辣木籽油功能性成分檢測(cè)及多元統(tǒng)計(jì)分析

王鐵旦，楊 敏，楊 芳，杜 萍,*

（1.昆明理工大學(xué)分析測(cè)試研究中心，云南省分析測(cè)試中心，云南 昆明 652094；2.十堰市疾病預(yù)防控制中心，湖北 十堰 442000；3.武漢工程大學(xué)環(huán)境生態(tài)與生物工程學(xué)院，湖北 武漢 430205）

辣木是一種具有獨(dú)特經(jīng)濟(jì)價(jià)值的熱帶植物，為辣木科（Moringaceae）辣木屬（MoringaAdans.）多年生熱帶落葉喬木[1]，又被稱為楊椿樹(shù)、鼓槌樹(shù)或辣根樹(shù)[2]。目前，種植最多的辣木品種是印度辣木（M. oleifera）和非洲辣木（M. stenopetala），其中又以印度辣木分布最廣[3]。辣木素來(lái)就有“奇跡之樹(shù)”的美譽(yù)[4-5]，其葉、種子、樹(shù)皮以及根等均是民間傳統(tǒng)的藥物，用于保健和治療多種疾病。研究表明，辣木具有抗腫瘤[6]、降血糖[7]、免疫調(diào)節(jié)[8]、抑菌[9]、抗病毒[10]、抗輻射[11]等多種藥理作用，被譽(yù)為新時(shí)代的健康食物。2012年，辣木已被批準(zhǔn)為新資源食品，很多地區(qū)開(kāi)始重視辣木的引種培育和開(kāi)發(fā)利用，包括我國(guó)的云南、臺(tái)灣、廣東及廣西[12]。

作為辣木加工副產(chǎn)物，辣木籽中油脂含量為25%～35%[13]，目前，辣木籽油的提取工藝有壓榨法[14]、微波輔助提取[15]、水酶法[16]、亞臨界萃取[17]以及同時(shí)蒸餾萃取法[18]等?；瘜W(xué)組成方面研究主要包括脂肪酸組成，作為構(gòu)成油脂主要成分，脂肪酸的組成及配比很大程度上決定了植物油脂的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和生物活性，是評(píng)價(jià)植物油的主要指標(biāo)之一[19]。辣木籽中不飽和脂肪酸含量較高，其中油酸含量大于50%[20]。辣木籽油中還含有多種功能性成分，例如，生育酚和植物甾醇等可作為優(yōu)質(zhì)的食用油來(lái)源[13]。植物甾醇是一類以環(huán)戊烷全氫菲為主體骨架的活性物質(zhì)，其中含量較多的有β-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇以及谷甾烷醇等，具有降血脂、降膽固醇、預(yù)防心血管疾病等作用，可用作食品抗氧化劑[21]。

我國(guó)云南省在20世紀(jì)初已從緬甸引種辣木[22]，并進(jìn)行辣木籽油系列產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)與精深加工[23]，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)辣木的研究主要集中在辣木葉，而對(duì)辣木籽油中功能性成分的報(bào)道較少。為提高辣木綜合加工的附加值，本實(shí)驗(yàn)從云南省8 個(gè)有代表性的產(chǎn)區(qū)的辣木籽中提取油脂，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)研究其脂肪酸組成，采用高效液相色譜法測(cè)定其生育酚和甾醇的含量，并用主成分分析（principal component analysis，PCA）和聚類分析（clustering analysis，CA）等多元統(tǒng)計(jì)方法對(duì)云南八產(chǎn)區(qū)的辣木籽油功能性成分進(jìn)行差異分析，構(gòu)建云南八產(chǎn)區(qū)辣木籽油功能性成分的綜合指標(biāo)評(píng)價(jià)模型，以期為辣木籽綜合開(kāi)發(fā)中原料的優(yōu)選分級(jí)和功能因子評(píng)價(jià)提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

辣木籽樣品采自云南省8 個(gè)辣木產(chǎn)區(qū)，編號(hào)為S1～S8，詳細(xì)信息見(jiàn)表1，其品種均為印度辣木。樣品經(jīng)過(guò)挑選、烘干及粉碎后過(guò)40 目篩即得辣木籽粉，干燥密封待用。

生育酚系列標(biāo)準(zhǔn)品DL-α-生育酚（＞96%）、(+)-δ-生育酚（＞98%）、豆甾醇（純度90%） 美國(guó)Sigma公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)。

表1 辣木籽樣品產(chǎn)地Table 1 Qeographical origins of M. oleiffeerraa seed samples used in this study

1.2 儀器與設(shè)備

S C I O N S Q 4 5 6-G C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀美國(guó)B u r k e r公司；D B-W A X彈性石英毛細(xì)管柱（30 mm×0.25 mm，0.25 μm）、75 μm碳分子篩/聚二甲基硅氧烷萃取頭 美國(guó)Supelco公司；KQ2200型超聲波提取儀昆山市超聲儀器有限公司；R-201D-II型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；ACQuity Arc高效液相色譜儀、Symmetry C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）美國(guó)沃特世公司。

1.3 方法

1.3.1 辣木籽油的提取

參考王 美霞等[24]的方法提取油脂，略有改動(dòng)。分別稱取辣木籽粉樣品17.0 g于三角燒瓶中，加入100 mL沸程30～60 ℃的石油醚，浸泡過(guò)夜，離心，濾渣用30 mL的石油醚分3 次洗滌，合并濾液及洗滌液于圓底燒瓶，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮、干燥制得辣木籽油。將含有辣木籽油的浸提燒杯于80 ℃烘干至恒質(zhì)量，冷卻稱質(zhì)量，并按下式計(jì)算含油量：

式中：A0為辣木仁樣品質(zhì)量/mg；A1為浸提燒杯質(zhì)量/mg；A2含有辣木籽油的浸提燒杯質(zhì)量/mg。

1.3.2 辣木籽油脂肪酸組成分析

甲酯化條件：稱取油樣0.2 g于20 mL具塞試管中，加入4 mL 0.4 mol/L氫氧化鉀-甲醇溶液，搖勻。于60 ℃水浴中加熱至油珠完全溶解（約30 min），冷卻后加入2.0 mL的25%三氟化硼-甲醇溶液，于60 ℃水浴酯化20 min，冷卻至室溫后加入2.0 mL正己烷，搖勻；再加入2 mL飽和氯化鈉溶液搖勻，10 000 r/min離心5 min，取上層溶液進(jìn)行GC-MS分析。

氣相色譜條件：DB-WAX彈性石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升溫：170 ℃，保持1 min，以4 ℃/min升溫至260 ℃，保持10 min。進(jìn)樣方式為分流進(jìn)樣，分流比10∶1，進(jìn)樣量0.2 μL；進(jìn)樣口溫度260 ℃，檢測(cè)器溫度280 ℃，載氣為高純氦氣，流速1.7 mL/min。

質(zhì)譜條件：電子電離源；電子能量70 eV；離子源溫度200 ℃。監(jiān)測(cè)方式為全掃描；質(zhì)量掃描范圍m/z25～450；溶劑延遲時(shí)間4 min。

定性方法：將樣品色譜圖中的每個(gè)峰與Wiley和NIST譜庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，僅選取相似度指數(shù)大于800的物質(zhì)，同時(shí)通過(guò)比對(duì)文獻(xiàn)化合物中的相對(duì)保留指數(shù)對(duì)所得化合物定性結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3.3 辣木籽油生育酚含量測(cè)定

皂化前處理[25]：準(zhǔn)確稱取1.0 g油樣于10 mL皂化管中，依次加入0.1 g VC、3 mL氫氧化鉀-95%乙醇（2 mol/L）溶液，渦旋30 s后，在90 ℃恒溫振蕩器（220 r/min）中振蕩反應(yīng)60 min，皂化后冷卻，加入5 mL正己烷，渦旋5 min后，5 000 r/min離心10 min，取上清液，重復(fù)2 次。將上清液旋蒸干燥至1 nL左右，用甲醇定容至10 mL。過(guò)0.45 μm濾膜，進(jìn)行高效液相色譜分析。

標(biāo)準(zhǔn)品的配制：分別稱取10 mg的α-生育酚和δ-生育酚標(biāo)準(zhǔn)品，溶于100 mL乙醇中，過(guò)0.45 μm濾膜，進(jìn)行高效液相色譜分析。

高效液相色譜條件：Symmetry C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇，流速1. 0 mL/min，等度洗脫，柱溫30 ℃。α-生育酚和δ-生育酚的檢測(cè) 波長(zhǎng)均為292 nm[25]。

1.3.4 辣木籽油甾醇含量測(cè)定

取1.3.3節(jié)中皂化后的樣品，過(guò)0.45 μm微孔濾膜后，進(jìn)行高效液相色譜測(cè)定[25]。

標(biāo)準(zhǔn)品的配制：分別稱取10 mg豆甾醇的標(biāo)準(zhǔn)品，溶于100 mL乙醇中，過(guò)0.45 μm濾膜，進(jìn)行高效液相色譜分析。

高效液相色譜條件：SymmetryC18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇，流速為1.0 mL/min，等度洗脫，柱溫30 ℃。豆甾醇的檢測(cè)波長(zhǎng)為205 nm，進(jìn)樣量10 μL。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均為3 組平行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)取平均值；采用IBM SPSS Statistics 25（IBM, Armonk, NY, USA）軟件進(jìn)行PCA、CA以及顯著性分析，采用Tukey's HSD法進(jìn)行多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣木籽含油量分析

如表2所示，云南八產(chǎn)地辣木籽樣品的含油量在19.50%～26.34%之間，平均含油量為23.10%。含油量最高的是臨滄市耿馬縣辣木樣品S6（23.95%），含油量低的是麗江市華坪縣辣木樣品S5（21.95%），但總體上看，八產(chǎn)地的辣木籽樣品的含油量無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

表2 不同產(chǎn)地辣木籽的含油量Table 2 Oil yields of M. oleifera seeds from different areas

2.2 辣木籽油脂肪酸組成的氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果

圖1 辣木籽油（S8）脂肪酸樣品的典型總離子流圖Fig. 1 Typical total ion current chromatograms of fatty acids of M. oleifera seed oil (S8) from Shuangbai county, Yunnan

表3 云南八產(chǎn)地辣木籽油脂肪酸組成的氣相色譜-質(zhì)譜分析Table 3 GC-MS analysis results of fatty acid components of M. oleifera seed oils from eight areas of Yunnan

由圖1、表3可知，從云南八產(chǎn)地辣木籽油中均檢測(cè)出20 種脂肪酸，其組成基本一致，其脂肪酸含量前十位分別為9-十八碳烯酸（油酸）、二十二烷酸（山崳酸）、十六烷酸（棕櫚酸）、十八烷酸（硬脂酸）、二十烷酸（花生酸）、(E)-11-二十烯酸、7-十六碳烯酸、二十四烷酸（木焦油酸）、13-二十二碳烯酸（芥酸）以及十七烷酸，可以認(rèn)為這10 種成分是辣木籽油脂肪酸的主要特征成分。本研究中選用的云南八產(chǎn)地辣木籽油樣品中，不飽和脂肪酸含量平均占65.39%，其中，油酸含量最高（50.16%～56.51%），略低于云南省紅河州的辣木籽油樣品（71.90%）[19]。

2.3 辣木籽油生育酚和甾醇含量測(cè)定結(jié)果

表4 云南八產(chǎn)地辣木籽油VE和甾醇含量Table 4 Contents of tocopherol and sterol of M. oleifera seed oil samples from eight areas of Yunnan

作為一種公認(rèn)的天然抗氧化劑，生育酚具有抑制膽固醇合成及腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、改善動(dòng)脈粥樣硬化及預(yù)防心血管疾病等生理功效。在化學(xué)結(jié)構(gòu)上均系苯二氫吡喃的衍生物，根據(jù)甲基位置及數(shù)量的不同分為α、β、γ和δ幾種。本實(shí)驗(yàn)中選取α-生育酚和δ-生育酚為代表，研究辣木籽油生育酚的組成，其中α-生育酚的生理活性最強(qiáng)，植物油中生育酚的存在對(duì)油脂的氧化穩(wěn)定性亦具有重要意義。由表4可以看出，辣木籽油中α-生育酚含量為45～80 mg/100 g，平均含量為62 mg/100 g，高于呂秋冰等[26]報(bào)道的超聲波輔助提取所得辣木籽油的α-生育酚（0.945 mg/100 g）。辣木籽油中δ-生育酚含量為0.21～0.53 mg/100 g，平均含量為0.40 mg/100 g。

甾醇在降低血清膽固醇、抗菌及消炎等方面具有顯著療效，本實(shí)驗(yàn)中以豆甾醇為代表，研究辣木籽油樣品中的甾醇含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，辣木籽油中豆甾醇含量為243～495 mg/100 g，平均含量為369 mg/100 g。豆甾醇含量最高的辣木籽油產(chǎn)地為S3（西雙版納州景洪市），含量為495 mg/100 g，高于葡萄籽中的豆甾醇含量（15 mg/100 g）[27]。

2.4 不同產(chǎn)地辣木籽油的多元統(tǒng)計(jì)分析

2.4.1 不同產(chǎn)地辣木籽油的PCA

采用IBM SPSS Statistics 25軟件對(duì)云南八產(chǎn)區(qū)辣木籽油樣品含量前十的脂肪酸含量、α-生育酚、δ-生育酚以及豆甾醇進(jìn)行PCA，結(jié)果顯示前4 個(gè)主成分的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為93.234%（表5），說(shuō)明前4 個(gè)主成分基本包含了辣木籽油脂肪酸組成的絕大部分信息，可用于綜合品質(zhì)評(píng)價(jià)與分類。在前4 個(gè)主成分中，PC1的貢獻(xiàn)率為28.550%，貢獻(xiàn)最大的為十八烷酸（硬脂酸），對(duì)應(yīng)的特征值為0.371。PC2的貢獻(xiàn)率為28.452%，貢獻(xiàn)最大的為9-十八碳烯酸（油酸）和豆甾醇，對(duì)應(yīng)的特征值為0.392和0.198。PC3的貢獻(xiàn)率為19.214%，貢獻(xiàn)最大的為(E)-11-二十烯酸（花生油酸），對(duì)應(yīng)的特征值為－0.468。PC4的貢獻(xiàn)率為17.018%，貢獻(xiàn)最大的為十七烷酸，對(duì)應(yīng)的特征值為0.415。

表5 PCA特征向量、特征值、方差貢獻(xiàn)率及累計(jì)方差貢獻(xiàn)率Table 5 Eigenvectors, eigenvalues, contribution rates and cumulative contribution rates to total variance of principal components

圖2 云南八產(chǎn)地辣木籽油樣品的PCA評(píng)分圖Fig. 2 PCA Score plot of M. oleifera seed oil samples from eight areas of Yunnan

PCA可以有效區(qū)分不同產(chǎn)地辣木籽油樣品的脂肪酸組成、生育酚及豆甾醇的含量，如圖2所示，在PC1方向上，8 個(gè)樣品明顯分為3 個(gè)部分，分別為S3、S8以及余下的6 個(gè)樣品，3 組樣品在PC2方向也表現(xiàn)出了極大的成分差異性。以4 個(gè)主成分F1、F2、F3和F4與其方差貢獻(xiàn)率構(gòu)建辣木籽油品質(zhì)指標(biāo)綜合得分模型F總，F(xiàn)總為因變量，F(xiàn)1、F2、F3和F4為自變量，F(xiàn)總為F1、F2、F3和F4的線性組合：

F總=28.550%F1+28.452%F2+19.214%F3+17.018%F4

各產(chǎn)地辣木籽油在各個(gè)主成分的得分值見(jiàn)表6，分值越高代表品質(zhì)越好。結(jié)果顯示，各產(chǎn)地辣木籽油品質(zhì)評(píng)價(jià)模型得分具有一定差異性，表明不同產(chǎn)地辣木籽油在脂肪酸組成、生育酚及豆甾醇的含量上存在產(chǎn)地差異性，根據(jù)得分和排序，西雙版納州景洪市的S3樣品綜合得分為1.232，高于其他樣品的得分。該樣品具有最高的油酸相對(duì)含量（56.51%）、不飽和脂肪酸總相對(duì)含量（70.11%）、α-生育酚含量（80 mg/100 g）、δ-生育酚含量（0.53 mg/100 g）以及豆甾醇含量（495 mg/100 g），具有最優(yōu)的綜合品質(zhì)。

表6 云南八產(chǎn)地辣木籽油樣品質(zhì)量評(píng)價(jià)Table 6 Quality evaluation of M. oleifera seed oil samples from eight areas of Yunnan

2.4.2 不同產(chǎn)地辣木籽油的CA

圖3 云南八產(chǎn)地辣木籽油樣品的CA樹(shù)狀圖Fig. 3 Cluster analysis dendrogram of M. oleifera seed oil samples from eight areas of Yunnan

采用IBM SPSS Statistics 25軟件對(duì)辣木籽油脂肪酸數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)CA，以平方歐式距離為度量標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)組間連接的方式，對(duì)云南八產(chǎn)地辣木籽油的脂肪酸組成進(jìn)行CA。由圖3可知，當(dāng)距離刻度為1～25時(shí)，云南八產(chǎn)地辣木籽樣品可分為3 個(gè)集群，第1個(gè)集群是S3單獨(dú)為1 個(gè)集群，該樣品綜合得分為1.232，綜合PCA得分排名第1；其余7 個(gè)樣品（S1、S5、S4、S6、S8、S2以及S7）為第2個(gè)集群，綜合得分在－0.624～0.215之間，綜合品質(zhì)低于S3。由此可見(jiàn)，CA可以根據(jù)刻度不同獲得多種分類結(jié)果，其在刻度為1～25時(shí)的分類結(jié)果同PCA分析一致，說(shuō)明2 種分析方法均可對(duì)八產(chǎn)地辣木籽樣品進(jìn)行分類，并通過(guò)分類進(jìn)行綜合品質(zhì)評(píng)價(jià)，為今后辣木籽油的生產(chǎn)加工中的品種篩選提供理論依據(jù)。

3 討論與結(jié)論

作為辣木加工副產(chǎn)物，辣木籽富含多種功能性成分，在食品、藥用及輕工等方面具有很大的應(yīng)用價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)以云南八產(chǎn)地辣木籽油為原料，分析辣木籽油中脂肪酸、α-生育酚、δ-生育酚及豆甾醇這幾類脂溶性活性成分的含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，云南八產(chǎn)地辣木籽油均含有20 種脂肪酸，不飽和脂肪酸相對(duì)含量平均為65.39%，其中9-十八碳烯酸（油酸）的相對(duì)含量均大于50%。辣木籽油中α-生育酚（45～80 mg/100 g）、δ-生育酚（0.21～0.53 mg/100 g）、豆甾醇（243～495 mg/100 g）具有開(kāi)發(fā)功能性大健康產(chǎn)品的潛力。生育酚和豆甾醇的含量差異顯著，可能與不同產(chǎn)地的地理環(huán)境、氣候條件等因素有關(guān)。通過(guò)PCA，根據(jù)特征向量構(gòu)建主成分與各產(chǎn)地辣木籽油品質(zhì)指標(biāo)之間的線性函數(shù)，構(gòu)建了辣木籽油綜合品質(zhì)評(píng)價(jià)模型，得到不同樣品綜合品質(zhì)得分從高到低為S3、S1、S5、S4、S6、S8、S2、S7。其中，西雙版納州景 洪市S3樣品的品質(zhì)明顯高于其他產(chǎn)地樣品，表明綜合指標(biāo)評(píng)價(jià)系統(tǒng)能用于辣木籽油品質(zhì)評(píng)價(jià)。通過(guò)CA，云南八產(chǎn)地辣木籽油可分成2 個(gè)集群，綜合評(píng)分最高的S3為一個(gè)集群，其余7 個(gè)樣品為第2個(gè)集群，結(jié)果與PCA一致。因此，PCA和CA能較好反映辣木籽油樣品間的差異性，本研究可為辣木籽精深加工提供一定的參考依據(jù)。