利拉魯肽作用腸道固有淋巴細(xì)胞改善小鼠炎癥性腸病

李 月 ，孫寒曉，殳 潔，李詠梅，盛慧明#

1. 北華大學(xué)醫(yī)學(xué)院，吉林132013；2. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海200336

炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）是一種慢性炎癥性腸道疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）和克羅恩?。–rohn's disease，CD）[1]。流行病學(xué)顯示IBD 發(fā)病率在亞洲國(guó)家和其他發(fā)展中國(guó)家呈逐年上升趨勢(shì)[2]，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。目前，其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確[3]，臨床上并無(wú)完全治愈IBD 的有效治療手段。因此，進(jìn)一步探討IBD 的發(fā)病機(jī)制，尋找新的防治策略和干預(yù)靶點(diǎn)是目前亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。

胰高血糖素樣肽-1 受體激動(dòng)劑（glucagon-like peptide-1 receptor agonist，GLP-1RA）是目前治療2 型糖尿病的有效藥物，且經(jīng)FDA 批準(zhǔn)使用的GLP-1RA 主要有利拉魯肽、艾塞那肽等[4]。研究[5]表明利拉魯肽不僅具有血糖調(diào)節(jié)作用，還具有抗炎等特性，但關(guān)于利拉魯肽參與腸道炎癥的抗炎作用研究甚少。

隨著對(duì)IBD 的作用機(jī)制的深入研究，人們逐漸聚焦到了一類新的免疫細(xì)胞——固有淋巴細(xì)胞（innate lymphoid cell，ILC）。ILC 是一類與T 淋巴細(xì)胞表型和功能相似的天然免疫細(xì)胞[6]。ILC 家族主要分為3 個(gè)亞群，分別是 1 型ILC（group 1 ILC，ILC1）和自然殺傷細(xì)胞（natural killer cell，NK） 細(xì) 胞、2 型ILC（group 2 ILC，ILC2）、淋巴組織誘導(dǎo)細(xì)胞和3 型ILC（group 3 ILC，ILC3）[7-8]。ILC 可分泌細(xì)胞因子，主要通過(guò)與間質(zhì)細(xì)胞以及其他免疫細(xì)胞之間的相互作用在IBD 等多種自身免疫性疾病中發(fā)揮效應(yīng)[9]。研究[10-11]顯示ILC 參與腸道黏膜穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)，并在IBD 的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用。

葡聚糖硫酸鈉鹽（dextran sulfate sodium，DSS）誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型所致臨床和病理特征與人類IBD 相似，因此是研究IBD 常用的動(dòng)物疾病模型[12-13]。本研究通過(guò)對(duì)C57BL/6 小鼠進(jìn)行DSS 誘導(dǎo)構(gòu)建小鼠IBD 模型，應(yīng)用利拉魯肽進(jìn)行治療，從小鼠的糞便性狀、結(jié)腸外觀和病理改變、免疫細(xì)胞數(shù)量以及炎性細(xì)胞因子的表達(dá)等方面評(píng)估利拉魯肽對(duì)DSS 誘導(dǎo)IBD 小鼠的作用，以期為輔助治療IBD 提供新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6 ～10 周齡C57BL/6 野生型雌性小鼠，體質(zhì)量16 ～22 g，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（滬）2017-0005。所有小鼠均飼養(yǎng)在中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所SPF 級(jí)動(dòng)物房，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為（滬）SYXK2019-0001。飼養(yǎng)條件如下：動(dòng)物房室內(nèi)溫度18 ～22 ℃，相對(duì)濕度50%～60%，分籠飼養(yǎng)，自由攝食飲水，適應(yīng)環(huán)境后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均得到中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所醫(yī)學(xué)研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 GalliosTM流式細(xì)胞儀（美國(guó)貝克曼公司），ECLIPSE 80i 顯微鏡（日本尼康公司），ZHWY-100H經(jīng)典型多振幅軌道搖床（中國(guó)智城分析儀器制造有限公司），Eppendorf AG 22331 Hamburg 低速離心機(jī)（德國(guó)艾本德公司）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 FITC 標(biāo)記的CD3e 抗體、CD11b 抗體、CD11c 抗體、B220 抗體、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GMCSF）抗體，PE 標(biāo)記的白介素-5 （interleukin-5，IL-5）抗體，APC 標(biāo)記的視黃酸相關(guān)的孤兒受體γt （retinoid-related orphan receptor γt，RORγt） 抗 體，PerCP-Cy5.5 標(biāo) 記 的CD11b 抗體、IL-17A 抗體，PE-Cy7 標(biāo)記的IL-13 抗體、CD3e 抗體、CD11b 抗體（美國(guó)eBioscience 公司）；PE 標(biāo)記的Siglec-F（sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin F）抗體，APC 標(biāo)記的GATA3（GATA binding protein 3）抗 體、Ly6G（lymphocyte antigen 6 complex locus protein G6D）抗體（美國(guó)BD Biosciences 公司）；PE 標(biāo)記的IL-22抗體，PE-Cy7 標(biāo)記的CD11c 抗體，CD16/32 抗體（美國(guó)Biolegend 公司）；PE-Cy7 標(biāo)記的B220 抗體（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公 司 ）。PMA（phorbol-12-myristate-13-acetate）（美國(guó)Sigma 公司，貨號(hào)H9268-10G），離子霉素（美國(guó)Sigma 公司，貨號(hào)10004974-1），布雷菲德菌素A（美國(guó)Sigma 公司，貨號(hào)11861-5），LIVE/DEAD?固定式死細(xì)胞染色試劑盒（美國(guó)Invitrogen 公司，貨號(hào)L34955），F(xiàn)oxp3/轉(zhuǎn)錄因子染色緩沖液（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，貨號(hào)00-5523-00），蘇木精- 伊紅（hematoxylineosin，H-E）染色試劑盒（中國(guó)碧云天公司，貨號(hào)C0105），DSS（美國(guó)MP Biomedicals 公司，貨號(hào)160110），利拉魯肽諾和力注射液（丹麥諾和諾德公司，規(guī)格18 mg/3 mL），二硫蘇糖醇（美國(guó)Promega 公司，貨號(hào)V3155），乙二胺四乙酸（美國(guó)Invitrogen 公司，貨號(hào)25200-072），胎牛血清（美國(guó)GEMINI 公司，貨號(hào)900-108），脫氧核糖核酸酶Ⅰ（美國(guó)Sigma 公司，貨號(hào)DN25-1G），膠原酶Ⅷ（美國(guó)Sigma 公司，貨號(hào)C2139-500M），RPMI 1640 培養(yǎng)基（美國(guó)Invitrogen 公司，貨號(hào)22409015），Percoll 細(xì)胞分離液（德國(guó)Amersham/GE 公司，貨號(hào)17089102）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組及模型構(gòu)建 適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后，隨機(jī)選取20 只小鼠分為4 組，每組5 只，分別為對(duì)照組、利拉魯肽組、模型組和治療組。對(duì)照組小鼠每日飲用無(wú)菌水，并腹腔注射磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）；利拉魯肽組小鼠每日飲用無(wú)菌水，并腹腔注射利拉魯肽；模型組小鼠每日飲用DSS 濃度為3%的無(wú)菌水溶液，并腹腔注射PBS；治療組小鼠每日飲用DSS 濃度為3%的無(wú)菌水溶液，并腹腔注射利拉魯肽。注射液現(xiàn)用現(xiàn)配，PBS 劑量0.6 mg/ （kg·d），利拉魯肽劑量0.6 mg/ （kg·d），共處理7 d。每日觀察并記錄小鼠體質(zhì)量、糞便形態(tài)以及有無(wú)便血等情況，判斷結(jié)腸炎嚴(yán)重程度。

1.2.2 小鼠腸道固有層細(xì)胞的提取 無(wú)菌環(huán)境下取小鼠結(jié)腸，PBS 洗滌后，室溫下在含有1 mmol/L 二硫蘇糖醇的PBS 中振搖10 min，經(jīng)PBS 洗滌，在含有30 mmol/L 乙二胺四乙酸的PBS 中于37 ℃振蕩孵育10 min，重復(fù) 2 次。加入含有1% 胎牛血清、脫氧核糖核酸酶Ⅰ和膠原酶Ⅷ的RPMI 1640 培養(yǎng)液，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱消化1.5 h 后，劇烈搖動(dòng)組織勻漿，使其通過(guò)100 μm 細(xì)胞過(guò)濾器，室溫以1 048×g 離心20 min 后，從80%和40% Percoll 梯度液的中間層收獲腸道固有層細(xì)胞。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)分析 腸道固有層譜系（lineage，Lin）標(biāo)志物包括CD3e、B220、CD11b 和CD11c。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠結(jié)腸內(nèi)的中性粒細(xì)胞（CD11b+Ly6G+）、嗜酸 性 粒 細(xì) 胞（CD11b+Siglec-F+）、ILC2（Lin-GATA3+）和ILC3（Lin-RORγt+），以評(píng)估腸炎的嚴(yán)重程度。將分離出的腸道固有層細(xì)胞，用50 ng/mL PMA 和500 ng/mL 離子霉素刺激4 h，在收獲細(xì)胞前2 h 添加2 μg/mL 布雷菲德菌素A。收集細(xì)胞，使用CD16/32 抗體室溫孵育5 min，然后稀釋CD3e 抗體、B220 抗體、CD11b 抗體、CD11c抗體、Siglec-F 抗體和Ly6G 抗體，4 ℃孵育30 min 進(jìn)行細(xì)胞表面蛋白的染色。經(jīng)PBS 洗滌后，根據(jù)說(shuō)明書(shū)使用Foxp3/轉(zhuǎn)錄因子染色緩沖液將細(xì)胞進(jìn)行固定透化，胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子（GATA3、 RORγt）、細(xì)胞因子（IL-5、 IL-13、IL-17、IL-22 和GM-CSF） 于4 ℃孵 育45 min，PBS 洗滌重懸后經(jīng)GalliosTM流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析，數(shù)據(jù)經(jīng)Flow JoV10 軟件分析。

1.2.4 組織學(xué)分析 取小鼠肛門(mén)以上1 cm 處的結(jié)腸組織，長(zhǎng)約0.5 cm，PBS 洗滌后用4%多聚甲醛固定24 h，將組織包埋在石蠟中，制備5 μm 厚度的組織切片，進(jìn)行H-E 染色。使用光學(xué)顯微鏡隨機(jī)選取3 個(gè)視野，觀察結(jié)腸的病理改變。根據(jù)黏膜層炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度（1 ～3 分）、肌層炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度（0 ～2 分）、杯狀細(xì)胞缺失情況（0 ～2 分）、黏膜糜爛至潰瘍程度（0 ～2 分）等4 個(gè)方面，采用盲法進(jìn)行組織病理學(xué)分析并評(píng)分，最高得分為 9 分[14]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 6.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，定量資料用±s 表示，組間比較采用非配對(duì)Student's t 檢驗(yàn)。P＜0.05 時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 利拉魯肽顯著緩解DSS 誘導(dǎo)的IBD 小鼠結(jié)腸損傷

實(shí)驗(yàn)第5 日，模型組小鼠體質(zhì)量較第1 日下降12.23%，第6 ～7 日體質(zhì)量繼續(xù)下降。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中觀察到小鼠有稀便甚至血便現(xiàn)象，視為建模成功。模型組小鼠腸道內(nèi)血便情況較為嚴(yán)重，而治療組血便情況相對(duì)較輕。實(shí)驗(yàn)第5 日，與對(duì)照組相比，模型組小鼠體質(zhì)量明顯降低（P=0.014）；處理7 d 后，與模型組相比，治療組小鼠體質(zhì)量下降明顯緩解（P=0.043）（圖1A）。小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度比較結(jié)果顯示，模型組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度明顯短于對(duì)照組（P=0.008）；而治療組與模型組相比，結(jié)腸縮短情況明顯緩解（P=0.007）（圖1B、C）。

圖1 利拉魯肽顯著緩解DSS 誘導(dǎo)的IBD 小鼠結(jié)腸損傷Fig 1 Liraglutide significantly alleviated colon injury induced by DSS in IBD mice

2.2 利拉魯肽顯著緩解DSS 誘導(dǎo)的IBD 小鼠結(jié)腸黏膜屏障損傷

H-E 染色結(jié)果顯示，模型組小鼠黏膜上皮細(xì)胞大量壞死脫落，杯狀細(xì)胞缺失，黏膜下層存在淋巴細(xì)胞重度浸潤(rùn)，幾乎沒(méi)有完整的黏膜結(jié)構(gòu)（圖2A）。而經(jīng)過(guò)利拉魯肽處理后，組織學(xué)損傷得到了明顯改善，結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)、固有層腸腺、黏膜肌層相對(duì)完整，黏膜下層輕中度淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。組織病理學(xué)評(píng)分顯示，與對(duì)照組相比，模型組小鼠評(píng)分明顯升高（P=0.008）；而經(jīng)過(guò)利拉魯肽處理后，評(píng)分明顯降低（P=0.008）（圖2B）。

圖2 利拉魯肽顯著緩解DSS 誘導(dǎo)的IBD 小鼠結(jié)腸黏膜屏障損傷Fig 2 Liraglutide significantly alleviated the colonic mucosal barrier injury induced by DSS in IBD mice

2.3 利拉魯肽改善DSS 誘導(dǎo)的IBD 小鼠結(jié)腸內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)

應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠結(jié)腸內(nèi)嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞比例，以評(píng)估腸炎的嚴(yán)重程度，其分選策略如圖3A所示。結(jié)果（圖3B ～E）顯示模型組小鼠結(jié)腸內(nèi)嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞比例明顯高于對(duì)照組（均P=0.001），經(jīng)過(guò)利拉魯肽處理后，中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞比例較模型組顯著降低（P=0.004，P=0.002），說(shuō)明利拉魯肽能夠改善DSS 誘導(dǎo)的IBD 小鼠結(jié)腸內(nèi)炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)。

圖3 利拉魯肽改善DSS 誘導(dǎo)的IBD 小鼠結(jié)腸內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)Fig 3 Liraglutide improved the colonic inflammatory cell infiltration induced by DSS in IBD mice

2.4 利拉魯肽影響DSS 誘導(dǎo)的IBD 小鼠腸道ILC 的變化

應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠結(jié)腸ILC2、ILC3 及其分泌的細(xì)胞因子（分選策略如圖4A、B 所示），評(píng)估利拉魯肽處理前后ILC2、ILC3 數(shù)量和功能的變化。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組小鼠結(jié)腸內(nèi)ILC2 占總ILC 的比例升高（P=0.032），而經(jīng)過(guò)利拉魯肽處理后ILC2 比例較模型組降低（P=0.032），提示利拉魯肽可抑制結(jié)腸內(nèi)ILC2 的數(shù)量（圖4C）；但通過(guò)比較模型組與治療組之間ILC2 分泌的主要細(xì)胞因子IL-5、IL-13、IL-17 的水平，未發(fā)現(xiàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（結(jié)果未顯示）。與模型組相比，治療組ILC3 的比例明顯增加（P=0.008）（圖4D），其IL-22 的分泌水平亦明顯升高（P=0.008）（圖4E），但2 組間其他細(xì)胞因子IL-17、GM-CSF 分泌水平的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（結(jié)果未顯示）。

圖4 利拉魯肽影響DSS 誘導(dǎo)的IBD 小鼠腸道ILC 的變化Fig 4 Liraglutide affected the intestinal ILC of IBD mice induced by DSS

3 討論

本研究通過(guò)分析小鼠的體質(zhì)量變化、結(jié)腸長(zhǎng)度以及結(jié)腸的病理學(xué)改變、免疫細(xì)胞數(shù)量，明確利拉魯肽可延緩DSS 誘導(dǎo)的小鼠IBD 的發(fā)生發(fā)展。對(duì)結(jié)腸內(nèi)ILC 及其分泌的細(xì)胞因子分析后發(fā)現(xiàn)，經(jīng)利拉魯肽處理后，DSS 誘導(dǎo)的IBD 小鼠結(jié)腸內(nèi)ILC2 比例明顯降低，ILC3 比例明顯升高，且ILC3 分泌的細(xì)胞因子IL-22 的水平顯著增加。

ILC3 主要存在于腸黏膜組織中，表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子RORγt， 主要分泌IL-22、IL-17 和GM-CSF 等細(xì)胞因子，在黏膜穩(wěn)態(tài)和炎癥反應(yīng)中起重要作用[15]。IL-22 信號(hào)會(huì)誘導(dǎo)黏蛋白產(chǎn)生，還可通過(guò)促進(jìn)上皮細(xì)胞的增殖和存活來(lái)促進(jìn)組織修復(fù)。此外，IL-22 還能促進(jìn)核苷酸寡聚結(jié)構(gòu)域蛋白2（nucleotide oligomerization domain-containing protein 2，NOD2）產(chǎn)生，而NOD2 信號(hào)的激活也可促進(jìn)黏蛋白分泌，保護(hù)腸上皮細(xì)胞免受細(xì)菌侵襲。ILC3 產(chǎn)生的IL-22 可與腸上皮細(xì)胞表達(dá)的受體結(jié)合，通過(guò)激活蛋白酪氨酸激酶-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子（just another kinase-signal transducer and activator of transcription，JAK-STAT）信號(hào)通路，促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖，從而使上皮屏障保持完整性[16]。同時(shí)，IL-22 可以誘導(dǎo)產(chǎn)生抗微生物因子Reg（ regenerating） - Ⅲβ 和Reg- Ⅲγ，限制共生菌與上皮細(xì)胞接觸，避免腸道炎癥產(chǎn)生[17]。在本研究中，利拉魯肽作用后，腸固有層ILC3 比例及IL-22 的分泌明顯增加，說(shuō)明IL-22 可能通過(guò)以上方式在腸道黏膜免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。

ILC2 主要分布在腸道、肺部、淋巴組織、肝臟和腸系膜中[18]，主要分泌Ⅱ型細(xì)胞因子如IL-4、IL-5 和IL-13等。GATA3 是ILC2 的主要轉(zhuǎn)錄因子[19]，是ILC2 發(fā)育、存活和功能發(fā)揮的關(guān)鍵調(diào)控因子[20]。在唑酮誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型中，ILC2 由于受到IL-25 的刺激，可加速促進(jìn)腸道炎癥[21]。在新確診的IBD 患者中，疾病早期病變處腸黏膜內(nèi)ILC2 比例明顯增加[22]，提示ILC2 可能在IBD中發(fā)揮促進(jìn)炎癥的作用。另有研究[23]發(fā)現(xiàn)GLP-1RA 可作用于自身免疫性疾病，如抑制IL-33 的釋放以及過(guò)敏氣道炎癥，推測(cè)GLP-1RA 可能是治療ILC2 介導(dǎo)的過(guò)敏性哮喘的一種新手段。結(jié)合本研究結(jié)果，GLP-1RA 利拉魯肽可能通過(guò)抑制腸道ILC2 從而改善DSS 誘導(dǎo)的小鼠IBD，但其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

近年來(lái)研究[24]發(fā)現(xiàn)，ILC 與輔助性T 細(xì)胞類似，具有一定的可塑性。ILC2 在發(fā)育和維持過(guò)程中可能向ILC3 轉(zhuǎn)化，炎性ILC2 可能分化產(chǎn)生IL-17 的ILC3 樣細(xì)胞[25]。在人類CD 患者的腸樣本中發(fā)現(xiàn)ILC2 分泌的IL-13 和γ- 干擾素（interferon-γ，IFN-γ）明顯增加[26]，說(shuō)明炎性ILC3 可能轉(zhuǎn)變?yōu)榉置贗FN-γ 的ILC2 樣細(xì)胞。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)中ILC2比例降低伴ILC3 比例升高也提示，存在ILC2 向ILC3 轉(zhuǎn)化的可能性。既往研究表明ILC2 分泌的IL-4 對(duì)于抵抗細(xì)胞外寄生蟲(chóng)感染的保護(hù)性免疫至關(guān)重要[27]，同時(shí)也與IBD的嚴(yán)重程度有關(guān)[28]。所以利拉魯肽是否影響ILC2 分泌IL-4，進(jìn)而減緩疾病的進(jìn)程仍需后續(xù)研究進(jìn)一步明確。

此外，本研究仍具有一定的局限性：首先，DSS 誘導(dǎo)的IBD 小鼠模型僅模仿了UC 患者一些典型的組織病理學(xué)特征和某些免疫學(xué)特征，并不能完全代表CD 的復(fù)雜特征；其次，樣本例數(shù)較少。因此，迫切需要開(kāi)發(fā)能夠解決現(xiàn)有局限性且更接近CD 和UC 特征的其他實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚29]，并增加研究病例數(shù)以明確實(shí)驗(yàn)結(jié)論。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)GLP-1RA 利拉魯肽可能作用于腸道ILC，明顯延緩DSS 誘導(dǎo)的IBD 小鼠的疾病發(fā)生與發(fā)展，為利拉魯肽的潛在治療用途提供了理論依據(jù)。

參·考·文·獻(xiàn)

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