外源性信號通路JAK/STAT在ALA-光動力誘導(dǎo)人SCC細(xì)胞凋亡中的作用

喬 麗 李 強(qiáng) 蔡 宏 田 蓉 楊志勇 梅竹松 李 菲

1空軍特色醫(yī)學(xué)中心皮膚科，北京，100142；2空軍特色醫(yī)學(xué)中心臨床醫(yī)學(xué)實驗室，北京，100142

皮膚鱗狀細(xì)胞癌(squamous cell carcinoma，SCC)在老年人中較為常見,對于難以手術(shù)的患者，可采用光動力療法激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷治療[1,2]。相對于常規(guī)的手術(shù)、放療、化療、免疫治療等方法,光動力療法具有創(chuàng)傷小，無明顯痛苦，可選擇性的作用于腫瘤區(qū)域，不受皮損數(shù)目和部位的限制等優(yōu)勢,因此逐漸廣泛用于皮膚的淺表腫瘤,如基底細(xì)胞癌、Bowen病、SCC等[3]。5-氨基戊酮酸光動力學(xué)療法(5-aminolaevulinic acid-based photodynamic therapy，5-ALA-PDT)采用基于5-氨基乙酰丙酸(ALA)進(jìn)行的一種光動力療法,臨床實踐發(fā)現(xiàn)其具有安全,簡單和有效的特點,已逐漸成為一種具有應(yīng)用前景的治療非色素性皮膚癌的新選擇[4]。盡管光動力治療腫瘤的方法越來越多的用于臨床實踐,但其導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡的機(jī)制尚未完全闡明。

以往研究認(rèn)為光動力誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞以外源性凋亡為主，本研究著重于研究外源性凋亡通路如JAK/STAT信號通路在ALA-PDT對人SCC細(xì)胞增殖、凋亡中所發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞來源 A431和COLO-16細(xì)胞獲贈于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所張源主任。細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM高糖培養(yǎng)基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium):4 mM L-谷胺酰胺，100 U/mL青霉素，0.1 mg/mL streptomycin,1 mM sodium pyruvate,100 mM HEPES)，置于含有5%的CO2，37℃的孵育箱中培養(yǎng)。由于細(xì)胞系可以在沒有血清的情況下短暫生長,為了避免PpIX快速釋放到培養(yǎng)基中,血清不會被添加到DMEM中[4]。

1.1.2 PDT處理參數(shù) 采用波長為630 nm的半導(dǎo)體激光進(jìn)行照射[5],調(diào)整功率密度為10 mW/cm2照射時間分別為125 s、250 s、500 s，即能量密度分別為1.25、2.5、5 J/cm2[能量密度(J/cm2)=功率密度(W/cm2)×照射時間(s)]。

1.2 方法

1.2.1 A431和COLO-16細(xì)胞的傳代培養(yǎng) 用胰酶消化1～2 min后,置于顯微鏡下觀察A431和COLO-16細(xì)胞是否變圓并且逐漸從培養(yǎng)皿中脫落，當(dāng)細(xì)胞變圓且完全脫落呈游離狀態(tài)時終止消化。收集消化液，用1500 rpm離心3 min后收集細(xì)胞沉淀。用適當(dāng)體積、配置好的培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，并分別用裝到槍頭轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)皿中。最后將培養(yǎng)皿置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中,每天在顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長情況,隔日換液。

1.2.2 pCDNA3.1-STAT3過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實驗 (1)實驗分為空白對照組(不采取任何干預(yù))、pCDNA3.1+-DYK5453bp陰性對照組(僅轉(zhuǎn)染pCDNA3.1+-DYK5453bp對照質(zhì)粒)、pCDNA3.1-STAT3組(轉(zhuǎn)染pCDNA3.1-STAT3質(zhì)粒)。消化A431和COLO-16(2×105個/孔)細(xì)胞均勻接種于培養(yǎng)皿中，加入無抗生素培養(yǎng)基2 mL，待A431細(xì)胞融合至70%～80%進(jìn)行實驗。

(2)在EP管中分別加入50 μL的 opti-MEM、5 μL的lipofectamine2000，再加入2 μg的pCDNA3.1+-DYK5453bp或pCDNA3.1-STAT3的50 μL opti-MEM；2管混合均勻，室溫下10 min，將混合液再用槍頭吸入培養(yǎng)皿中。

(3)培養(yǎng)5 h后換成無抗生素的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。收集轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞，用QRT-PCR后的方法檢測STAT3 mRNA的表達(dá)水平變化(24 h)；用Western Blot的方法檢測STAT3蛋白的表達(dá)水平變化(48 h后)。每組實驗重復(fù)5次。

1.2.3 STAT3-siRNA轉(zhuǎn)染實驗 (1)將合成好的STAT3-siRNA吸入EP管中，4000 rpm，離心3 min，使STAT3-siRNA沉淀在管底部,按平均每OD用DEPC 130 μL的水稀釋,用槍頭吸入 PCR管中,用于后續(xù)實驗或-80℃冰凍保存。

(2)實驗分為siRNA組(轉(zhuǎn)染STAT3-siRNA)、Vehicle空白對照組(不采取任何干預(yù))、NC陰性對照組(僅轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA)。消化A431均勻接種于25 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，每皿中加入完全DMEM培養(yǎng)基,待A431細(xì)胞融合至70%～80%進(jìn)行實驗。

(3)將5 μL lipofectamine2000的95 μL opti-MEM用槍頭吸入EP管;再用槍頭將含有5 μL STAT3siRNA的95 μL opti-MEM吸入另一EP管。兩個EP管混合均勻，置于室溫10 min,再用槍頭吸入培養(yǎng)皿中。

(4)培養(yǎng)5 h后換成無抗生素的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。收集轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞，用QRT-PCR后的方法檢測STAT3mRNA的表達(dá)水平變化(24 h);用Western Blot的方法檢測STAT3蛋白的表達(dá)水平變化(48 h后)。每組實驗重復(fù)5次。

1.2.4 細(xì)胞增殖實驗(MMT) A431和COLO-16細(xì)胞在96孔板中培養(yǎng) (約10000個細(xì)胞/孔)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染pCDNA3-STAT3或STAT3-siRNA或陰性對照,之后采用不同濃度的ALA(0.3，0.6，1.2，2.4，4.8 mM)在無血清條件下培養(yǎng)4 h,而對照組僅在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)。換液，給予細(xì)胞5 J/cm2的光照，并孵育24 h;采用MTT法檢測細(xì)胞活力,該實驗設(shè)置三次獨(dú)立平行試驗(具體的實驗操作步驟同實驗第二部分)。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測(FCM) A431和COLO-16細(xì)胞轉(zhuǎn)染pCDNA3-STAT3或 STAT3-siRNA或陰性對照,之后采用在含4.8 mM ALA無血清培養(yǎng)4 h,然后用2.5 J/cm2(10 mW/cm2，250 s)的光照處理,并繼續(xù)培育20 h,對照組不給予光敏劑和照射治療,收集細(xì)胞。采用Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit(美國BD公司)檢測細(xì)胞凋亡(具體的實驗操作步驟同實驗第二部分)。

1.2.6 qRT-PCR 采用Trizol(美國Invitrogen公司)提取A431和COLO-16細(xì)胞的總RNA,用紫外分光光度計(美國基因有限公司)用來檢測RNA的濃度。取1 μg提取的RNA采用SuperScript first-strand synthesis system(美國Invitrogen公司)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA。分別設(shè)計不同的引物采用QuantiTect SYBR Green kits(美國Invitrogen公司)進(jìn)行實時定量PCR測定STAT3、bcl-2、Bax和β-actin的表達(dá)水平。

1.2.7 Western Blot 蛋白質(zhì)樣本通過SDS-PAGE分離,并通過電泳轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，分別采用相應(yīng)的抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析[STAT3(1∶500); Bax (1∶500); Bcl-2(1∶500);β-actin (1∶5000)]。選用β-actin作為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1 STAT3對ALA-PDT細(xì)胞抑制作用的影響 高表達(dá)STAT3可以顯著緩解5-ALA-PDT誘導(dǎo)的A431和COLO-16細(xì)胞存活率的下降,而敲低STAT3促進(jìn)了A431和COLO-16細(xì)胞存活率的下降(圖1)。

2.2 STAT3參與了ALA-PDT誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡 高表達(dá)STAT3可以顯著緩解5-ALA-PDT誘導(dǎo)A431和COLO-16細(xì)胞的凋亡,而敲低STAT3促進(jìn)了5-ALA-PDT誘導(dǎo)的A431和COLO-16細(xì)胞的凋亡(圖2、3)。

2.3 5-ALA-PDT處理可以導(dǎo)致STAT3和Bcl-2 mRNA水平和蛋白水平顯著降低，Bax mRNA和蛋白的水平顯著增加,高表達(dá)STAT3可以削弱這一變化,而敲低STAT3促進(jìn)了這一變化(圖4)。這表明STAT3可以通過調(diào)控凋亡相關(guān)因子Bcl-2以及Bax介導(dǎo)5-ALA-PDT誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

3 討論

JAK-STAT信號通路是一條由EGFR及Src等受體啟動的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,研究發(fā)現(xiàn)其參與了細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等許多生物過程[6-8]。以往研究表明，活化的STAT3對腫瘤細(xì)胞的形成和生長及凋亡抑制等過程起著重要的調(diào)控作用。由于在人類多種惡性腫瘤中(如腦瘤、前列腺癌、淋巴瘤、乳腺癌、各種白血病、鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、黑素瘤等[9,10])STAT3活化呈現(xiàn)高表達(dá),因此STAT3也被認(rèn)為是癌基因。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)STAT3的過度表達(dá)及活化與癌細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)[11,12]。大量研究結(jié)果顯示多種細(xì)胞周期調(diào)控因子(c-fos、MEKs、cMyc和cyclinD1等)以及凋亡抑制因子(Survivin、Bcl-xl等)均是STAT3的下游靶基因[13,15]，STAT3通過調(diào)控這些靶基因進(jìn)而參與了腫瘤細(xì)胞的發(fā)生和演進(jìn)[16]。在對細(xì)胞凋亡的研究中,Bcl-2家族受到廣泛關(guān)注。Bcl-2家族蛋白是在細(xì)胞凋亡過程中起重要作用的一類蛋白質(zhì),根據(jù)它們在細(xì)胞凋亡中的作用可分為兩類:一類是抵抗凋亡的蛋白，包括Bcl-2、Bcl.xL、BcI.w等十幾個成員；另一類是促進(jìn)凋亡的蛋白，包括Bax、Bak等幾個成員。BCL-2家族的蛋白主要通過比例的變化發(fā)揮抵抗凋亡或促進(jìn)凋亡的作用。研究發(fā)現(xiàn),在使用5-氨基戊酮酸光動力學(xué)療法對一些腫瘤的治療過程中,腫瘤細(xì)胞主要以凋亡和壞死為主。且進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性凋亡在光動力導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的凋亡中發(fā)揮重要作用，而外源性凋亡途徑是否參與到光動力治療腫瘤中尚未證實。

圖1 各組A431和COLO-16細(xì)胞存活率比較

圖2 各組A431和COLO-16細(xì)胞凋亡率比較，高表達(dá)STAT3顯著緩解5-ALA-PDT誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率增加

圖3 各組A431和COLO-16細(xì)胞凋亡率比較，敲低STAT3促進(jìn)了5-ALA-PDT誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡

圖4 各組STAT3、Bcl2、Bax的mRNA及蛋白質(zhì)水平，β-actin為內(nèi)參

STAT3是一種雙功能蛋白,存在于細(xì)胞質(zhì)中,并與酪氨酸磷酸化的信號通路相偶聯(lián),在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄過程中具有關(guān)鍵性作用。STATs家族主要包含以下7種成員:STATl、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B和STAT6,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長,存活和分化的許多重要方面。STATs是JAK-STAT途徑中一種重要的底物,STATs家族的蛋白質(zhì)可以被JAK磷酸化,磷酸化后的STATs形成二聚并轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中,進(jìn)而激活目的基因的轉(zhuǎn)錄,從而在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄過程中起有著關(guān)鍵性的作用。研究發(fā)現(xiàn),STAT3在人類許多惡性腫瘤中持續(xù)激活,并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及愈后密切相關(guān),例如鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、黑素瘤、前列腺癌和乳腺癌等,并已經(jīng)被證實是一種致癌基因。STAT3可以通過EGFR，Src，IL6等生長因子、細(xì)胞因子的激活,使其DNA的結(jié)合活性上調(diào),調(diào)控相應(yīng)靶基因的轉(zhuǎn)錄。并且不斷將生存信號向腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo),發(fā)揮促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生存、抑制細(xì)胞凋亡的作用。STAT3作為EGFR,Src等受體下游的信號通路交匯點可以直接參與調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá),調(diào)控血管的生成。STAT3信號通路與細(xì)胞的分化、增殖、血管生成、凋亡、免疫逃逸和侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。STAT3通路持續(xù)的激活可引起細(xì)胞異常增殖及惡性轉(zhuǎn)化。

細(xì)胞增殖研究發(fā)現(xiàn):MTT結(jié)果顯示ALA-PDT能顯著抑制A431及COLO-6細(xì)胞的增殖，過表達(dá)STAT3后明顯減弱了5-ALA-PDT的抑制效應(yīng),相反,敲降STAT3后明顯增強(qiáng)了5-ALA-PDT的抑制效應(yīng)。細(xì)胞凋亡研究發(fā)現(xiàn):5-ALA-PDT能顯著誘導(dǎo)A431及COLO-6細(xì)胞凋亡,過表達(dá)STAT3后明顯減弱了5-ALA-PDT的誘導(dǎo)效應(yīng),相反，敲降STAT3后明顯增強(qiáng)了5-ALA-PDT的誘導(dǎo)效應(yīng)。分子生物學(xué)實驗表明STAT3及其靶基因BCL-2和Bax參與了5-ALA-PDT對A431及COLO-6細(xì)胞增殖及凋亡的影響。

綜上所述,光動力可以抑制A431細(xì)胞的增殖,并促進(jìn)其凋亡;JAK-STAT3信號傳導(dǎo)通路參與了光動力治療皮膚鱗狀細(xì)胞癌;光動力可以抑制JAK-STAT 信號傳導(dǎo)通路的激活并且改變可以 Bcl2/Bax蛋白的比率;除內(nèi)源性凋亡外,JAK-STAT3參與介導(dǎo)的外源性凋亡在光動力治療皮膚鱗狀細(xì)胞癌中也是非常關(guān)鍵的。