張文芳,胡梅,陳錦霞,林碧珊
(國藥集團廣東環(huán)球制藥有限公司,廣東 佛山 528303)
白術系菊科植物白術AtractylodesmacrocephalaKoidz.的干燥根莖,性溫,味苦、甘,具健脾益氣、燥濕利水、止汗、安胎之功,用于脾虛食少、腹脹泄瀉、痰飲眩悸、水腫、自汗、胎動不安等[1]。主產于浙江、安徽,以浙江鄞縣、新昌地區(qū)產量最大,又以于潛(地處浙江臨安附近)所產品質最佳[2]。主要含揮發(fā)油、內酯類、有機酸、多糖及其他化學成分[3]。
近年來對白術成分的研究,多集中在揮發(fā)油、多糖、內酯等[4~10]?,F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)白術中同時含有多種有機酸類成分[11-12],而植物的酚酸類成分在抑菌、抗感染等方面的報道越來越多[13-14 ],且可在藥物中共同發(fā)揮藥理活性。白術酚酸類成分的相關報道不多,為保證白術臨床使用療效,本研究建立了同時測定其新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸質量分數(shù)的方法,為建立科學、合理、可控的白術活性成分質量控制標準提供科學參考。
Acquity UPLC液相系統(tǒng)(四元低壓泵、自動進樣器、柱溫箱和二極管陣列檢測器,Waters公司);Waters BEH C18(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)、Thermo BDS HYPERSIL C18(2.1 mm×50 mm,3 μm);MS105DU、AL104型電子分析天平 (梅特勒-托利多公司); KQ-500DE 型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);Synergy UV型超純水制備儀(Millipore公司)。
綠原酸對照品(批號110753-201716,質量分數(shù)99.3%)來源于中國食品藥品檢定研究院,隱綠原酸對照品(批號 DST170210-035,質量分數(shù)98.0%)、新綠原酸對照品(批號DST180130-015,質量分數(shù)99.0%)均來源于成都德思特生物技術有限公司。超純水由Millipore純水儀制備;其他試藥均為分析純。15批白術批號及產地來源見表1,經(jīng)本單位質管部黃國滿制藥助理工程師檢驗,結果均符合2015年版《中國藥典》規(guī)定。
表1 15批白術樣品來源信息Table 1 Sources of 15 batches of Atractylodes macrocephalae rhizome
色譜柱:Waters BEH C18色譜柱(2.1mm×50mm,1.7μm);流動相:乙腈(A)-0.1%(質量分數(shù),下同)H3PO4(B),洗脫梯度(0~4 min,1%A→6%A; 4~10 min,6%A→9%A; 10~16 min,9%A→18%A; 16~22 min,18%A→20%A; 22~23min,20%A→90%A);柱溫:25 ℃;流速:0.25 mL/min;檢測波長:325 nm;進樣量:1 μL。
2.2.1 混合對照品溶液的制備 分別取新綠原酸和隱綠原酸對照品各10 mg,分別置2個20 mL容量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,備用;另取綠原酸對照品10 mg,置20 mL容量瓶中,加甲醇適量,使溶解,精密加入新綠原酸和隱綠原酸對照品溶液各2 mL,用甲醇稀釋至刻度,即得。 請明確寫出混合對照品溶液中新綠原酸、隱綠原酸的質量濃度。
2.2.2 供試品溶液的制備 取白術樣品粉末(過3號篩)約1 g,精密稱定,置燒瓶中,精密加30%(體積分數(shù),下同)乙醇20 mL,稱定質量,水浴回流40 min,放冷,再稱定質量,用30%乙醇補足減失的質量,混勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。
分別按“2.2”項下方法制備混合對照品、供試品溶液,取空白溶劑,按“2.1”項下色譜條件進樣,結果表明,白術供試品溶液中3種酚酸類成分的分離度和理論塔板數(shù)均符合要求。見圖1。
1.新綠原酸; 2.綠原酸; 3.隱綠原酸。
精密量取混合對照溶液(新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸質量濃度分別為0.099、0.983、0.099 5 mg/mL)0.05、0.2、0.25、0.5、1.0、2.0 mL,置10 mL容量瓶中,加水定容至刻度,即得各質量濃度溶液;精密量取各線性溶液1 μL,注入超高效液相色譜儀,分別以峰面積為縱坐標,待測成分質量濃度為橫坐標,計算標準曲線的回歸方程和相關系數(shù),結果見表2。
表2 3種酚酸類成分的線性關系考察結果 Table 2 The linear relationship of three phenolic acids
精密吸取同一供試品溶液(S1),按“2.1”項下色譜條件重復進樣6 次,記錄峰面積。結果測得新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸峰面積的RSD值分別為0.7%、 0.1%、0.7%,均低于2%,表明儀器精密度良好。
取同一白術樣品(S1),按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液,分別于制備后0、2、4、6、8、10、12 h 各進樣1次,按“2.1”項下色譜條件測定,記錄峰面積。結果測得新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸峰面積的RSD值分別為0.5%、0.2%、0.6%,均低于2%,表明供試品溶液在12 h內穩(wěn)定。
取同一白術樣品(S1),按“2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液,按“2.1”項下色譜條件下分別進樣,測定峰面積并計算質量分數(shù)。結果測得新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸的平均質量分數(shù)分別為0.067、1.171、0.084 mg/g, 其RSD值分別為0.3%、0.7%、0.4%,均低于2%,表明方法重復性較好。
取已知質量分數(shù)同一批次白術樣品(S1)6份,每份約0.5 g,精密稱定,分別加入新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸對照品溶液0.6、1、0.8 mL,按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液,按“2.1”項下色譜條件分別進樣測定,計算加樣回收率,結果見表3。
表3 白術中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸的加樣回收率試驗結果Table 2 The results of the recoveries of neochlorogenic acid,chlorogenic acid and cryptochlorogenic acid in Atractylodes macro-cephalae rhizome(n=6)
取15 批不同產地白術樣品,各稱取白術藥材粉末(過3號篩)約1 g,精密稱定,置燒瓶中,精密加30%(體積分數(shù),下同)乙醇20 mL,稱定質量,水浴回流40 min,放冷,再稱定質量,用30%乙醇補足減失的質量,混勻,濾過,取續(xù)濾液,作為供試品溶液。按“2.1”項下色譜條件測定,計算3種待測成分的質量分數(shù),結果見表4。15批藥材的新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸的總質量分數(shù)在0.19~2.14 mg/g范圍內。
表4 15批白術中新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸的質量分數(shù)測定結果Table 4 The contents of neochlorogenic acid,chlorogenic acid and cryptochlorogenic acid in 15 batches Atractylodes macrocephalae rhizomew/(mg·g-1)
分別考察了不同檢測波長、流動相、柱溫、流速、色譜柱對色譜峰分離效果的影響,最終確定色譜條件。
3.1.1 檢測波長的選擇 通過DAD檢測器對供試品溶液在200~400 nm波長范圍內進行光譜掃描,綜合考慮3種成分的吸收波長,發(fā)現(xiàn)在325 nm波長處各色譜峰的峰面積均較大,因此選擇325 nm作為檢測波長。
3.1.2 流動相的選擇 考察了甲醇-水、乙腈-水,甲醇-0.1%H3PO4、乙腈-0.1%H3PO4為流動相的分離效果,發(fā)現(xiàn)在乙腈-水體系下峰形較寬,甲醇-水和甲醇-0.1%H3PO4體系產生的柱壓較高,故不進一步考察;乙腈-0.1%H3PO4為流動相時,色譜中各待測成分均能達到很好分離,故確定為洗脫流動相。
3.1.3 柱溫、流速的選擇 分別比較了柱溫為20、25、30 ℃,流速分別為0.20、0.25、0.30 mL/min時的分離效果,結果表明柱溫為25 ℃、流速為0.25 mL/min時,分離效果比較好。
3.1.4 色譜柱的選擇 考察了Waters BEH C18(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)、Thermo BDS HYPERSIL C18(2.1 mm×50 mm,3 μm)2種類型色譜柱,以及3種不同批號Waters BEH C18(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)色譜柱的分離效果,結果顯示均有較好的分離度,表明不同色譜柱的耐用性均較好。
分別考察了不同提取溶劑(水、10%甲醇、30%甲醇、50%甲醇、甲醇、10%乙醇、30%乙醇)、提取方法(回流、超聲)、提取時間(30、40、60、90、120 min)對白術中3種成分提取效果的影響,結果顯示30%乙醇回流提取40 min效果最佳。
對白術主產區(qū)浙江省金華市,河北省保定市,安徽省亳州市、宿州市、宣城市,河南省焦作市,重慶市秀山縣,湖南省、湖北省等產區(qū)白術中新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸進行了質量分數(shù)測定,結果表明不同產地白術中3種指標類成分總質量分數(shù)差別較大,從高到低分別是河北省保定市(3批均值1.76 mg/mL)>河南省焦作市(2批均值0.86 mg/mL)>安徽省(4批均值0.35mg/mL)>重慶市秀山縣(3批均值0.33mg/mL)>浙江省金華市(3批均值0.26 mg/mL),提示不同產地白術中有機酸類成分質量分數(shù)有一定差異。綠原酸、隱綠原酸和新綠原酸三者結構相似[15],其藥理作用基本一致,故本研究建立的UPLC法同時測定白術中三種酚酸類物質總質量分數(shù),方法簡便、準確、可靠,可用于控制白術的質量。