四種去內(nèi)毒素試劑盒提取質(zhì)粒中內(nèi)毒素水平的比較

楊振蘋(píng) 張靜靜 邢體坤 王 斌 宋路萍 荊新蕊 宋彥君 黃 帥 王亞萍 潘若文▲

1.華蘭生物工程股份有限公司研發(fā)中心，河南新鄉(xiāng) 453003；2.華蘭基因工程有限公司質(zhì)量控制部，河南新鄉(xiāng) 453000

近年來(lái)，建立在DNA基礎(chǔ)上的基因療法和DNA疫苗已成為一個(gè)熱門(mén)的研究方向，有望成為解決全球衛(wèi)生問(wèn)題的最有前景的方法之一。與重組病毒比較，重組質(zhì)粒因具有免疫原性低、安全等特點(diǎn)而占有更大的優(yōu)勢(shì)。

質(zhì)粒（plasmid）是獨(dú)立于染色體外的雙鏈閉合環(huán)狀DNA分子，大小范圍為0.8～120kb，具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力，常以超螺旋狀態(tài)存在，廣泛存在于細(xì)菌、放線菌和真菌中[1]。質(zhì)粒作為基因工程的常用載體，能夠?qū)⒛康幕蛲ㄟ^(guò)DNA重組技術(shù)轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞中。

內(nèi)毒素（Endotoxin）最早于十九世紀(jì)由Richard Pfeiffer在研究發(fā)熱物質(zhì)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)并提出[2]。內(nèi)毒素是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁外膜上的特有結(jié)構(gòu)，其主要化學(xué)成分是脂多糖。脂多糖由核心寡糖、雜多糖鏈、菌株特異性O(shè)抗原和疏水的脂質(zhì)A組成，其中脂質(zhì)A是其主要的活性位點(diǎn)[3]。研究表明，內(nèi)毒素是誘發(fā)炎癥反應(yīng)、胰島素抵抗、肺損傷等的主要致病成分[2，4-5]，對(duì)哺乳類動(dòng)物有顯著的致熱性[6]。內(nèi)毒素的檢測(cè)常用家兔熱源法和鱟試劑法[7]，其中，鱟試劑法是目前最常用的方法，已被列入《中華人民共和國(guó)藥典》[8]。

由于試驗(yàn)?zāi)康牟煌?，質(zhì)粒DNA的質(zhì)量也有不同的要求，尤其是在細(xì)胞轉(zhuǎn)染的過(guò)程中，質(zhì)粒中的內(nèi)毒素水平會(huì)明顯影響細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，所以對(duì)質(zhì)粒的質(zhì)量要求更為苛刻。而面對(duì)市售的種類繁多的質(zhì)粒DNA提取試劑盒，正確的選擇會(huì)成為試驗(yàn)成功的關(guān)鍵。本研究選取了四種市售的去內(nèi)毒素試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取，并用鱟試劑凝膠法和動(dòng)態(tài)濁度法測(cè)定所提質(zhì)粒DNA的內(nèi)毒素水平，為細(xì)胞轉(zhuǎn)染用質(zhì)粒DNA提取試劑盒的選擇提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

質(zhì)粒pCGS3保存于華蘭生物工程股份有限公司實(shí)驗(yàn)室，DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自生工生物工程股份有限公司。

1.2 試劑

四種去內(nèi)毒素試劑盒為：（A）Thermo公司的GeneJET Endo-Free Plasmid Maxiprep Kit，貨號(hào)：K0861；（B）生工的UNIQ-500無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大量提取試劑盒，貨號(hào)：B511249；（C）QIAGEN的EndoFree Plasmid Maxi Kit，貨號(hào)：12362；（D）TaKaRa的 MidiBEST Endo-free Plasmid Purification Kit，貨號(hào)：9783S。

凝膠法鱟試劑（批號(hào)：1904083，λ=0.06EU/mL）、動(dòng)態(tài)濁度法鱟試劑（批號(hào)：1809270）、細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：1612010，80EU/支）、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（批號(hào)：1812040）均購(gòu)自湛江安度斯生物有限公司。

1.3 儀器

超凈工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)有限公司，SW-CJ-1F），全溫?fù)u瓶柜（太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠，HYG-A），NanoDrop分光光度計(jì)（Thermo公司，NanoDrop ONE），電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司，HWS-28），動(dòng)態(tài)試管檢測(cè)儀（湛江安度斯生物有限公司，LKL-164-03）。

1.4 方法

1.4.1 質(zhì)粒DNA提取 用pCGS3質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)獲得攜帶pCGS3質(zhì)粒的菌液，之后分別用四種無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，每組做3個(gè)平行管。提取的質(zhì)粒用NanoDrop ONE分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒DNA濃度、A260/A280、A260/A230，進(jìn)行質(zhì)粒DNA的質(zhì)量評(píng)價(jià)。

1.4.2 凝膠法 鱟試劑靈敏度的復(fù)核：根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版[8]中收錄的細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)法，首先將細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成四個(gè)濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為：0.12、0.06、0.03、0.015EU/mL。然后分別吸取100μL上述內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入100μL待復(fù)核的鱟試劑中，每組做4個(gè)平行管。同時(shí)，取100μL細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水加入100μL待復(fù)核的鱟試劑中，用作陰性對(duì)照，陰性對(duì)照平行做2管。封閉管口，輕輕混勻，垂直放入37℃恒溫水浴鍋中，保溫60min。觀察凝膠凝結(jié)情況，并按公式λc=lg-1（ΣX/4）計(jì)算鱟試劑的實(shí)際靈敏度（λc）。其中，X為反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值，反應(yīng)終點(diǎn)濃度是指梯度稀釋的內(nèi)毒素濃度中最后一個(gè)呈陽(yáng)性結(jié)果的濃度。

當(dāng)λc在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）范圍內(nèi)，表示該鱟試劑可用于細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測(cè)。

1.4.3 動(dòng)態(tài)濁度法

1.4.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性實(shí)驗(yàn) 用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水將細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成1.00、0.10和0.01EU/mL三個(gè)梯度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取100μL上述內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入100μL的鱟試劑溶液，每組做3個(gè)平行管。同時(shí)，取100μL細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水作陰性對(duì)照，陰性對(duì)照平行做2管。輕輕混勻，放入動(dòng)態(tài)試管檢測(cè)儀中于37℃自動(dòng)采集數(shù)據(jù)。將內(nèi)毒素濃度C對(duì)達(dá)限時(shí)間T進(jìn)行線性回歸分析。所得線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)r的絕對(duì)值≥0.980，則試驗(yàn)有效。

1.4.3.2 供試品的干擾試驗(yàn) 將四種去內(nèi)毒素試劑盒所得質(zhì)粒用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水進(jìn)行適度稀釋，參照《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版[8]中細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)法進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)。根據(jù)所得線性回歸方程，分別計(jì)算供試品溶液中的內(nèi)毒素含量Ct和含標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的供試品溶液中的內(nèi)毒素含量Cs，然后按下列方程式計(jì)算回收率（R）：

當(dāng)回收率在50%～200%時(shí)，則認(rèn)為供試品溶液不存在干擾。

1.4.4 質(zhì)粒內(nèi)毒素水平測(cè)定 （1）凝膠法測(cè)定質(zhì)粒DNA中的內(nèi)毒素水平。首先將質(zhì)粒DNA進(jìn)行梯度稀釋，然后向鱟試劑中加入100 μL的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水和100 μL質(zhì)粒混勻，每組重復(fù)3管。同時(shí)，取100 μL的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水作為陰性對(duì)照，陰性對(duì)照做2個(gè)平行管。輕輕混勻，置于37℃水浴鍋中孵育60min。將試管從水浴鍋中輕輕取出，緩緩倒轉(zhuǎn)180°，觀察凝膠形成情況。若管內(nèi)形成不變形、不滑脫的凝膠，則為陽(yáng)性；若管內(nèi)沒(méi)有形成凝膠或形成的凝膠不堅(jiān)實(shí)、變形易滑脫則為陰性。（2）動(dòng)態(tài)濁度法測(cè)定質(zhì)粒DNA中的內(nèi)毒素水平。參照動(dòng)態(tài)濁度法鱟試劑說(shuō)明書(shū)檢測(cè)質(zhì)粒DNA中內(nèi)毒素水平，每組做3管平行，然后根據(jù)回歸方程計(jì)算內(nèi)毒素含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS17.0進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以（）的形式表示。

2 結(jié)果

2.1 四種去內(nèi)毒素試劑盒提取質(zhì)粒DNA結(jié)果

質(zhì)粒DNA提取操作步驟詳見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。分別取質(zhì)粒樣品5μL，用洗脫液作為空白對(duì)照，用NanoDrop ONE分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒的濃度、A260/A280值、A260/A230值。結(jié)果顯示，四種去內(nèi)毒素試劑盒所提質(zhì)粒的得率、純度均與說(shuō)明書(shū)一致。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 四種無(wú)內(nèi)毒素試劑盒提取質(zhì)粒DNA測(cè)定結(jié)果

2.2 凝膠法鱟試劑靈敏度的復(fù)核

用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水作為稀釋液，將細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四個(gè)濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，以細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水做2支陰性對(duì)照，參照《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版[8]中細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測(cè)法，進(jìn)行鱟試劑的λ復(fù)核。結(jié)果顯示，λc=0.05EU/mL，在0.5λ～2λ范圍內(nèi)，表明該鱟試劑可用于內(nèi)毒素檢測(cè)。復(fù)核結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 鱟試劑的靈敏度λ復(fù)核結(jié)果

2.3 動(dòng)態(tài)濁度法

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性實(shí)驗(yàn) 將內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行3個(gè)梯度稀釋，濃度分別為：1.00、0.10、0.01EU/mL。然后根據(jù)說(shuō)明書(shū)操作，測(cè)定3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)濃度達(dá)到預(yù)設(shè)的濁度值所用的時(shí)間。結(jié)果如表3所示。將內(nèi)毒素濃度C對(duì)達(dá)限時(shí)間T進(jìn)行線性回歸分析，得回歸方程：lgT=2.8008-0.3100lgC，其中，相關(guān)系數(shù)︱r︱=0.9973＞0.980，最低檢測(cè)濃度為0.01EU/mL，平行管的變異系數(shù)小于10%，NC反應(yīng)時(shí)間＞3600s，在檢測(cè)時(shí)間外，綜上所述，標(biāo)準(zhǔn)曲線成立，可用于后續(xù)結(jié)果計(jì)算。

表3 標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性試驗(yàn)數(shù)據(jù)

2.3.2 供試品的干擾試驗(yàn) 以質(zhì)粒樣品稀釋倍數(shù)8為例，進(jìn)行回收率計(jì)算，計(jì)算結(jié)果如表4所示。內(nèi)毒素的回收率均在50%～200%之間，所以在此試驗(yàn)條件下供試品溶液不存在干擾作用。

表4 供試品的干擾試驗(yàn)回收率結(jié)果

2.4 四種去內(nèi)毒素試劑盒提取質(zhì)粒DNA中內(nèi)毒素水平檢測(cè)結(jié)果

分別用鱟試劑凝膠法和動(dòng)態(tài)濁度法檢測(cè)四種不同去內(nèi)毒素試劑盒所提質(zhì)粒DNA內(nèi)毒素的水平。首先，將質(zhì)粒樣品稀釋后用于凝膠法檢測(cè)，記錄凝膠形成情況；再用動(dòng)態(tài)濁度法測(cè)定質(zhì)粒樣品中內(nèi)毒素，根據(jù)回歸方程計(jì)算內(nèi)毒素水平，結(jié)果見(jiàn)表5。結(jié)果表明，凝膠法和動(dòng)態(tài)濁度法檢測(cè)結(jié)果一致，且內(nèi)毒素含量均符合試劑盒說(shuō)明書(shū)要求，小于0.1EU/μg。

表5 質(zhì)粒DNA內(nèi)毒素水平測(cè)定結(jié)果

3 討論

內(nèi)毒素是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁外膜上的特有結(jié)構(gòu)，通常會(huì)在細(xì)菌生長(zhǎng)、死亡中被釋放。內(nèi)毒素表面帶負(fù)電荷、易形成微囊結(jié)構(gòu)，其分子量、電荷性和疏水性都與質(zhì)粒DNA相似，使用常規(guī)的質(zhì)粒提取方法很難將其與質(zhì)粒DNA完全分開(kāi)[9]。此外，在細(xì)胞轉(zhuǎn)染過(guò)程中，內(nèi)毒素與質(zhì)粒DNA競(jìng)爭(zhēng)轉(zhuǎn)染試劑，阻礙質(zhì)粒DNA進(jìn)入細(xì)胞膜和核孔復(fù)合物，能顯著降低內(nèi)毒素敏感細(xì)胞株的轉(zhuǎn)染效率[10-11]。在用電穿孔進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染中，內(nèi)毒素含量與細(xì)胞轉(zhuǎn)染率、細(xì)胞凋亡率有極強(qiáng)的相關(guān)性[12]。因此，應(yīng)盡可能降低用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒DNA中內(nèi)毒素的含量。

在國(guó)外，基因治療用質(zhì)粒DNA制品的細(xì)菌內(nèi)毒素殘留量標(biāo)準(zhǔn)為不超過(guò)0.1EU/μg[10]。在本實(shí)驗(yàn)中，采用凝膠法和動(dòng)態(tài)濁度法檢測(cè)四種質(zhì)粒提取試劑盒所提質(zhì)粒的內(nèi)毒素水平，檢測(cè)結(jié)果表明，4種試劑盒所提質(zhì)粒的內(nèi)毒素含量均小于0.1EU/μg，均能滿足后續(xù)細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的要求。從質(zhì)粒得率、內(nèi)毒素殘留量和性價(jià)比綜合分析，C試劑盒質(zhì)粒得率最高，內(nèi)毒素含量最低，但價(jià)格也最貴；而B(niǎo)試劑盒雖然質(zhì)粒得率不及其他3個(gè)，但內(nèi)毒素含量?jī)H次于C，性價(jià)比也最高。

本實(shí)驗(yàn)采用的凝膠法和動(dòng)態(tài)濁度法檢測(cè)結(jié)果相符，內(nèi)毒素水平均小于內(nèi)毒素的限值。凝膠法只能定性地判定結(jié)果是否符合《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定，而動(dòng)態(tài)濁度法可以定量地測(cè)出樣品中的內(nèi)毒素含量。除此之外，隨著我國(guó)鱟資源的逐年減少[13]，一種新的內(nèi)毒素檢測(cè)方法-重組C因子法正在推廣使用。重組C因子法將鱟試劑中的C因子采用生物技術(shù)重組獲得，以此來(lái)替代海洋生物鱟作為鱟試劑原料的唯一來(lái)源[14]。該方法已得到歐洲藥典、美國(guó)食品藥物管理局（FDA）的官方認(rèn)可，其列入《中華人民共和國(guó)藥典》也指日可待。

疫苗生產(chǎn)過(guò)程中的每一個(gè)環(huán)節(jié)都有可能污染內(nèi)毒素導(dǎo)致制品不合格，不僅給生產(chǎn)企業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，也會(huì)直接影響該企業(yè)的口碑。并且，隨著GMP、ICH等文件對(duì)生物制品質(zhì)量要求的規(guī)定不斷提高，對(duì)內(nèi)毒素的要求也越來(lái)越嚴(yán)格[15-16]。因此，疫苗生產(chǎn)人員必須采取有效措施控制產(chǎn)品內(nèi)毒素含量，保證接種者的人身安全。而質(zhì)粒生產(chǎn)作為疫苗上游研發(fā)過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)，其質(zhì)粒內(nèi)毒素水平直接影響后續(xù)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選等。因此，獲得內(nèi)毒素水平符合要求的質(zhì)粒至關(guān)重要。

本研究結(jié)果為細(xì)胞轉(zhuǎn)染用質(zhì)粒提取試劑盒的選擇提供基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)所選的4種去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒所提質(zhì)粒均能滿足細(xì)胞轉(zhuǎn)染的要求，但不同的試劑盒質(zhì)粒得率、內(nèi)毒素含量和價(jià)格不同，使用時(shí)應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況綜合考慮。