長鏈非編碼RNA在Kaposi肉瘤組織中的表達

劉治全 袁 虎 普雄明

1石河子大學醫(yī)學院，石河子，832002;2湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，長沙，410006;3新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院，烏魯木齊,830001

Kaposi肉瘤是一種罕見的低度惡性的血管肉瘤，病因和發(fā)病機制尚未完全明確[1]。近年來，隨著高通量測序技術的發(fā)展，非編碼RNA被發(fā)現(xiàn)在腫瘤的發(fā)病機制中起到一定作用，并成為目前研究的熱點，miRNA已經(jīng)證實與Kaposi肉瘤發(fā)生發(fā)展有關[2-4]。lncRNA占非編碼RNA 80%以上，可能有比miRNA更復雜的作用，許多研究提示其可能成為腫瘤治療新的靶點[5,6]。本研究通過應用高通量lncRNA芯片技術篩選出Kaposi肉瘤組織與瘤旁正常組織差異表達的lncRNA，聚類(GO)分析篩選出與Kaposi肉瘤相關的 lncRNA，為進一步闡明Kaposi肉瘤的發(fā)病機制提供實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2016年3～7月新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院皮膚科經(jīng)臨床和病理確診的5例Kaposi肉瘤患者瘤體和瘤旁正常皮膚組織，所有標本一經(jīng)離體立即投入凍存管中，于液氮中保存。所有患者于取材前3個月未系統(tǒng)使用過免疫調(diào)節(jié)劑、糖皮質(zhì)激素等治療，且停止紫外線光療及外用藥物治療至少1個月；所有標本均經(jīng)過2位高年資皮膚病理專家閱片證實。本研究獲新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者均填寫卡波西肉瘤流行病調(diào)查表，并簽署知情同意書。5例Kaposi肉瘤患者中，男3例，女2例；年齡平均(57±20.34)歲；均為維吾爾族；均為經(jīng)典型Kaposi肉瘤。

1.2 實驗材料 樣本組織總RNA的提取試劑 RNAiso Plus(TAKARA)，質(zhì)檢Bioanalyzer 2100(Agilent technologies)，RNA純化試劑盒RNeasy mini kit(QIAGEN)，cRNA合成和標記試劑盒(Agilent technologies)，SYBR Green I(Takara)，紫外分光光度計ND-2000(NanoDrop)， ABI 7500熒光定量PCR儀(Applied Biosystems)，lncRNA芯片雜交盒(Agilent technologie)，芯片掃描儀(Agilent technologies)。lncRNA芯片為上海伯豪公司的4×180 k human ceRNA表達芯片。

1.3 實驗方法

1.3.1 組織總RNA的抽提和純化 取液氮凍存的Kaposi肉瘤和瘤旁正常組織，采用TAKARA RNAiso Plus并且根據(jù)生產(chǎn)廠商提供的標準操作流程進行樣品的total RNA抽提，抽提所得total RNA質(zhì)檢合格后使用RNeasy mini kit和RNase-Free DNase Set進行總RNA的純化。NanoDrop ND-2000紫外分光光度儀檢測樣本總RNA，樣本OD 260/280均在1.7～2.1，說明RNA純度高，28 S/18 S≥0.7/OD為合格，滿足芯片實驗要求，見表1。

表1 測序樣本總RNA質(zhì)檢結果

1.3.2 芯片雜交、掃描及數(shù)據(jù)讀取分析 實驗樣品RNA采用Low Input Quick Amp WT Labeling Kit和標準操作流程對樣品總RNA進行放大和標記，并用RNeasy mini kit純化標記后的cRNA。按照Agilent表達譜芯片配套提供的雜交標準流程和配套試劑盒Gene Expression Hybridization Kit組裝好雜交倉，將標記后的樣本置于滾動雜交爐中65℃，10 rpm，滾動雜交17 h，雜交cRNA上樣量1.65 μg，并在洗缸中洗片，洗片所用的試劑為Gene Expression Wash Buffer Kit。雜交后的芯片采用Agilent Microarray Scanner進行掃描。用Feature Extraction software 10.7讀取數(shù)據(jù)，最后采用R軟件中l(wèi)imma包進行歸一化處理，分別繪制散點圖、火山圖和熱圖，并進行GO分析和KEGG pathway分析。

1.3.3 qRT-PCR 用研磨儀將組織樣本研磨均勻，以Takara公司的RNAiso Plus提取總RNA，并用NanoDrop ND-2000紫外分光光度儀測定產(chǎn)物的濃度和純度。按PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)的說明書進行逆轉錄合成cDNA。以人β-actin為內(nèi)參基因，用SYBR?Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)在美國ABI 7500系統(tǒng)中進行PCR擴增，實時采集熒光信號用ΔCt值代表基因的相對定量值，用 2-ΔΔCt值表示基因表達的差異倍數(shù)：ΔCt值=樣本基因的Ct值-同組β-action的Ct值，ΔΔCt值=各個樣本的ΔCt值-瘤旁正常組織的ΔCt值的平均值。引物序列：lnc-PXDN-3:3的上游序列ACCTTCCAGCCTTTGTCCTT，下游序列TACCCGAGCATCCACTTAGG；lnc-PERP-10:2的上游序列TCTCCCAGCCTCTCAAAACAG，下游序列AAACCAAGACCCTTCTACCTCTGA；β-action的上游序列TGACTTCAACAGCGACACCCA，下游序列CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA。

1.4 統(tǒng)計學方法 以SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用獨立樣本t檢驗分析，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 樣本總RNA抽提質(zhì)檢結果 根據(jù)OD 260/OD 280(260 nm代表核酸的值，280 nm為蛋白質(zhì)的值)，該比值介于1.7～2.0時判定該樣本總RNA質(zhì)量合格。RNA Integrity Number(RIN)代表總RNA的完整性，RIN≥7.0為完整性好，RIN在6.0～7.0表示存在部分降解，RIN<6.0表示RNA降解。28S/18S≥0.7為合格。所有樣本RNA質(zhì)檢均合格。

2.2 lncRNA在Kaposi肉瘤中差異表達譜分析 通過lncRNA微陣列芯片檢測比較Kaposi肉瘤皮損及皮損旁組織之間差異表達的lncRNA表達譜。比較Kaposi肉瘤組織及正常組織中的lncRNA表達水平，將差異表達倍數(shù)≥1.5且P<0.05的lncRNA定義為差異表達lncRNA,結果篩選出差異表達lncRNA共717個，其中在Kaposi肉瘤組織中上調(diào)表達的lncRNA有408個，下調(diào)表達的有309個。部分差異表達的lncRNA，見表2。

2.3 lncRNA差異表達聚類圖 lncRNA在Kaposi肉瘤組織標本(group 1,g1)和瘤旁正常組織標本(group 2,g2)中呈離散分布(圖1)。以差異倍數(shù)≥1.5且P<0.05為篩選標準篩選出Kaposi肉瘤組織與正常組織差異表達的lncRNA，其中紅色區(qū)域表示表達上調(diào)和藍色區(qū)域表示表達下調(diào)(圖2)。聚類分析直觀顯示每個樣本中不同lncRNA的表達水平，紅色表示高表達轉錄本，綠色表示低表達轉錄本，灰色部分表示無顯著性差異，兩組樣本中l(wèi)ncRNA的表達存在差異(P<0.05)，見圖3。

2.4 qRT-PCR驗證 為進一步驗證基因芯片結果，選取差異lncRNA：lnc-PXDN-3:3和lnc-PERP-10:2， 采用qRT-PCR在原有5對組織標本中檢測lncRNA表達水平，結果發(fā)現(xiàn)表達趨勢與芯片結果一致，每個實驗進行3個生物學重復，差異均有統(tǒng)計學意義，間接證明芯片分析數(shù)據(jù)結果的可靠性。見表3。

2.5 差異表達的lncRNA的靶基因預測 對于lncRNA靶向位點的預測，我們先依據(jù)人類不同lncRNA數(shù)據(jù)庫，結合芯片注釋給出的lncRNA編號名稱以及坐標，獲取差異表達的lncRNA序列。選取與lncRNA距離小于10 kb的基因作為順式作用元件(cis-elements)靶基因；再選出與差異表達的lncRNA序列具有互補性或相似性的序列，利用RNAplex計算兩序列之間的互補能量，選擇e≤-30的序列作為反式作用因子(trans-elements)作用靶基因，部分結果見表4。然后，根據(jù)生物信息學分析，對cis調(diào)控及trans調(diào)控的靶基因進行KEGG通路注釋(圖4、5)。

圖1 Kaposi肉瘤和瘤旁組織差異表達的lncRNA散點圖

圖2 Kaposi肉瘤和瘤旁組織差異表達的lncRNA火山圖

表2 Kaposi肉瘤組織中部分差異表達的lncRNAs

圖3 Kaposi肉瘤組織與瘤旁正常組織差異表達的lncRNA聚類分析圖

表3 Kaposi肉瘤組織和瘤旁正常組織中2個lncRNA的表達差異

表4 Kaposi肉瘤組織部分差異表達的lncRNAs的靶基因預測

圖4 Cis靶基因富集KEGG通路分析圖 圖5 Trans靶基因富集KEGG通路分析圖

3 討論

Kaposi肉瘤是一種多發(fā)性特發(fā)性血管肉瘤，好發(fā)于雙下肢和足部的皮膚，內(nèi)臟少見，發(fā)展緩慢，臨床上分為四型：經(jīng)典型、艾滋病相關型(AIDS-KS)、非洲型和免疫抑制型。其病因未明，Kaposi肉瘤病毒感染(KSHV)是目前比較明確的病因之一，它編碼了12種成熟miRNA,其中kshv-mir-k12-1和kshv-mir-k12-12在Kaposi肉瘤組織中呈高表達[7]，kshv-mir-k12-1-5p可能通過靶向抑制CDKN1A 的表達影響Kaposi肉瘤的細胞周期。然而，不是所有感染KSHV者都會發(fā)生Kaposi肉瘤,人內(nèi)源性逆轉錄病毒K(HERV-K)的活化可能起到了一定的促進作用，而且并非所有的Kaposi肉瘤都存在KSHV感染[8]。Kaposi肉瘤發(fā)生有明確的地區(qū)分布和種族差異，在我國主要發(fā)生于新疆地區(qū)維吾爾族人群中，吳秀娟等[9]對該地區(qū)Kaposi肉瘤組織進行miRNA芯片研究，發(fā)現(xiàn)了差異表達的miRNA，進一步研究提示miR-126可能是Kaposi肉瘤的一種抑癌基因。

目前研究表明有超過90%的人類基因組可以轉錄為RNA，但是其中只有2%可翻譯為蛋白質(zhì)，98%的轉錄產(chǎn)物為不編碼蛋白的非編碼 RNA，如miRNA、lncRNA等。近年來非編碼 RNA 成為研究的熱點[10]，而Kaposi肉瘤中的lncRNA與Kaposi肉瘤的關系研究較少。長鏈非編碼 RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是一類長度超過200個核苷酸的線性非編碼RNA轉錄本，可通過順式(in cis)或反式(in trans)作用調(diào)節(jié)來調(diào)控靶基因的表達。近年來，越來越多的研究證實lncRNA在腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展的中發(fā)揮著重要作用[11-13]。

本研究通過lncRNA芯片分析了Kaposi肉瘤組織和正常組織中l(wèi)ncRNA表達譜的差異變化，按照表達差異倍數(shù)≥1.5倍且P<0.05進行篩選，共得到717個差異表達的lncRNA，其中在Kaposi肉瘤組織中上調(diào)409個，下調(diào)308個，與正常組織相比，Kaposi肉瘤組織中存在明顯的lncRNA差異表達，提示lncRNA可能參與了Kaposi肉瘤的發(fā)病過程。

利用生物信息學技術對差異表達的lncRNA進行靶基因預測，結果顯示差異表達的lncRNA可能通過cis和trans兩種方式對靶基因進行調(diào)控。同時我們挑選了在Kaposi肉瘤組織中上調(diào)表達的lnc-PXDN-3:3和lnc-PERP-10:2通過qRT-PCR在5對樣本組織中進一步驗證芯片結果的準確性，結果與芯片檢測結果一致。在Kaposi肉瘤lncRNA網(wǎng)絡的KEGG功能注釋中發(fā)現(xiàn)涉及到Wnt信號通路、泛素化代謝、TGF-β信號通路、p53信號通路等，這些信號通路是重要的細胞增殖、分化與凋亡的關鍵調(diào)節(jié)通路，與多種腫瘤密切相關。有研究證實乳腺癌中l(wèi)ncRNA CRNDE能通過競爭抑制miR-136激活 Wnt/β-catenin信號，從而促進腫瘤細胞增殖[15]，而lncRNA HIT對TGF-β介導的乳腺癌細胞的侵襲轉移具有顯著的促進作用[16]。胃癌組織中明顯低表達的lncRNA TUSC7，是 p53 的直接轉錄靶點，可以通過抑制 miR-23b 的方式來抑制腫瘤細胞的生長和增殖[17]。也有研究顯示lncRNA可促進蛋白泛素化，增強腫瘤細胞的侵襲能力[18]。抑癌基因轉化生長因子II型受體(TGF-βRII)在Kaposi肉瘤瘤體中低表達，考慮與Kaposi肉瘤的發(fā)生有關[19]。Chudasama等[20]證實了KSHV的結構蛋白能在裂解后期表達，并被整合到KSHV病毒顆粒中，抵抗p53誘導的細胞凋亡。KSHV基因編碼的蛋白能直接或間接作用于多種信號通路，進而參與病毒相關疾病的發(fā)病機制中[21]。因此，我們猜想本研究發(fā)現(xiàn)的lncRNA通過這些通路作用于KSHV或者Kaposi肉瘤瘤體本身，進而影響Kaposi肉瘤的發(fā)生發(fā)展，但具體機制仍需要進一步研究。

本實驗初步探索lncRNA在Kaposi肉瘤中的表達情況，為進一步研究lncRNA在Kaposi肉瘤發(fā)病機制中的作用提供了一定的實驗依據(jù)，后續(xù)我們將深入研究lncRNA在Kaposi肉瘤發(fā)病過程中的作用，為Kaposi肉瘤的診斷和治療提供新的靶點。