淄博市市售生食貝類中副溶血性弧菌污染水平調(diào)查

吳瑩 王銀平 張群

摘 要：為了解山東省淄博市市售生食貝類中副溶血性弧菌的污染狀況和毒力基因的攜帶情況，分別于2019年8、9、10月從不同區(qū)縣的零售市場(chǎng)采集牡蠣和毛蚶樣品共40份，運(yùn)用副溶血性弧菌MPN定量法和多重?zé)晒釳PN-PCR法對(duì)副溶血性弧菌的污染狀況和毒力基因的攜帶情況進(jìn)行調(diào)查。結(jié)果顯示，副溶血性弧菌（tlh基因）檢出率為47.50%（19/40），其中污染量≥110MPN/g的樣品占26.00%（5/19）;毒力基因（tdh、trh）陽(yáng)性15份，攜帶率37.50%（15/40），其中牡蠣攜帶率為45.00%（9/20），毛蚶攜帶率為30.00%（6/20）。故得出結(jié)論，淄博市市售牡蠣和毛蚶中副溶血性弧菌的污染水平較高，存在一定的食品安全風(fēng)險(xiǎn)。

關(guān)鍵詞：副溶血性弧菌 ?MPN定量法 ?多重?zé)晒釶CR法 ?毒力基因

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，VP）是一種嗜鹽性革蘭氏陰性菌，其普遍存在于海產(chǎn)品中。食用被該菌污染的食品后，人體常會(huì)出現(xiàn)腹瀉、嘔吐等胃腸道反應(yīng)，嚴(yán)重者可發(fā)生休克[1]。據(jù)報(bào)道，近年來(lái)由副溶血性弧菌引發(fā)的食物中毒呈現(xiàn)出明顯的上升趨勢(shì)——已超過(guò)沙門(mén)氏菌位居首位[2]。在沿海省份和地市，由副溶血性弧菌導(dǎo)致的食源性疾病事件占總數(shù)的一半以上[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，耐熱性直接溶血素（TDH）、TDH相關(guān)的溶血素（TRH）與副溶血弧菌致病性密切相關(guān)，被認(rèn)為是其主要毒力因子[5]。因此，本文對(duì)2019年山東省淄博市市售生食貝類中副溶血性弧菌的污染狀況和毒力基因攜帶情況進(jìn)行了分析，以期為科學(xué)有效地控制與治療由該菌引發(fā)的食物中毒提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

分別于2019年8、9、10月選取淄博市張店區(qū)、淄川區(qū)、周村區(qū)、桓臺(tái)縣市售的具有生食貝類代表性的牡蠣和毛蚶進(jìn)行采樣。選取超市、水產(chǎn)市場(chǎng)等作為采樣地點(diǎn)，用隨機(jī)抽樣的方法對(duì)相關(guān)樣品進(jìn)行采集。采集牡蠣共計(jì)20份，毛蚶共計(jì)20份，具體樣品采集分布情況見(jiàn)表1。

1.2 儀器和試劑

儀器：拍擊式均質(zhì)器，BAGMIXER400;恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司GHP-9160;低溫離心機(jī)，Thermo MULTIFUGEXIR;核酸提取儀，蘇州天隆科技有限公司;熒光定量PCR儀，美國(guó)ABI公司;VITEK 2 Compact生化鑒定儀。

試劑：3%氯化鈉堿性蛋白胨水、3%氯化鈉三糖鐵瓊脂、3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板，北京陸橋;弧菌顯色培養(yǎng)基，法國(guó)科瑪嘉;氧化酶試劑，bioMerieux，sa;VITEK2革蘭陰性桿菌鑒定卡、副溶血性弧菌（TDH、TRH、TLH）三重核酸檢測(cè)試劑盒，深圳生科原。

1.3 方法

依據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 副溶血性弧菌檢驗(yàn)》（GB 4789.7-2013）進(jìn)行定量檢測(cè)。

1.4 熒光定量PCR

依據(jù)《國(guó)家食品污染物和有害因素風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)工作手冊(cè)》進(jìn)行多重PCR實(shí)驗(yàn)，以及毒力基因檢測(cè)。結(jié)果判讀：tlh基因陽(yáng)性記為副溶血性弧菌陽(yáng)性，tdh、trh任一基因陽(yáng)性則應(yīng)記為致病性副溶血性弧菌陽(yáng)性。

2 結(jié)果

2.1 副溶血性弧菌毒力基因攜帶情況

經(jīng)多重?zé)晒釶CR檢測(cè)，40份貝類樣品（20份牡蠣和20份毛蚶）中，副溶血性弧菌（tlh基因）陽(yáng)性樣品19份，陽(yáng)性率47.50%（19/40），其中牡蠣陽(yáng)性率為50.00%（10/20），毛蚶陽(yáng)性率為45.00%（9/20）;毒力基因（tdh、trh）陽(yáng)性15份，攜帶率37.50%（15/40），其中牡蠣攜帶率為45.00%（9/20），毛蚶攜帶率為30.00%（6/20），各毒力基因攜帶情況見(jiàn)表2。

2.2 副溶血性弧菌污染水平分析

結(jié)果顯示，在檢出副溶血性弧菌的19份樣品中，污染量≥110MPN/g的樣品占26.00%（5/19），其中牡蠣3份，毛蚶2份。在攜帶致病性毒力基因的15份樣品中，各毒力基因的污染量及占比見(jiàn)表3。

2.3 不同采樣地點(diǎn)副溶血性弧菌的檢出情況

此次樣品采集選取了淄博市張店區(qū)、淄川區(qū)、周村區(qū)和桓臺(tái)縣這4個(gè)區(qū)縣進(jìn)行隨機(jī)采樣，以張店區(qū)檢出率最高，為36.84%（7/19）;淄川區(qū)次之，為31.58%（6/19）;周村區(qū)和桓臺(tái)縣檢出率均為15.79%（3/19）。

3 討論

現(xiàn)如今，實(shí)時(shí)熒光PCR方法已廣泛應(yīng)用于細(xì)菌的快速檢測(cè)，包括霍亂弧菌、副溶血性弧菌、創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌、擬態(tài)弧菌這5種致病性弧菌的多重PCR檢測(cè)[6]。多重PCR可同時(shí)檢測(cè)副溶血性弧菌的種特異基因和毒力基因（tdh和trh），即在檢出副溶血性弧菌的同時(shí)判斷其致病性，具有快捷、高效的特點(diǎn)，目前已被日本、美國(guó)等國(guó)家的食品檢測(cè)機(jī)構(gòu)廣泛應(yīng)用[7]。由檢測(cè)結(jié)果可以看出，副溶血性弧菌在淄博市市售牡蠣產(chǎn)品中的檢出率（50.00%）高于毛蚶（45.00%），毒力基因的攜帶率同樣是牡蠣產(chǎn)品（45.00%）高于毛蚶（30.00%）。究其緣由，可能與牡蠣的濾食性較強(qiáng)有關(guān)，它可將致病性弧菌富集在體內(nèi)達(dá)到107～109CFU/mL[8]。從地域分布來(lái)看，張店區(qū)的檢出率在4個(gè)區(qū)縣中最高（36.84%）。張店區(qū)是淄博市的中心城區(qū)，更是全市政治、經(jīng)濟(jì)、文化、金融和科技中心，無(wú)論是人口的密集度還是產(chǎn)品的銷售流通量都較其他3個(gè)區(qū)縣高，這可能是導(dǎo)致張店區(qū)檢出率高的原因之一。

傳統(tǒng)的副溶血性弧菌檢驗(yàn)方法及手段不僅耗時(shí)長(zhǎng)，且工作量極大，已不能滿足食源性疾病中的快速診斷要求。而熒光PCR方法便捷、快速、自動(dòng)化強(qiáng)，極大地提高了檢驗(yàn)效率，已被越來(lái)越多的應(yīng)用于檢驗(yàn)工作中。將傳統(tǒng)方法與PCR方法相結(jié)合，取長(zhǎng)補(bǔ)短以提高檢測(cè)效率，不僅能夠?yàn)楦比苎曰【目焖僭\斷和食源性疾病的控制提供參考依據(jù)，還可為致病弧菌的流行病學(xué)調(diào)查提供參考。

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基金項(xiàng)目：山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2017w5562）;課題名稱：副溶血性孤菌的致病性及分子學(xué)檢測(cè)研究。