子宮內(nèi)膜癌中長(zhǎng)鏈非編碼RNA 表達(dá)譜的生物信息學(xué)分析

建方方，車曉霞，馮煒煒

1. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海 200025；2. 復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院婦科，上海 200011

子宮內(nèi)膜癌（endometrial cancer，EC）是女性生殖系統(tǒng)中常見(jiàn)的三大惡性腫瘤之一，其在女性生殖道惡性腫瘤中占比20%～30%，在女性惡性腫瘤中占比約7%。據(jù)2016 年流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)顯示，在全球范圍內(nèi)該疾病每年約有320 000 例新發(fā)病例、76 000 例死亡病例，嚴(yán)重威脅著女性的生命健康[1]。目前，臨床上針對(duì)EC 的治療手段主要有手術(shù)、化學(xué)治療及放射治療等，但上述方法對(duì)晚期及復(fù)發(fā)患者而言，治療效果并不理想。因此，全面了解EC 發(fā)病的分子機(jī)制對(duì)其臨床治療的開(kāi)展具有舉足輕重的作用。

長(zhǎng) 鏈 非 編 碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一類轉(zhuǎn)錄物長(zhǎng)度超過(guò)200 個(gè)核苷酸的RNA，其本身不編碼蛋白質(zhì)，而是以RNA 的形式在多種層面上調(diào)控基因的表達(dá)，參與多種生物學(xué)功能的發(fā)揮[2]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，lncRNAs 可在人類腫瘤組織中異常表達(dá)，并在腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中起促癌或抑癌作用[3]。研究[4]表明，HOTAIR 在EC 中高表達(dá)，且和腫瘤分期、子宮肌層浸潤(rùn)以及淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)。Guo 等[5]發(fā)現(xiàn)MEG3 在EC 中表達(dá)下調(diào)，并能夠通過(guò)調(diào)控Notch 信號(hào)通路抑制內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖。然而目前已發(fā)現(xiàn)的與EC 有關(guān)的lncRNAs 相對(duì)較少，且其如何在內(nèi)膜癌組織中發(fā)揮作用尚待深入研究?；诖耍狙芯坎捎棉D(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)21 例EC 組織和5 例正常內(nèi)膜組織進(jìn)行分析，獲得lncRNAs 和mRNA 的差異表達(dá)譜。隨后，僅就lncRNAs 部分進(jìn)行探討，即通過(guò)生物信息分析初步探索lncRNAs 可能涉及的生物學(xué)過(guò)程及信號(hào)通路，以期在轉(zhuǎn)錄組水平了解EC 中l(wèi)ncRNAs 的表達(dá)變化情況，為進(jìn)一步探索EC 的發(fā)病機(jī)制及治療靶點(diǎn)提供科學(xué)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本

EC 組織標(biāo)本源于2013 年5 月—2018 年12 月于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院診治的且經(jīng)術(shù)后病理診斷為EC 的患者，共計(jì)21 例；其中，高級(jí)別腺癌6 例、漿液性癌6 例、內(nèi)膜樣腺癌8 例和透明細(xì)胞癌1 例。正常內(nèi)膜組織源于同期因異常子宮出血于我院就診的，經(jīng)診刮及術(shù)后病理診斷為處于子宮內(nèi)膜增生期或分泌期的患者，共計(jì) 5 例。本研究已獲得上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院倫理委員會(huì)審批。所有被采集的患者均簽署了知情同 意書(shū)。

1.2 主要試劑

TRIzol 總RNA 抽提試劑、SuperscriptTMⅢ 反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒及實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 試劑盒均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，異丙醇、氯仿、無(wú)水乙醇、甲醇均購(gòu)自上海振興化工一廠。

1.3 研究方法

1.3.1 組織標(biāo)本的RNA 抽提及純化 依據(jù)試劑說(shuō)明書(shū)的標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行。采用TRIzol 總RNA 抽提試劑提取EC 組織標(biāo)本及正常內(nèi)膜組織標(biāo)本的總RNA，經(jīng)Agilent Bioanalyzer 2100（美國(guó)安捷倫公司）電泳質(zhì)檢合格后使用RNeasy Micro Kit 和 RNase-Free DNase Set 純化總RNA。而后，經(jīng)NanoDrop 2000 分光光度計(jì)及Agilent Bioanalyzer 2100 對(duì)其濃度進(jìn)行測(cè)定，合格的RNA 可用于后續(xù)測(cè)序?qū)嶒?yàn)。

1.3.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及數(shù)據(jù)分析 本研究數(shù)據(jù)來(lái)源于HiSeq×Ten（美國(guó)Illumina 公司），采用150 bp 雙端測(cè)序。通過(guò) FASTQC（v0.11.5）軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，使用Cutadapt（v1.10）軟件去除接頭序列，再使用Hisat2（v2.0.5）軟件將讀序比對(duì)至基因組（基因組版本為hg19），使用Stringtie（v1.3.3b）軟件進(jìn)行組裝。使用R 語(yǔ)言中DESeq2 對(duì)EC 組織標(biāo)本及正常內(nèi)膜組織標(biāo)本的lncRNAs的差異表達(dá)進(jìn)行分析。基因表達(dá)的差異用P 值和差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）的對(duì)數(shù)（logFC）表示。設(shè)置參數(shù)P＜0.05 且|log2FC|＞1 為閾值，篩選差異表達(dá)的lncRNAs。對(duì)上述獲得的lncRNAs 進(jìn)行GO（Gene Ontology）功能分析和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome）通路分析。

1.3.3 反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量PCR 驗(yàn)證分析 為了驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果，本研究將樣本量進(jìn)行擴(kuò)大，即納入47 例EC組織標(biāo)本及19 例正常內(nèi)膜組織標(biāo)本，抽提RNA 的步驟見(jiàn)1.3.1。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明，將相關(guān)試劑與0.5 μg 總RNA 混合均勻（總體積為20 μL，加入RNA 體積根據(jù)濃度計(jì)算）進(jìn)行反應(yīng)，條件如下：42 ℃ 1 h，95 ℃ 5 min。而后使用SYBR Premix Ex Taq 試劑盒，將1 μL cDNA 與相關(guān)試劑混合配置10 μL 反應(yīng)體系進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）反應(yīng)，條件如下：90 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，共20 個(gè)循環(huán)。以甘油醛-3-磷 酸 脫 氫 酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，Gapdh） 為內(nèi)參，基因的相對(duì)量用2-△△CT進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行3 次分析（即設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔）。lncRNAs 引物均由上海冠泰生物科技有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 qPCR 引物序列Tab 1 Primer sequences for qPCR

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 GraphPad Prism 6.0 軟件對(duì)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。qPCR 數(shù)據(jù)以±s 表示，采用t 檢驗(yàn)進(jìn)行比較。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)lncRNAs 的篩選

本研究采用R 語(yǔ)言中DESeq2 對(duì)EC 組織標(biāo)本及正常內(nèi)膜組織標(biāo)本中的差異表達(dá)lncRNAs 進(jìn)行篩選，并采用聚類熱圖進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，共篩選出3 060 個(gè)差異表達(dá)lncRNAs，其中上調(diào)表達(dá)2 046 個(gè)、下調(diào)表達(dá)1 014 個(gè) （圖1、表2、表3）；在2 個(gè)組織中差異表達(dá)10 倍以上的lncRNAs 共859 個(gè)，其中上調(diào)表達(dá)的lncRNAs 占 比75%。

圖1 差異表達(dá)lncRNAs 的聚類熱圖Fig 1 Heat map of differentially expressed lncRNAs

表2 表達(dá)上調(diào)最顯著的前20 個(gè)lncRNAsTab 2 Top 20 of the most significant up-regulated lncRNAs

表3 表達(dá)下調(diào)最顯著的前20 個(gè)lncRNAsTab 3 Top 20 of the most significant down-regulated lncRNAs

2.2 qPCR 驗(yàn)證

為了驗(yàn)證上述測(cè)序結(jié)果，本研究隨機(jī)篩選了6 個(gè)lncRNAs， 包 括3 個(gè) 上 調(diào) 表 達(dá)lncRNAs（LINC01158、SOX21-AS1、HOXC-AS2） 和3 個(gè) 下 調(diào) 表 達(dá)lncRNAs（HAND2-AS1、MEG3、LINC00595），于47 例EC 組 織標(biāo)本和19 例正常內(nèi)膜組織標(biāo)本中進(jìn)行qPCR 驗(yàn)證。結(jié)果（圖2）顯示，這些lncRNAs 的表達(dá)情況和本研究的測(cè)序結(jié)果相一致，從而證實(shí)上述測(cè)序結(jié)果較為可靠。

圖2 qPCR 檢測(cè)EC 組織標(biāo)本和正常內(nèi)膜組織標(biāo)本中6 個(gè)lncRNAs 的表達(dá)差異Fig 2 Expression differences of 6 lncRNAs in EC tissues and normal endometrial tissues by qPCR

2.3 差異表達(dá)lncRNAs 在2 組測(cè)序數(shù)據(jù)中的交集分析

為進(jìn)一步挖掘參與EC 的發(fā)生與發(fā)展的重要lncRNAs，本研究結(jié)合癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)中EC 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，就差異表達(dá)lncRNAs 在本研究轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中的表達(dá)差異進(jìn)行比較分析，結(jié)果顯示共有33 個(gè)lncRNAs在上述2 組測(cè)序數(shù)據(jù)中均表達(dá)上調(diào)，包括TFAP2AAS1、SOX21-AS1、SIX3-AS1、RHPN1-AS1、OSTM1-AS1、NAALADL2-AS2、MNX1-AS1、MIR210HG、MIR205HG、 LINC01158、LINC01143、LINC01093、LINC01037、LINC00958、LINC00898、LINC00885、LINC00668、LINC00648、LINC00511、LINC00355、LINC00336、LINC00237、HOXC-AS3、HOXC13-AS、GS1-594A7.3、DLEU7-AS1、CASC9、AFAP1AS1、AC123023.1、AC112721.2、AC106875.1、AC092168.2及AC007128.1；同 時(shí)， 有24 個(gè)lncRNAs 在 上 述2 組測(cè)序數(shù)據(jù)中均表達(dá)下調(diào)，包括WT1-AS、PRICKLE2-AS2、NR2F2-AS1、MIR503HG、MIR497HG、MEG3、MEF2C-AS1、MAGI2-AS3、MAGG1-AS1、LINC01140、LINCO1016、LINC00994、LINC00629、JAZF1-AS1、HAND2-AS1、GAS6-AS2、DIO3OS、CTD-2270F17.1、CACNA1G-AS1、ADAMTS9-AS2、 SOCS2-AS1、ACTA2-AS1、AC009110.1 及A2M-AS1。

2.4 GO 功能分析和KEGG 通路分析

為更好地分析差異表達(dá)lncRNAs 涉及的生物學(xué)過(guò)程、分子功能及細(xì)胞成分，本研究對(duì)差異表達(dá)lncRNAs 進(jìn)行GO 功能分析，結(jié)果（圖3）顯示其主要與細(xì)胞黏附、免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞增殖等相關(guān)。同時(shí)，采用KEGG通路分析對(duì)差異表達(dá)lncRNAs 進(jìn)行研究，結(jié)果（圖4）顯示其主要富集在PI3K-Akt 信號(hào)通路、細(xì)胞黏附分子、細(xì)胞因子受體等相關(guān)通路。

圖3 差異表達(dá)lncRNAs 的GO 功能分析Fig 3 GO function analysis of differentially expressed lncRNAs

圖4 差異表達(dá)lncRNAs 的KEGG 通路分析Fig 4 KEGG pathway analysis of differentially expressed lncRNAs

3 討論

既往研究[2]認(rèn)為，lncRNAs 是RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物，是基因組轉(zhuǎn)錄的“噪音”，不具有生物學(xué)功能。然而，近年來(lái)的大量研究[6]表明，lncRNAs 參與了DNA 甲基化、染色質(zhì)重塑、組蛋白修飾、細(xì)胞周期調(diào)控、mRNA降解和翻譯調(diào)控等多種生物學(xué)過(guò)程；且部分lncRNAs 還在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮了重要作用[7]。

目前，鮮少有關(guān)于EC 的lncRNAs 的表達(dá)譜的相關(guān)分析。Chen 等[8]對(duì)6 例早期低級(jí)別Ⅰ型EC 組織及癌旁組織的lncRNAs 表達(dá)譜進(jìn)行測(cè)序分析，研究lncRNAs 的微肽翻譯潛能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)部分lncRNAs 具有微肽翻譯潛力，其可能通過(guò)自身翻譯產(chǎn)物發(fā)揮調(diào)控功能；該研究結(jié)合既往卵巢癌及宮頸癌lncRNAs 測(cè)序結(jié)果，對(duì)婦科生殖系統(tǒng)三大腫瘤的差異表達(dá)lncRNAs 進(jìn)行meta 分析，結(jié)果顯示部分lncRNAs 在2 種以上腫瘤中均存在差異表達(dá)，如在EC 中有4 個(gè)特異表達(dá)的lncRNAs，包括上調(diào)表達(dá)的LINC00645、LINC01480 以 及 下 調(diào) 表 達(dá) 的LINC00702、LINC00891，其中LINC00645 在本研究的測(cè)序結(jié)果中顯示上調(diào)表達(dá)近5 倍。Li 等[9]研究發(fā)現(xiàn)LINC00645 在腦膠質(zhì)瘤中表達(dá)上調(diào)，且與患者的生存率及預(yù)后相關(guān)；繼而提示，LINC00645 也可能在EC 的發(fā)生及發(fā)展中扮演了重要角色。

本研究利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)分析了21 例EC 組織標(biāo)本及5 例正常內(nèi)膜組織標(biāo)本的lncRNAs 的差異表達(dá)譜。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，共篩選出上調(diào)表達(dá)lncRNAs 2 046 個(gè)、下調(diào)表達(dá)lncRNAs 1 014 個(gè)，即在EC 中存在一系列異常表達(dá)的lncRNAs，繼而表明lncRNAs 在EC 的發(fā)病機(jī)制中可能具有潛在作用。同時(shí)，有部分lncRNAs 在EC 中的作用已被報(bào)道，如H19、MEG3 等[5,8]。另外，本研究的測(cè)序結(jié)果中還發(fā)現(xiàn)了大量新的差異表達(dá)lncRNAs，且大部分的lncRNAs 功能尚不清楚。

隨后，本研究采用GO 功能分析和KEGG 通路分析對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行初步分析。GO 功能分析結(jié)果顯示，差異表達(dá)lncRNAs 主要涉及的生物學(xué)過(guò)程包括細(xì)胞黏附、免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞增殖等；繼而提示，免疫及炎癥反應(yīng)可能在調(diào)節(jié)EC 生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。同時(shí)，KEGG 通路分析結(jié)果顯示，差異表達(dá)lncRNAs 主要與PI3K-Akt 信號(hào)通路、腫瘤相關(guān)信號(hào)通路、細(xì)胞黏附分子、細(xì)胞因子受體等信號(hào)通路，這些所涉及的生物學(xué)過(guò)程與信號(hào)通路均與腫瘤特性相關(guān)。

本研究結(jié)合TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中EC 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)共有57 個(gè)lncRNAs 同時(shí)在TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)及本研究測(cè)序結(jié)果中表達(dá)上調(diào)或下調(diào)，提示這些lncRNAs 可能參與EC 的發(fā)生；其中，有少數(shù)lncRNAs 在EC 的相關(guān)研究中已被報(bào)道[5,8]，但其是否可作為EC 的特異性lncRNAs 以及診斷、治療的靶標(biāo)，尚需體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)等進(jìn)一步驗(yàn)證。2018 年Yang 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，HAND2-AS1 在子宮內(nèi)膜樣癌中的表達(dá)顯著下調(diào)，且與該疾病的組織分級(jí)、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)相關(guān)；且在體外模型中，過(guò)表達(dá)HAND2-AS1 能明顯抑制EC 細(xì)胞的遷移及侵襲。在本研究中，qPCR 驗(yàn)證結(jié)果提示SOX21-AS1 在EC 中表達(dá)明顯上調(diào)。既往研究[11-13]顯示，SOX21-AS1 在肝癌、結(jié)直腸癌、肺癌及宮頸癌等多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)；且在宮頸癌中SOX21-AS1 甲基化水平有明顯降低，但其表達(dá)水平則明顯升高，就臨床樣本分析發(fā)現(xiàn)其與國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO）分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及宮頸浸潤(rùn)深度均呈正相關(guān)。另 外，WT1-AS、 HOXC-AS3、 AFAP1-AS1、HAND2-AS1等多個(gè)lncRNAs 在宮頸癌、肝癌、乳腺癌、胃癌等腫瘤中均有相關(guān)研究報(bào)道[14-18]。目前，上述lncRNAs 在EC 中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道，有待后續(xù)進(jìn)一步探究。

綜上，本研究通過(guò)對(duì)EC 組織和正常內(nèi)膜組織的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序分析其lncRNAs 差異表達(dá)譜，結(jié)果顯示2 個(gè) 組織樣本中l(wèi)ncRNAs 的表達(dá)存在顯著差異；進(jìn)一步的功能分析提示，部分lncRNAs 可能參與EC 的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程。由于lncRNAs 具有較高的組織特異性，深入分析這些lncRNAs 或?qū)镋C 的研究及靶向治療提供新思路。

參·考·文·獻(xiàn)

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