反向-HPLC法同時(shí)檢測(cè)復(fù)方益肝丸3種活性成分的含量

李業(yè)雨,劉世萍,馬妍妍,海 鑫

0 引言

復(fù)方益肝丸是由茵陳、龍膽、牡丹皮、丹參、大黃、紅花等28味藥材提取加工而成的一種中藥成方制劑[1-4]，具有清熱利濕、疏肝理脾、化瘀散結(jié)等功效，臨床上常用于濕熱毒所致的脅肋脹痛、黃疸、口干口苦、苔黃脈弦等，尤其對(duì)急、慢性肝炎有較好的治療效果；因其不良反應(yīng)較小，在臨床上應(yīng)用較為廣泛[5-14]。

《中國(guó)藥典》2015年版一部，通過(guò)檢測(cè)丹皮酚含量來(lái)控制復(fù)方益肝丸產(chǎn)品質(zhì)量[15]，僅監(jiān)測(cè)了牡丹皮藥材。為更好地控制復(fù)方益肝丸產(chǎn)品的質(zhì)量，本試驗(yàn)建立高效液相色譜法同時(shí)檢測(cè)復(fù)方益肝丸中大黃酸、大黃素和丹皮酚3種成分含量的方法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

Waters 600高效液相色譜儀(美國(guó)沃特世公司，配備Waters 2996檢測(cè)器，Waters 717plus自動(dòng)進(jìn)樣器，empower色譜工作站)；Agilent ZORBAX SB-C18液相色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)(美國(guó)安捷倫科技有限公司)；梅特勒AB135-S微量電子天平(瑞士梅特勒科技有限公司)；Milli-Q A10純化水處理器(美國(guó)密理博科技有限公司)；KQ-2400數(shù)控超聲儀(昆山超聲波儀器有限公司)。

大黃酸對(duì)照品(含量99.3%，批號(hào)：110757-201607)、大黃素對(duì)照品(含量98.7%，批號(hào)：110756-201512)、丹皮酚對(duì)照品(含量99.9%，批號(hào)：110708-201407)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈均為HPLC級(jí)；磷酸為優(yōu)級(jí)純；純化水為自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流速：1.0 ml/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μl；檢測(cè)波長(zhǎng)：261 nm；掃描波長(zhǎng)：190～400 nm；流動(dòng)相：0.1%磷酸水溶液(A)、乙腈(B)，梯度洗脫；洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 洗脫程序

2.2 溶液配制 混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液：分別取大黃酸、大黃素和丹皮酚對(duì)照品各25.0 mg，精密稱(chēng)定，置于25 ml容量瓶中，加甲醇18 ml，超聲溶解，加甲醇定容至刻度，搖勻；制成濃度分別為1.0 mg/ml的混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，2～8 ℃條件儲(chǔ)存。

對(duì)照品溶液：取混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液適量，制成質(zhì)量濃度均為6.0 μg/ml的對(duì)照品溶液。加甲醇定容至刻度，搖勻。

供試品溶液：取復(fù)方益肝丸供試品適量，研成細(xì)粉，取約0.5 g，精密稱(chēng)定，置25 ml量瓶中，加甲醇約20 ml，超聲提取約20 min(功率300 W，頻率55 kHz)；取出放冷，加甲醇至刻度，搖勻，0.45 μm濾膜過(guò)濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

陰性供試品溶液：按復(fù)方益肝丸制備方法和藥材配比比例，制備缺牡丹皮和大黃的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.3 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 分別取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液、陰性供試品溶液、供試品溶液和空白溶液，按“2.1”項(xiàng)下方法分別進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果陰性供試品溶液色譜圖中，在所測(cè)定的丹皮酚、大黃酸和大黃素3種活性成分對(duì)應(yīng)的位置無(wú)干擾，3種活性成分分離度等符合藥典要求。典型譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 HPLC圖

2.4 線(xiàn)性關(guān)系考察 分別精密量取混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液適量，制成濃度分別為0.3、0.6、1.0、6.0、15.0、30.0 μg/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，加甲醇至刻度，搖勻；取上述溶液注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以濃度為橫坐標(biāo)(x)、峰面積為縱坐標(biāo)(y)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，計(jì)算各成分線(xiàn)性范圍和相關(guān)系數(shù)；取對(duì)照品溶液，逐級(jí)稀釋?zhuān)?倍信噪比計(jì)算檢出限。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限

2.5 重復(fù)性與精密度試驗(yàn) 取復(fù)方益肝丸樣品(批號(hào)：180413)，按“2.2”項(xiàng)下供試品溶液配制方法處理樣品，平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件設(shè)置儀器，待儀器穩(wěn)定后，6份供試品溶液分別進(jìn)樣20 μl，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果測(cè)得丹皮酚、大黃酸和大黃素峰面積RSD分別為2.11%、3.08%和2.16%，表明方法重復(fù)性良好；取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果測(cè)得丹皮酚、大黃酸和大黃素峰面積RSD分別為1.08%、1.52%和0.65%，表明方法精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取復(fù)方益肝丸樣品(批號(hào)：180413)，按“2.2”項(xiàng)下供試品溶液配制方法處理樣品，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件設(shè)置儀器，待儀器穩(wěn)定后，分別于0、3、6、9、12、24 h，進(jìn)樣20 μl，記錄色譜圖，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

結(jié)果顯示，丹皮酚、大黃酸和大黃素峰面積RSD分別為1.25%、1.44%和0.89%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 加標(biāo)回收率試驗(yàn) 取復(fù)方益肝丸樣品(批號(hào)：180413)，研成細(xì)粉，取約0.5 g，精密稱(chēng)定，置25 ml量瓶中，精密加入“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液適量，后續(xù)按“2.2”項(xiàng)下供試品溶液配制方法處理樣品，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件設(shè)置儀器，待儀器穩(wěn)定后，分別進(jìn)樣分析，計(jì)算各成分加標(biāo)回收率。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 回收率試驗(yàn)

2.8 樣品測(cè)定 取市售復(fù)方益肝丸樣品(批號(hào):180413、180522、181217)，按“2.2”項(xiàng)下供試品溶液配制方法處理樣品，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件設(shè)置儀器，待儀器穩(wěn)定后，分別進(jìn)樣分析，外標(biāo)法計(jì)算丹皮酚、大黃酸和大黃素峰含量。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 樣品中3種待測(cè)物含量(mg/g)

3 討論

3.1 波長(zhǎng)的選擇 取丹皮酚對(duì)照品約10.0 mg，精密稱(chēng)定，置200 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻；再精密吸取上述溶液1.0 ml，置10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，丹皮酚測(cè)試溶液濃度為5.0 μg/ml。同法配制大黃酸和大黃素測(cè)試溶液。取上述測(cè)試溶液，分別在紫外可見(jiàn)光譜進(jìn)行波譜掃描(掃描范圍190～450 nm)。結(jié)果為在261 nm處，丹皮酚、大黃酸和大黃素吸收強(qiáng)度較強(qiáng)，因此選擇261 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 流動(dòng)相的選擇 試驗(yàn)考察甲醇-0.1%磷酸水溶液和乙腈-0.1%磷酸水溶液2種流動(dòng)相組合體系。結(jié)果在甲醇-0.1%磷酸水溶液體系下，大黃酸和大黃素分離效果較差，且分析時(shí)間長(zhǎng)，檢測(cè)效率偏低；在乙腈-0.1%磷酸水溶液體系下，丹皮酚、大黃酸和大黃素色譜峰分離效果較好，峰型好，符合系統(tǒng)適應(yīng)性要求，因此，本試驗(yàn)選擇乙腈-0.1%磷酸水溶液體系作為流動(dòng)相體系。

本試驗(yàn)建立了高效液相色譜檢測(cè)復(fù)方益肝丸中活性成分丹皮酚、大黃酸和大黃素含量的分析方法，考察了分析方法的線(xiàn)性、重復(fù)性、精密度、加標(biāo)回收率等，優(yōu)化了試驗(yàn)波長(zhǎng)和流動(dòng)相，結(jié)果證明，該方法具有簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，可以用于復(fù)方益肝丸產(chǎn)品的質(zhì)量控制。