大黃魚肝油提取工藝優(yōu)化及品質(zhì)分析

竇 鑫 吳燕燕 楊賢慶 胡 曉 王悅齊

(1. 中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點實驗室，廣東 廣州 510300；2. 上海海洋大學食品學院，上海 201306)

大黃魚(Pseudosciaenacrocea)是中國特有的海洋魚類，主要分布于東南沿海，尤其是閩浙沿海地區(qū)。2019年，中國魚類產(chǎn)量4 991.06萬t，而海水養(yǎng)殖魚類中，大黃魚產(chǎn)量最高，為19.80萬t[1]。隨著大黃魚產(chǎn)量的逐漸增加，其速凍加工過程產(chǎn)生大量的內(nèi)臟下腳料，而內(nèi)臟中大黃魚肝占比達36.65%[2]。

目前，有關大黃魚肝脂質(zhì)的研究較少[3]，而魚肝中含有豐富的脂質(zhì)。海水魚油比陸生動物油脂更健康，含有更豐富的多不飽和脂肪酸[4]，特別是長鏈式二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)具有有益健康的作用[5-8]，此類多不飽和脂肪酸通常存在于從魚類(如大黃魚)提取的油脂中[9-10]。目前，從魚肝臟中提取油脂的方法較多，主要有蒸煮法[7]、壓榨法[11]、溶劑抽提法[12-13]、淡堿水解法[14]以及酶解法[15-18]等。酶解法具有生產(chǎn)條件溫和、得率高、產(chǎn)品質(zhì)量好的特點，蛋白酶水解原料產(chǎn)生的水解液富含氨基酸等物質(zhì)可進一步加工利用[11]。試驗擬以酶法提取大黃魚肝中油脂，優(yōu)化其提取工藝，并分析大黃魚肝油的品質(zhì)特性，旨在為其利用開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

大黃魚肝臟：寧德市金盛水產(chǎn)有限公司；

木瓜蛋白酶(20萬U/g)、堿性蛋白酶(200 U/mg)：上海麥克林生化科技有限公司；

中性蛋白酶(200 U/mg)、胰蛋白酶(250 U/mg)：合肥博美生物科技有限責任公司；

胃蛋白酶：3 000～3 500 NFU/mg，上海源葉生物科技有限公司。

1.2 試劑與儀器設備

鹽酸：分析純，廣州化學試劑廠；

14%三氟化硼—甲醇溶液：分析純，上海安譜科學儀器有限公司；

氯仿、甲醇、氫氧化鈉、正己烷和氯化鈉：分析純，廣州輝俊生物科技有限公司；

韋氏試劑：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

石油醚：分析純，天津市富宇精細化工有限公司；

氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀：QP2010型，日本島津公司；

均質(zhì)機：IKA-T50型，德國IKA公司；

臺式低速離心機：TDZ5-WS型，湖南湘儀離心機有限公司；

脂肪分析儀：Soxtec TM 2050型，丹麥Foss公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 原料預處理 將大黃魚肝臟經(jīng)自然解凍后，使用組織搗碎機破碎，制備肝臟勻漿。

1.3.2 大黃魚肝脂肪的測定 按GB 5009.6—2016執(zhí)行。

1.3.3 酶解法提取大黃魚肝油 稱取適量經(jīng)預處理后的大黃魚肝勻漿于錐形瓶中，依次按不同的料液比及pH，并向其中加入一定量的酶，混勻。將錐形瓶置于恒溫振蕩器中，一定溫度下進行酶解，105 ℃烘箱滅酶15 min，趁熱離心，分離上層油相，備用。

1.3.4 單因素試驗設計

(1) 酶種類：固定料液比1∶2 (g/mL)，酶用量1.5%，酶解時間3.5 h，分別用胰蛋白酶(50 ℃，pH 7.5)、木瓜蛋白酶(50 ℃，pH 6.5)、中性蛋白酶(50 ℃，pH 7.0)、堿性蛋白酶(50 ℃，pH 8.0)、胃蛋白酶(45 ℃，pH 2.5)進行酶解，考察酶種類對大黃魚肝油提取率的影響。

(2) 料液比：固定中性蛋白酶添加量1.5%，酶解時間3.5 h，酶解溫度50 ℃，pH 7.0，考察料液比[1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5 (g/mL)]對大黃魚肝油提取率的影響。

(3) 中性蛋白酶添加量：固定料液比1∶2 (g/mL)，酶解時間3.5 h，酶解溫度50 ℃，pH 7.0，考察中性蛋白酶添加量(0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%)對大黃魚肝油提取率的影響。

(4) 酶解溫度：固定料液比1∶2 (g/mL)，中性蛋白酶添加量1.5%，酶解時間3.5 h，pH 7.0，考察酶解溫度(40，45，50，55，60 ℃)對大黃魚肝油提取率的影響。

(5) 酶解時間：固定料液比1∶2 (g/mL)，中性蛋白酶添加量1.5%，酶解溫度50 ℃，pH 7.0，考察酶解時間(1.5，2.5，3.5，4.5，5.5 h)對大黃魚肝油提取率的影響。

(6) pH：固定料液比1∶2 (g/mL)，中性蛋白酶添加量1.5%，酶解時間4.5 h，酶解溫度50 ℃，考察pH值(6.0，6.5，7.0，7.5，8.0)對大黃魚肝油提取率的影響。

1.3.5 響應面試驗設計 在單因素試驗基礎上根據(jù)SPSS顯著性差異分析(P<0.05)，以酶添加量、pH、酶解時間、酶解溫度為試驗因素，以提取率為響應值，設計四因素三水平響應面試驗優(yōu)化大黃魚肝油提取工藝條件。

1.3.6 理化性質(zhì)分析

(1) 感官評價：按SC/T 3502—2016執(zhí)行。

(2) 酸價：按GB 5009.229—2016執(zhí)行。

(3) 碘值：按GB/T 5532—2008執(zhí)行。

(4) 水分及揮發(fā)物：按GB 5009.236—2016執(zhí)行。

1.3.7 大黃魚肝油提取率的測定 按式(1)計算大黃魚肝油提取率[14]。

(1)

式中：

c——大黃魚肝油提取率，%；

c1——大黃魚肝脂肪含量，g/100 g；

m1——大黃魚肝臟質(zhì)量，g；

m2——大黃魚肝油質(zhì)量，g。

1.3.8 脂肪酸成分分析 向大黃魚肝油中加入14%三氟化硼—甲醇溶液2 mL，60 ℃水浴30 min，冷卻，加入1 mL 正己烷和蒸餾水振蕩搖勻。靜置分層后，用注射器通過0.22 μm有機濾膜過濾獲得上清液，上清液經(jīng)GC-MS分析[19-20]。

(1) 色譜條件：色譜柱為HP-5MS(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；進樣溫度250 ℃；分流比1∶30，進樣體積1 μL，流速1.52 mL/min，載氣為高純氦；加熱程序為110 ℃ 加熱4 min，10 ℃/min加熱1 min，然后4 ℃/min加熱1 min；升溫至210 ℃持續(xù)3 min，最后以4 ℃/min升溫至240 ℃，并持續(xù)8 min。

(2) 質(zhì)譜條件：離子源溫度200 ℃；電源電壓70 eV；溶劑延遲時間3 min。

1.4 數(shù)據(jù)處理

分別使用計算機NIST 0.5譜庫數(shù)據(jù)庫以及MS圖庫中的標準譜圖進行檢索與比較，確認大黃魚肝油中脂肪酸甲酯成分，采用面積歸一化法(以峰值面積的百分比表示)測定脂肪酸的百分含量[21-22]。各試驗平行3次，結果表示為平均值±標準差。采用 Excel 軟件繪圖，采用SPSS統(tǒng)計分析軟件的ANOVA和Duncan 法(α=0.05)分析魚油脂肪酸含量，P<0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 酶種類 由圖1可知，木瓜蛋白酶和中性蛋白酶對大黃魚肝油的提取效果較好，其中中性蛋白酶魚油的提取率最大，為69.02%。綜上，選用中性蛋白酶作為大黃魚肝油的提取用酶。

圖1 酶種類對大黃魚肝油提取率的影響

2.1.2 料液比 由圖2可知，大黃魚肝油提取率隨料液比的增加先增大后減少，當料液比為1∶2 (g/mL)時，提取率最大為72.13%。料液比過低，其酶濃度分布不均，故與底物間的反應不充分，導致提取率降低；而料液比濃度過高，底物的濃度就會減少，這樣酶與底物的接觸機會減少，提取率也會降低[23-24]。綜上，選擇最佳料液比為1∶2 (g/mL)。

圖2 料液比對大黃魚肝油提取率的影響

2.1.3 酶添加量 由圖3可知，大黃魚肝油提取率隨酶添加量的增加先升高后趨于平穩(wěn)，當酶添加量為1.5%時，提取率最高為72.13%。劉超等[23-24]研究發(fā)現(xiàn)鱈魚肝油提取率隨酶用量的增加而降低，可能與酶種類有關，酶用量過大，其水解能力加強，原料中的油脂被降解，提取率下降。故最適酶添加量為1.5%。

圖3 酶添加量對大黃魚肝油提取率的影響

2.1.4 酶解溫度 由圖4可知，大黃魚肝油提取率隨酶解溫度的增加先升高后降低，當酶解溫度為50 ℃時，提取率最大為72.13%，這是由于50 ℃是中性蛋白酶的最佳酶解溫度，故此溫度下大黃魚肝油的提取效果最好。酶解溫度過高或過低會使酶變性或失活，酶反應速率下降，魚油提取率較低。故選擇最適酶解溫度為50 ℃。

圖4 酶解溫度對大黃魚肝油提取率的影響

2.1.5 酶解時間 由圖5可知，大黃魚肝油提取率隨酶解時間的增長先不斷提高后趨于穩(wěn)定。當酶解時間為4.5 h 時，提取率達最大，為71.49%。由于大黃魚肝油經(jīng)過長時間的酶解會導致魚油被空氣氧化，使大黃魚肝油品質(zhì)下降，故選擇最適酶解時間為4.5 h。

圖5 酶解時間對大黃魚肝油提取率的影響

2.1.6 pH 由圖6可知，大黃魚肝油提取率隨pH的升高先緩慢上升后迅速下降，當pH為7.0時，提取率最高，為71.36%。故選擇最適酶解pH為7.0。

圖6 pH對大黃魚肝油提取率的影響

2.2 響應面優(yōu)化設計

2.2.1 試驗設計與結果分析 根據(jù)單因素試驗結果，以大黃魚肝油提取率為響應值，根據(jù)Box-Behnken中心組合原理進行響應面設計，試驗因素水平表見表1，試驗設計與結果見表2。

表1 試驗因素水平表

表2 響應面試驗設計與結果

利用Design-Expert 11.1.0.1軟件對響應面試驗結果進行多元回歸擬合，得到以大黃魚肝油提取率(Y)為響應值的二次多項式回歸方程：

Y=69.79+1.84A+1.94B-1.54C+0.674 2D+3.93AB-0.207 5AC-1.35AD+3.29BC-2.02BD-3.19CD+1.94A2+0.925 0B2+1.81C2-7.81D2。

(2)

表3 方差分析?

2.2.2 試驗因素間的交互作用 由圖7可知，交互項AB、BC以及CD對大黃魚肝油提取率存在顯著影響(P<0.05)，交互項AC與AD對大黃魚肝油提取率的影響不顯著，與方差分析結果一致。

圖7 各因素間的交互作用

2.2.3 驗證實驗 經(jīng)響應面分析得最佳酶解工藝條件為中性蛋白酶添加量2.49%、pH 7.32、酶解時間4.01 h、酶解溫度50.25 ℃，此條件下大黃魚肝油提取率為79.05%。為檢驗響應面結果的可靠性，實際選取最優(yōu)工藝參數(shù)為中性蛋白酶添加量2.5%、pH 7.3、酶解時間4.0 h、酶解溫度50.3 ℃，進行驗證實驗(n=3)，得實測提取率為78.39%，與預測值相差0.66%，證明用所建模型預測大黃魚肝油提取率是準確可行的。

2.3 大黃魚肝油的品質(zhì)分析

由表4可知，酶法提取的大黃魚肝油提取率為(78.39±1.91)%，比淡堿法提高了1.8倍。酶法提取的大黃魚肝油呈黃色、較澄清，氣味具有魚肝油的腥味，而淡堿法提取的大黃魚肝油呈深黃色、且有少量渾濁，氣味具有魚肝油的腥味，稍有魚肝油的酸敗味，這是因為淡堿法在水解過程中溫度過高，部分不飽和脂肪酸氧化[24]，最終導致大黃魚肝油品質(zhì)下降。酶法提取的大黃魚肝油酸價低于淡堿法的，碘價雖略高于淡堿法的但仍符合SC/T 3502—2016。

表4 酶法與淡堿法提取的大黃魚肝油品質(zhì)比較?

2.4 大黃魚肝油的脂肪酸組成

由表5可知，酶解法與淡堿法提取的大黃魚肝油中脂肪酸組成差異極顯著(P<0.01)，酶解法魚油中共檢出13種脂肪酸，其中飽和脂肪酸5種，單不飽和脂肪酸3種，多不飽和脂肪酸5種。淡堿法魚油中共檢出8種脂肪酸，其中飽和脂肪酸3種，單不飽和脂肪酸2種，多不飽和脂肪酸3種。淡堿法中總飽和脂肪酸含量為30.35 g/100 g，高于酶解法的(19.71 g/100 g)；酶解法魚油中單不飽和脂肪酸含量為62.63 g/100 g，淡堿法的為51.97 g/100 g，二者具有極顯著性差異(P<0.01)；兩種制備方法的多不飽和脂肪酸總量相差相對較小。

表5 大黃魚肝油的脂肪酸組成?

2.4.1 飽和脂肪酸 兩種方法制備的大黃魚肝油中，C18:0(硬脂酸)與C16:0(棕櫚酸)含量有較大差異，淡堿法魚油的硬脂酸和棕櫚酸分別為酶法的1.6倍。研究[25-26]表明，硬脂酸可以降低膽固醇吸收，從而降低血清和肝臟中的膽固醇水平，對人體起一定保護作用。棕櫚酸可以降低血清中膽固醇含量，是心臟運動期間合成的首選脂肪酸[27]。淡堿法魚油的飽和脂肪酸含量雖略高于酶解法的，但其飽和脂肪酸種類少于酶法的，其中C14:0(肉蔻酸)與C17:0(珍珠酸)在淡堿法中未檢出。

2.4.2 單不飽和脂肪酸 酶法魚油的單不飽和脂肪酸含量更為豐富，高于鰻魚肝油的[28]。其中C17:1在淡堿法與鰻魚肝油中未檢出。酶法魚油的C16:1(棕櫚油酸)含量較多，為淡堿法的1.7倍，其C18:1(油酸)含量也相對較多，說明酶法提取對魚肝中單不飽和脂肪酸的破壞較小，而油酸和棕櫚油酸的結合對緩解血栓形成、降低心律失常和中風風險、降低低密度脂蛋白(LDL)膽固醇水平和提高高密度脂蛋白(HDL)濃度具有積極作用，這些作用有助于降低血壓和增加動脈血管舒張[29-30]。

2.4.3 多不飽和脂肪酸 酶法魚油中多不飽和脂肪酸種類高于淡堿法的，其含量高于鰻魚肝油中的[28]。酶法魚油中含有少量C20:3(花生三烯酸)和C20:4(n-6)(花生四烯酸)，而淡堿法中未檢出。C18:2(n-6)(亞油酸)為含量最高的多不飽和脂肪酸，酶法、淡堿法魚油中亞油酸含量分別為(12.64±0.26)，(14.71±0.61) g/100 g。亞油酸是一種必需脂肪酸，為磷脂的重要組成部分；又是合成前列腺素的前體，有利于皮膚修復，對促進生長發(fā)育、視力和肝腎功能發(fā)揮重要作用。臨床和流行病學研究[31]表明，EPA和DHA僅存在于魚類和海產(chǎn)品中，并且在預防人類冠狀動脈疾病中起著極其重要的作用。

3 結論

試驗表明，大黃魚肝油的最佳酶解工藝為中性蛋白酶添加量2.5%、料液比1∶2 (g/mL)、pH 7.3、酶解時間4.0 h、酶解溫度50.3 ℃，此工藝條件下提取率達78.39%，比一般的淡堿法提高了1.8倍，且魚肝油澄清，酸價僅為(5.83±0.15) mg/g，碘價為(142.65±0.22) mg/100 g，其脂肪酸組成更為豐富，共檢出13種脂肪酸，其中飽和脂肪酸5種，單不飽和脂肪酸3種，多不飽和脂肪酸5種。而淡堿法魚肝油中僅檢測到8種脂肪酸，且以飽和脂肪酸為主，因此，酶解法的大黃魚肝油提取率及脂肪酸組成均優(yōu)于傳統(tǒng)淡堿法。后續(xù)可進一步制備大黃魚肝活性肽。