(fā)育毒性試驗(yàn)對(duì)昆明山海棠提取物的生殖毒性進(jìn)行考察，為該藥材的進(jìn)一步研究開發(fā)及臨床安全應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

BS224S型電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）;R2000-15型電子計(jì)重計(jì)數(shù)秤[奧豪斯儀器（常州）有限公司];YXQ-LS-50G型立式高溫高壓滅菌器（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）;1384A2型生物安全柜（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）;ZSA302型體視顯微鏡（重慶光電儀器有限公司）;SZ61型解剖鏡（日本Olympus公司）;CLW-1020型純水機(jī)（重慶乾崍儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

昆明山海棠提取物（重慶市中藥研究院藥化所制備;藥材產(chǎn)地為四川德昌，采用水提工藝，每15 g生藥制得1 g提取物）;注射用環(huán)磷酰胺（陽性對(duì)照，通化茂祥制藥有限公司，批號(hào)：171201，規(guī)格：0.2 g/瓶）;戊巴比妥鈉（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：922L034）;氯化鈉注射液（湖北天圣康迪制藥有限公司，批號(hào)：20180816，規(guī)格：10 mL ∶ 90 mg）;茜素紅、氯化鎂（成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)分別為20180403、2018040101）;95%乙醇、丙三醇、氫氧化鉀（重慶川東化工集團(tuán)有限公司，批號(hào)分別為20181101、20180501、20180101）;水為純化水。

1.3 動(dòng)物

普通級(jí)健康新西蘭兔，雌性100只，5～8月齡，體質(zhì)量3.2～4.4 kg;雄性20只，5～8月齡，體質(zhì)量3.3～4.3 kg。動(dòng)物由重慶市中藥研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（渝）2017-0006。

2 方法

2.1 溶液配制

取昆明山海棠提取物適量，用水配制成質(zhì)量濃度為3.00、1.50、0.75 g/mL（以生藥量計(jì)）的溶液，分別作為高、中、低劑量組藥液;注射用環(huán)磷酰胺用氯化鈉注射液配制成質(zhì)量濃度為20 mg/mL的藥液。

2.2 動(dòng)物交配與分組、給藥

雌雄兔按1 ∶ 1比例合籠交配。以雄兔在籠內(nèi)追逐雌兔、雌兔接受爬跨交配動(dòng)作后確認(rèn)交配成功，并將成功交配當(dāng)日定為該雌兔妊娠第0日（簡(jiǎn)稱為“GD0”，以下類推）。交配成功的雌兔根據(jù)體質(zhì)量按隨機(jī)區(qū)組法分為溶劑對(duì)照組、陽性對(duì)照組和昆明山海棠提取物高、中、低劑量組（各組均至少18只）。陽性對(duì)照組雌兔于頸部皮下注射環(huán)磷酰胺（20 mg/kg，劑量和給藥途徑參照相關(guān)文獻(xiàn)[7]及本研究預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置），注射體積為1 mL/kg，在GD10～GD13時(shí)給藥，每天1次;昆明山海棠提取物高、中、低劑量組雌兔灌胃昆明山海棠提取物溶液（15.00、7.50、3.75 g/kg，按生藥量計(jì);劑量參照本課題組前期雄性大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置），灌胃體積為5 mL/kg，在GD6～GD18時(shí)給藥，每天1次;溶劑對(duì)照組雌兔灌胃等容水，給藥頻次同昆明山海棠提取物各劑量組。

2.3 指標(biāo)觀察及測(cè)定

依據(jù)《藥物生殖毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》相關(guān)要求[8]，解剖觀察和記錄雌兔妊娠相關(guān)指標(biāo)，并對(duì)胎仔進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢查以及內(nèi)臟、骨骼標(biāo)本制作。

2.3.1 親代雌兔 于實(shí)驗(yàn)期間觀察親代雌兔的一般情況，測(cè)定并記錄其體質(zhì)量、攝食量。在GD28時(shí)稱定雌兔體質(zhì)量并采用吸入CO2的方式實(shí)施安樂死后，對(duì)其主要臟器（心、肝、脾、肺、腎等）進(jìn)行大體解剖觀察。沿接近卵巢部位的左子宮角到陰道剪開子宮肌層，將胎仔剝離胎盤，記錄胎盤肉眼觀察結(jié)果;稱定帶胎子宮總質(zhì)量以及胎盤子宮、胎盤、卵巢的質(zhì)量，記錄黃體數(shù)、著床數(shù)、著床腺數(shù)、吸收胎數(shù)、死胎數(shù)、活胎數(shù)，并計(jì)算子宮質(zhì)量（子宮質(zhì)量=胎盤子宮質(zhì)量-胎盤質(zhì)量）。計(jì)算子宮、卵巢臟體系數(shù);子宮和卵巢用10%中性福爾馬林溶液固定，必要時(shí)進(jìn)行組織病理學(xué)檢查;其他組織器官，若肉眼觀察可見病變，則同法固定后進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，同時(shí)取相應(yīng)的對(duì)照組親代雌兔器官行對(duì)比檢查。有吸收胎孕兔率、有死胎孕兔率、妊娠率、著床后丟失率、總丟失率等相關(guān)指標(biāo)參照文獻(xiàn)方法[9]計(jì)算。

2.3.2 胎仔 觀察胎仔外觀，測(cè)量并記錄胎兔體質(zhì)量、身長(zhǎng)。所有存活胎兔以2.5%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射實(shí)施安樂死后進(jìn)行內(nèi)臟和骨骼檢查。胎兔的心臟、腦、腎臟用10%氯化鎂溶液+10%中性福爾馬林溶液固定后，以顯微解剖法進(jìn)行檢查;其余內(nèi)臟均以新鮮器官組織行顯微解剖法檢查;骨骼標(biāo)本用95%乙醇固定和茜素紅染色后檢查。窩雌/雄仔比、四肢/尾/頭/軀干畸形率、骨骼畸形/變異率等相關(guān)指標(biāo)參照文獻(xiàn)方法[9]計(jì)算。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。胎仔以窩別為單位統(tǒng)計(jì)。計(jì)量資料以x±s表示，采用單因素方差分析進(jìn)行組間比較;計(jì)數(shù)資料以只數(shù)或率表示，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 親代雌兔一般情況

各組雌兔均未出現(xiàn)死亡，行為活動(dòng)正常，精神狀態(tài)良好，被毛清潔、無豎毛，未見陰道出血及流產(chǎn)，也未見其他毒性癥狀出現(xiàn)。與溶劑對(duì)照組比較，陽性對(duì)照組雌兔體質(zhì)量在GD18、GD21、GD25、GD28時(shí)均顯著降低（P<0.05或P<0.01），體質(zhì)量增長(zhǎng)在GD9～GD12、GD15～GD18、GD6～GD28期間均顯著降低（P<0.05或P<0.01）;其余各給藥組親代雌兔體質(zhì)量及體質(zhì)量增長(zhǎng)與溶劑對(duì)照組比較，各組親代雌兔的攝食量組間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。昆明山海棠提取物對(duì)親代雌兔體質(zhì)量、體質(zhì)量增長(zhǎng)、攝食量的影響見表1～表3（注：表中數(shù)據(jù)已剔除假孕雌兔的相關(guān)指標(biāo)結(jié)果，下同）。

3.2 親代雌兔解剖檢查相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

各組親代雌兔主要臟器解剖檢查均未見異常。與溶劑對(duì)照組比較，陽性對(duì)照組孕兔的終末體質(zhì)量和帶胎子宮、胎盤子宮、子宮的質(zhì)量均顯著降低（P<0.01）;子宮臟體系數(shù)顯著升高（P<0.01）;活胎數(shù)顯著減少，總丟失率顯著升高（P<0.05）。與溶劑對(duì)照組比較，昆明山海棠提取物各劑量組的未孕兔數(shù)、孕兔數(shù)、有吸收胎孕兔數(shù)、有死胎孕兔數(shù)、有活胎孕兔數(shù)、有吸收胎孕兔率、有死胎兔率、妊娠率等指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;孕兔終末體質(zhì)量和帶胎子宮、胎盤子宮、胎盤、子宮、卵巢的質(zhì)量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;孕兔子宮臟體系數(shù)、卵巢臟體系數(shù)、黃體數(shù)、著床數(shù)、著床腺數(shù)、吸收胎數(shù)、死胎數(shù)、活胎數(shù)、著床后丟失率、總丟失率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。昆明山海棠提取物對(duì)親代雌兔相關(guān)指標(biāo)的影響見表4～表5。

3.3 胎仔生長(zhǎng)發(fā)育指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

與溶劑對(duì)照組比較，陽性對(duì)照組的窩胎仔總質(zhì)量、窩胎仔均質(zhì)量、窩胎仔均身長(zhǎng)均顯著降低，四肢畸形率（主要表現(xiàn)為并趾、少趾、足內(nèi)翻、前肢屈曲過度、前肢活動(dòng)受限）、尾畸形率（主要表現(xiàn)為短尾、卷尾）、頭畸形率（主要表現(xiàn)為腭裂、露舌、唇裂、眼球突出）和窩別外觀畸形率均顯著升高（P<0.05）;胎仔內(nèi)臟畸形率和窩別內(nèi)臟畸形率均顯著升高（P<0.05），主要表現(xiàn)為腎臟小，其余臟器檢查未見明顯異常;胎仔顱骨變異率、腰椎骨化數(shù)、骶尾椎畸形和變異率、胸骨節(jié)變異率、前肢畸形和變異率、后肢畸形率、骨骼窩變異和畸形率均顯著增加或升高，胸椎骨化數(shù)、骶尾椎骨化數(shù)、肋骨骨化數(shù)、前肢骨化數(shù)、后肢骨化數(shù)均顯著減少（P<0.05或P<0.01）。與溶劑對(duì)照組比較，昆明山海棠提取物各劑量組的窩胎仔總數(shù)、窩胎仔均數(shù)、窩雌仔比、窩雄仔比，四肢、尾、頭和軀干的畸形率以及窩別外觀畸形率等指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;昆明山海棠提取物高劑量組胎仔內(nèi)臟、骨骼指標(biāo)以及窩變異和畸形率等指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。昆明山海棠提取物對(duì)胎仔生長(zhǎng)發(fā)育指標(biāo)的影響見表6～表9。

4 討論

根據(jù)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局（SFDA）頒布的《藥物生殖毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》，藥物生殖發(fā)育毒性非臨床研究的方法主要包括生育力與早期胚胎發(fā)育毒性試驗(yàn)、胚胎-胎仔發(fā)育毒性試驗(yàn)和圍產(chǎn)期毒性試驗(yàn)等[8]。其中，胚胎-胎仔發(fā)育毒性試驗(yàn)的給藥時(shí)限是從胚胎著床到硬腭閉合階段，可用于評(píng)價(jià)藥物對(duì)妊娠動(dòng)物、胚胎及胎仔發(fā)育的影響[7-8]。

根據(jù)昆明山海棠片對(duì)雄性大鼠的生殖毒性及作用機(jī)制的前期研究結(jié)果，以5.0、10.0、20.0 g/kg（以生藥量計(jì)）等3個(gè)劑量連續(xù)90 d灌胃給藥后，與正常對(duì)照組（即溶劑對(duì)照）比較，10.0 g/kg劑量組大鼠的睪酮水平顯著降低，各劑量組大鼠睪丸和附睪出現(xiàn)萎縮，兩者的臟器質(zhì)量和指數(shù)均顯著降低;停止給藥30 d后，大鼠生殖系統(tǒng)組織形態(tài)未見完全恢復(fù)[5-6]。本課題組前期通過SD大鼠Ⅰ階段生殖毒性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，昆明山海棠提取物按2.5、5.0、10.0 g/kg（以生藥量計(jì)）等3個(gè)劑量灌胃給藥對(duì)雄性大鼠具有明顯的生殖毒性。本研究預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)雌兔按15.0、7.5 g/kg（以生藥量計(jì)）的劑量灌胃昆明山海棠提取物后，15.0 g/kg劑量組孕兔出現(xiàn)流產(chǎn)、活胎數(shù)減少、早期吸收胎數(shù)增加等現(xiàn)象，而7.5 g/kg劑量組孕兔未見供試藥物相關(guān)的毒性反應(yīng)或異常改變。根據(jù)《藥物生殖毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[8]及相關(guān)文獻(xiàn)[10-13]，結(jié)合本課題組前期研究結(jié)果，本研究將昆明山海棠提取物的高、中、低劑量分別設(shè)定為15.00、7.50、3.75 g/kg（以生藥量計(jì)）。

在本實(shí)驗(yàn)條件下，新西蘭兔在GD6～GD18時(shí)灌胃高、中、低劑量昆明山海棠提取物后均未見明顯母體毒性或胚胎及胎仔發(fā)育毒性。而陽性對(duì)照組在給予環(huán)磷酰胺20 mg/kg劑量條件下，可見明顯的母體毒性和胚胎及胎仔發(fā)育毒性：母體毒性主要表現(xiàn)為孕兔體質(zhì)量和體質(zhì)量增長(zhǎng)均顯著降低，帶胎子宮、胎盤子宮、子宮的質(zhì)量以及子宮臟體系數(shù)均顯著降低，活胎數(shù)顯著減少，總丟失率顯著升高;胚胎毒性主要表現(xiàn)為胎仔的窩胎仔總質(zhì)量、窩胎仔均質(zhì)量、窩胎仔均身長(zhǎng)均顯著降低，四肢、尾、頭畸形率以及窩別外觀畸形率均顯著升高，內(nèi)臟畸形率以及骨骼畸形和變異率均顯著升高。這與以往研究報(bào)道[14-15]的結(jié)果類似。

綜上，昆明山海棠提取物在劑量為3.75～15.00 g/kg（以生藥量計(jì)）時(shí)對(duì)新西蘭兔無明顯母體毒性、胚胎或胎仔發(fā)育毒性。本研究可為昆明山海棠提取物進(jìn)一步研究開發(fā)及臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，下一步有必要進(jìn)行該藥材提取物對(duì)妊娠/哺乳期雌鼠以及其胚胎和子代發(fā)育影響的研究，以期更全面地評(píng)價(jià)該藥材的生殖毒性。

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[15] 周莉，姜娟，王永，等.環(huán)磷酰胺對(duì)新西蘭兔胚胎-胎仔發(fā)育的毒性作用研究[J].藥物不良反應(yīng)雜志，2013，15（2）：87-92.

（收稿日期：2020-02-06 修回日期：2020-05-31）

（編輯：段思怡）