雷公藤紅素與凋亡蛋白突變體通過強化Nur77誘發(fā)凋亡通路發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用

尹曉夢 曹雪瑋 王富軍 趙健 張惠展

（1. 華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程重點實驗室，上海 200237；2. 浙江孚諾醫(yī)藥股份有限公司，東陽 322100；3. 上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所，上海 201203）

Nur77轉(zhuǎn)錄因子，又稱為神經(jīng)生長因子誘導(dǎo)的基因B（Nerve growth factor-induced gene B，NGFI-B）或TR3，是一種類固醇/甲狀腺/類視黃醇受體超家族的孤兒核受體蛋白（Orphan nuclear receptor），在多種細胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞周期、細胞凋亡的調(diào)節(jié)中起重要作用［1-3］。作為早期轉(zhuǎn)錄因子之一，Nur77定位于細胞核內(nèi)，起到激活轉(zhuǎn)錄，促進細胞生長的作用。因此，Nur77在多種腫瘤細胞中的表達量遠超于正常細胞［4］。當(dāng)受到凋亡信號刺激時，Nur77在磷酸激酶作用下被磷酸化，隨之磷酸化的Nur77離開細胞核到達線粒體，與B細胞淋巴瘤-2蛋白（Bcl-2）結(jié)合并誘導(dǎo)其構(gòu)象改變，引發(fā)細胞色素C（Cytochrome C）釋放，激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9（Caspase 9）并進一步激活Caspase級聯(lián)反應(yīng)下游的Caspase 3蛋白，最終誘導(dǎo)細胞凋亡［5-6］。由于磷酸化的Nur77直接調(diào)控線粒體途徑的凋亡過程，因此，圍繞以Nur77為作用靶點來進行相關(guān)腫瘤治療藥物的開發(fā)引起了人們的日益關(guān)注［3］。

雷公藤紅素（Celastrol）是從傳統(tǒng)中藥材雷公藤植株中提取的一種藥用化合物［7］，結(jié)構(gòu)如圖1-A所示，其具有抗氧化、抗癌、抗類風(fēng)濕，減肥等廣泛的生物學(xué)活性，尤其是其抗腫瘤活性受到人們的廣泛關(guān)注［8］。已有研究表明，Celastrol可以抑制肝癌、骨髓癌、乳腺癌、胰腺癌和胃癌等多種人類腫瘤細胞增殖并激活內(nèi)源性細胞凋亡途徑［7，9-11］，通過Bcl-2家族蛋白介導(dǎo)引起線粒體膜通透性改變，釋放細胞色素C等凋亡相關(guān)因子引發(fā)細胞凋亡［12-14］。對誘發(fā)細胞凋亡機理的深入研究發(fā)現(xiàn)，Celastrol進入細胞后與Nur77結(jié)合，促使Nur77從細胞核轉(zhuǎn)移至線粒體，這種易位使NF-κB激酶抑制劑表達增加導(dǎo)致具有抗凋亡活性作用的NF-κB信號因子數(shù)量降低，最終誘發(fā)細胞凋亡［15-16］（圖 1-B）。

來源于雞貧血病毒的凋亡蛋白（Apoptin）是一種為數(shù)不多的能特異性誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡而不影響正常細胞生長的蛋白。Apoptin進入腫瘤細胞后，能滯留在腫瘤細胞核內(nèi)，誘發(fā)腫瘤細胞凋亡，但其在正常細胞中則會被轉(zhuǎn)運到胞質(zhì)中降解，因此Apoptin可以誘導(dǎo)眾多腫瘤細胞系凋亡而對正常細胞不產(chǎn)生毒副作用［17-18］。類似于Celastrol，Apoptin也是通過促進核內(nèi)Nur77的磷酸化，使得Nur77從細胞核轉(zhuǎn)移到達線粒體，從而激活內(nèi)源性凋亡通路，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡［6，19］（圖 1-B）。

圖1 Celastrol結(jié)構(gòu)示意圖（A）和Celastrol、Apoptin誘導(dǎo)細胞凋亡的分子機制示意圖（B）

由于Celastrol與Apoptin抑制腫瘤生長的作用機理都與Nur77相關(guān)，本研究嘗試探討這兩種藥物聯(lián)用是否可以通過協(xié)同增強Nur77途徑的細胞凋亡誘導(dǎo)作用，來加強藥物的抗腫瘤藥理作用效果。野生型的Apoptin由于其本身多肽鏈一級結(jié)構(gòu)的原因，在通過原核表達系統(tǒng)重組表達時大都以包涵體形式表達，易產(chǎn)生聚集沉淀現(xiàn)象［5，20-21］。本課題組在前期研究中制備了一種Apoptin的突變體tApoptin，實現(xiàn)了在原核表達系統(tǒng)中的可溶性表達，并且在商陸皂苷甲（EsA）存在下表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤效果［22］（簡稱為tApoptinE）。本研究首先通過MTT實驗考察了Celastrol與tApoptinE兩者聯(lián)用是否對不同腫瘤細胞的增殖抑制存在協(xié)同作用，隨后通過流式凋亡分析和免疫印跡（Western blot）技術(shù)進一步分析了Celastrol與tApoptinE聯(lián)用后抗腫瘤活性的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝癌細胞（SMMC-7721，簡稱SMCC）、人宮頸癌細胞（HeLa）、人非小細胞肺癌細胞（A549）、人胚肺細胞（MRC-5）、tApoptin-pET28a均為本實驗保存。表達宿主菌為E.coliBL21（DE3）?？敲顾兀↘an）、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）、噻唑藍（MTT）等均購自碧云天公司。商陸皂苷甲（EsA）購自新鉑化學(xué)技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 體外細胞培養(yǎng) SMMC、HeLa、A549和MRC-5細胞均采用RPMI-1640培養(yǎng)基（10%胎牛血清，1%青霉素-鏈霉素）。所有細胞置于含5% CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 藥物體外生長抑制實驗（MTT法） 各種細胞按1×104/孔接種至96孔細胞板中，培養(yǎng)24 h。檢測單藥對SMMC細胞生長抑制作用時，將不同濃度（62.5、125、250、500、1 000 nmol/L） 的 Celastrol或tApoptinE分別與SMMC細胞孵育24 h，tApoptinE為混合了50 μmol/L EsA的tApoptin；檢測聯(lián)合用藥作用效果時，分別在不同濃度的Celastrol（75、150、300、600、1 200 nmol/L）存在下，濃度梯度的tApoptinE（62.5、125、250、500、100 nmol/L） 與SMMC細胞孵育24 h，Celastrol與tApoptinE混合后同時與細胞共孵育。然后棄掉細胞板中培養(yǎng)基，每孔加入200 μL含5 mg/mL MTT的溶液后培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h。棄掉MTT溶液，每孔加入150 μL二甲基亞砜（DMSO），振動溶解甲瓚，以Thermo酶標儀（吸收波長為490 nm）測定吸光度，計算細胞存活率。

1.2.3 流式細胞術(shù)凋亡分析 每孔1×104個SMMC細胞接種到24孔板中，于含5% CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。對照組中分別加入600 nmol/L Celastrol，65、125、250 nmol/L tApoptinE；實驗組分別為與600 nmol/L Celastrol混合的65、125、250 nmol/L tApoptinE。藥物與細胞共孵育24 h之后收獲各組細胞并進行兩次PBS洗滌，以100 μL結(jié)合緩沖液重懸細胞，加入10 μL Annexin V-FITC和碘化丙啶（PI）1∶1混合液，20℃黑暗孵育細胞20 min，加入400 μL結(jié)合緩沖液。通過FACScan流式細胞儀對經(jīng)處理的樣品進行分析。

1.2.4 免疫印跡分析 每皿1×107個SMMC細胞接種到55 cm2的培養(yǎng)皿中，于含5% CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h至貼壁。每組分別加入600 nmol/L Celastrol，65、125、250 nmol/L tApoptinE 和62.5 nmol/L tApoptinE + 600 nmol/L Celastrol、125 nmol/L tApoptinE + 600 nmol/L Celastrol、250 nmol/L tApoptinE + 600 nmol/L Celastrol，并設(shè)置一組無試劑添加的空白對照組。藥物與細胞共孵育24 h后收獲細胞，裂解細胞獲得全細胞裂解物，12 000 r/min離心15 min取上清蛋白。通過BCA蛋白定量試劑盒測定各組上清蛋白濃度，然后再用裂解液將各組上清稀釋至同一蛋白濃度。以SDS上樣緩沖液處理稀釋后細胞裂解液，之后進行SDS聚丙酰胺凝膠蛋白電泳分離樣品，然后將凝膠泳道中的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜。之后，將膜置于含5%脫脂奶粉的封閉液中常溫封閉過夜，再以PBS洗滌膜3次。將封閉處理后的膜與特異性一抗4℃孵育8 h，以PBS洗滌膜3次。隨后將與一抗孵育后的膜與辣根過氧化物酶綴合的二抗室溫孵育1 h，以PBS洗滌3次。最后用ECL化學(xué)發(fā)光超敏顯色試劑盒對膜進行顯像，并用化學(xué)成像系統(tǒng)拍照。

1.2.5 聯(lián)合作用指數(shù)（Combined index，CI） 計算兩種藥物聯(lián)用是否具有協(xié)同效應(yīng)是通過CI值來判斷的，CI值小于1則說明藥物聯(lián)用具有協(xié)同作用［23］。在Compusyn軟件（Version 1.0，Combo SynInc，USA）中分別輸入單獨用藥和聯(lián)合用藥各組藥物的濃度和細胞抑制率來計算CI值來判斷藥物間協(xié)同作用的大小。

2 結(jié)果

2.1 聯(lián)合用藥對腫瘤細胞生長的抑制作用的MTT法分析

為了分析Celastrol與tApoptinE兩者聯(lián)用是否能對腫瘤細胞的生長產(chǎn)生協(xié)同抑制作用，固定濃度的Celastrol與tApoptinE聯(lián)用，利用細胞生長抑制實驗檢測二者聯(lián)合的作用效果。分別在不同Celastrol的固定濃度下（0、75、150、300、600、1 200 nmol/L）觀察tApoptinE濃度變化（62.5-1 000 nmol/L）對腫瘤細胞SMMC生長抑制效應(yīng)，MTT結(jié)果顯示，Celastrol提高了tApotpinE對SMMC細胞的生長抑制活性，并且該效果具有濃度依賴性:低濃度的Celastrol（75、150 nmol/L）對tApoptinE的作用效果基本沒有影響；當(dāng)Celastrol達到300 nmol/L時一定程度上提高了tApoptinE的抗腫瘤活性，tApoptinE對SMMC細胞的生長抑制能力從Celastrol不存在時的IC50值717.7 nmol/L下降到270.1 nmol/L；當(dāng)Celastrol ≥ 600 nmol/L時（600、1 200 nmol/L）顯著提升了tApoptinE對SMMC細胞的生長抑制作用，tApoptinE對SMMC細胞的IC50值分別降至48.63、45.74 nmol/L（圖2-A，表1）。這些結(jié)果表明，≥300 nmol/L的Celastrol與不同濃度tApoptinE聯(lián)合用藥可對SMMC細胞的生長活性產(chǎn)生更好的抑制效果。

CI值可以判斷兩種藥物聯(lián)用是否具有協(xié)同效應(yīng)，CI值小于1則說明藥物聯(lián)用具有協(xié)同作用。CI值計算結(jié)果顯示，低濃度Celastrol（75、150 nmol/L）與不同濃度tApoptinE聯(lián)合用藥其CI值1左右，尚未表現(xiàn)出協(xié)同作用；當(dāng)Celastrol達到300 nmol/L時，CI值明顯小于1，體現(xiàn)出了一定的協(xié)同效應(yīng)；當(dāng)Celastrol為600 nmol/L時，CI值最低（圖2-B）。這說明當(dāng)tApoptinE與高于300 nmol/L的Celastrol聯(lián)用時，這兩種藥物的聯(lián)用存在顯著的協(xié)同效應(yīng)且Celastrol為600 nmol/L時協(xié)同效果最佳。因此后續(xù)實驗選取CI值最低的600 nmol/L Celastrol作為聯(lián)用的固定濃度。

圖2 Celastrol與tApoptinE單獨及聯(lián)合用藥24 h對SMMC細胞的生長抑制效果分析（A）及聯(lián)合用藥協(xié)同指數(shù)CI值（B）

表1 不同Celastrol固定濃度下tApoptinE對SMMC細胞24 h的半抑制濃度（IC50）

2.2 聯(lián)合用藥抑制腫瘤細胞生長的流式細胞術(shù)分析

為了闡明Celastrol與tApoptinE聯(lián)用后對腫瘤細胞的協(xié)同抑制效應(yīng)的分子機制，我們以Annexin V-FITC/FACS方法對聯(lián)合用藥后的腫瘤細胞凋亡率進行了檢測分析。如圖3所示，左上的Q1區(qū)代表含有獨立細胞核但是細胞膜破損嚴重的細胞，左下的Q4區(qū)代表正常的活細胞，右上的Q2區(qū)代表晚期凋亡或者死亡的細胞，右下的Q3區(qū)代表早期凋亡的細胞，凋亡率為早期凋亡率（Q3）與晚期凋亡率（Q2）結(jié)果相加，經(jīng)計算后得到如下結(jié)果:與SMMC細胞孵育24 h后，單獨使用Celastrol（600 nmol/L）處理的，僅產(chǎn)生29.2%的細胞凋亡率；單獨使用62.5 nmol/L、125 nmol/L和250 nmol/L濃度的tApoptinE時，誘導(dǎo)SMMC的細胞凋亡率分別為22.09%、33.61%和43.9%；而當(dāng)上述相應(yīng)濃度tApoptinE與600 nmol/L Celastrol聯(lián)合用藥時，誘導(dǎo)細胞的凋亡率分別達到了71.6%、79.2%和76.7%（圖3-A-B），即在不同tApoptinE濃度下的誘導(dǎo)凋亡率均提高了2-3倍。因此，Celastrol與tApoptinE聯(lián)用后的生長抑制作用的增強是通過提升對腫瘤細胞的誘導(dǎo)凋亡效應(yīng)來實現(xiàn)的。

2.3 聯(lián)合用藥產(chǎn)生的協(xié)同效應(yīng)與Nur77表達量相關(guān)

上述流式細胞術(shù)凋亡分析實驗的結(jié)果表明Celastrol與tApoptinE聯(lián)合用藥在SMMC細胞中存在協(xié)同作用的原因使Celastrol與tApoptinE聯(lián)用后強化了對SMMC細胞的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)。因為這兩種藥物都是通過Nur77的磷酸化來激活細胞凋亡通路，所以本課題組進一步通過免疫印跡實驗來比較分析這種誘導(dǎo)作用的增強是否與Nur77的表達量相關(guān)。分析MRC-5、SMMC、HeLa和A549四種細胞的Nur77表達量，發(fā)現(xiàn)Nur77在SMMC、HeLa和A549三種腫瘤細胞中的表達量顯著超過在正常細胞MRC-5中的表達量（圖4-B）；而這種差異性與MTT實驗結(jié)果顯示的兩種藥物聯(lián)合用藥對細胞生長的抑制作用效果呈正相關(guān):在相同用藥濃度下，對正常細胞的生長幾乎無生長抑制作用，但對所有測試的腫瘤細胞（SMMC、HeLa和A549細胞）均有明顯的協(xié)同抑制作用（圖4-A），與600 nmol/L celastrol聯(lián)用后tApoptinE對SMMC、HeLa和A549細胞的IC50值分別為0.013 29、24.13、48.35 nmol/L，在SMMC細胞中表現(xiàn)最高抑制活性。因此，Celastrol與tApoptinE無論是單獨用藥還是聯(lián)合用藥的協(xié)同抑制作用效果與Nur77表達量直接相關(guān)。

2.4 聯(lián)合用藥可提高Nur77的磷酸化水平

上述實驗證明了Celastrol與tApoptinE的聯(lián)合用藥導(dǎo)致的細胞生長抑制效應(yīng)與胞內(nèi)Nur77的表達量直接相關(guān)，本研究進一步通過免疫印跡實驗檢測了胞內(nèi)磷酸化的Nur77（p-Nur77）的蛋白水平。結(jié)果如圖5所示，與空白對照組相比，單獨使用Celastrol或tApoptinE處理后，可顯著上調(diào)細胞內(nèi)p-Nur77的表達；而當(dāng)Celastrol與tApoptinE聯(lián)用后，又進一步上調(diào)了p-Nur77的表達。這一結(jié)果表明Celastrol與tApoptinE聯(lián)用后進一步誘導(dǎo)Nur77發(fā)生磷酸化，促使NuR77傳遞凋亡信號，從而實現(xiàn)加強誘導(dǎo)細胞凋亡效果。

2.5 聯(lián)合用藥對Caspase家族蛋白和線粒體凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax表達的影響

為了明確磷酸化的Nur77誘導(dǎo)細胞凋亡更具體的分子機制，我們分析了聯(lián)合用藥后在細胞線粒體凋亡過程中起重要作用的Caspase家族蛋白和Bcl-2家族蛋白的表達量。

圖3 聯(lián)合用藥對SMMC細胞的流式細胞術(shù)凋亡檢測（A）及SMMC細胞的凋亡率直方圖（B）

若 Caspase 3、Caspase 8和 Caspase 9表 達 水平下調(diào)則預(yù)示著級聯(lián)反應(yīng)被激活、細胞凋亡啟動。Western blot實驗結(jié)果顯示，在經(jīng)單獨的Celastrol或tApoptinE處理后這3種蛋白的表達水平相對于空白對照組均有所下調(diào)，并且在Celastrol與tApoptinE聯(lián)合處理的細胞中，3種蛋白表達量的下調(diào)更加顯著（圖6-A，6-C）。同時，Bax/Bcl-2比值上升時可以激活下游線粒體死亡級聯(lián)反應(yīng)、引發(fā)細胞凋亡，在經(jīng)過單獨的Celastrol或tApoptinE處理后Bax/Bcl-2比值增大，并且，在聯(lián)合用藥組中該現(xiàn)象更加明顯（圖6-B，6-D）。上述結(jié)果表明，Celastrol與tApoptinE單獨用藥時可以調(diào)控Caspase和Bcl-2家族蛋白的表達，激活細胞的線粒體凋亡通路，而兩者聯(lián)用后產(chǎn)生協(xié)同作用，使得該通路被進一步激活。并且，上述過程伴隨Nur77磷酸化進行，暗示磷酸化的Nur77通過調(diào)控Caspase和Bcl-2家族蛋白的表達誘導(dǎo)細胞凋亡。

3 討論

結(jié)合兩種或者兩種以上治療藥物的聯(lián)合用藥法因具有臨床優(yōu)勢而成為腫瘤治療的常規(guī)方式［24］，除了降低新藥研發(fā)成本，聯(lián)合用藥還可以克服很多單藥治療帶來的局限性［25］。首先，聯(lián)合用藥的藥物會以特征性協(xié)同或者相加的方式作用于多種關(guān)鍵途徑，由此取得更好的抗腫瘤效果［26］；其次，聯(lián)合用藥可以解決由于單一化合物持續(xù)治療，從而誘導(dǎo)癌細胞招募替代的挽救途徑引起的耐藥性問題，增加藥物在胞內(nèi)積累［27］；療效的提升和更少耐藥性的誘導(dǎo)效應(yīng)使得單一藥物的使用劑量總體都得以降低，從而減輕了藥物所帶來的全身性毒性［28］；最后，聯(lián)合用藥的應(yīng)用降低了相同療效下單藥治療的不良反應(yīng)。因此，探索腫瘤治療的新的聯(lián)合用藥方式具有非常重要的實際應(yīng)用價值。對于Celastrol來說，He等［29］曾發(fā)現(xiàn)Celastrol可以抑制藤黃酸（Gambogic acid，GA）在發(fā)揮抗腫瘤作用中引發(fā)的NF-κB激活，從而增強腫瘤細胞對GA的敏感性，取到增強療效的效果。

圖4 單獨或聯(lián)合用藥對不同細胞生長的抑制作用 其中對照組為無任何藥物處理，只含有培養(yǎng)基的細胞（A）及不同細胞內(nèi)的Nur77表達量（B）

表2 tApoptinE在600 nmol·L-1 celastrol存在下對不同細胞的48 h半抑制濃度（IC50）

圖5 單獨及聯(lián)合用藥后SMMC細胞中Nur77表達量及磷酸化水平（A）及蛋白量的直方圖（B）

圖6 單獨及聯(lián)合用藥后SMMC細胞中Caspase家族蛋白表達量（A）和蛋白量直方圖（C）及Bcl-2家族蛋白表達量（B）和蛋白量直方圖（D）

作為一種已研究比較全面的五環(huán)三萜類化合物，Celastrol是中藥雷公藤（Thunder God Vine）中的一種重要生物活性成分［30］。在過去的10年里，越來越多的研究強調(diào)Celastrol在不同臨床領(lǐng)域的醫(yī)用價值［31］。數(shù)據(jù)表明，由于能夠抑制NF-κB途徑，干擾促炎細胞因子和趨化因子的產(chǎn)生，以及炎癥細胞的遷移、增殖和活化，Celastrol作為抗炎化合物治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、骨關(guān)節(jié)炎和過敏等疾病具有巨大潛力［32-35］；Celastrol可以通過抑制NF-κB和HSP來治療神經(jīng)退行性疾?。ɡ绨柶澓ＤY）［36］；最新數(shù)據(jù)顯示Celastrol還可以應(yīng)用在糖尿病、肥胖癥、動脈粥樣硬化和聽力喪失等疾病的治療中［37-40］。此外，Celastrol的抗癌特性一直備受關(guān)注，Celastrol可以應(yīng)用于肝癌、骨髓癌、乳腺癌、胰腺癌和胃癌等多種腫瘤的治療，這主要是由于其能夠抑制轉(zhuǎn)錄因子（如NF-κB和HIF-1α），以及蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的介質(zhì)（如HSP90伴侶）［41-42］。但是，當(dāng)應(yīng)用到腫瘤臨床治療時，Celastrol的使用仍受到限制:一方面，Celastrol的長期使用伴隨著全身毒性和多種不良反應(yīng)，如體重減輕、血液毒性、肝損傷和生殖障礙［43］；另一方面，Celastrol在細胞內(nèi)發(fā)揮作用時所產(chǎn)生的其他反應(yīng)不是我們期望的，例如，Zheng等［44］發(fā)現(xiàn)Celastrol會下調(diào)維持細胞黏附和抑制細胞遷移功能的鈣黏蛋白（E-cadherin）的表達，從而降低腫瘤細胞對Celastrol的敏感性。因此，我們?nèi)绻芡ㄟ^藥物聯(lián)用的方式在保證發(fā)揮Celastrol抗腫瘤治療效果的同時，降低Celastrol的用量，就可能減少Celastrol的臨床應(yīng)用所帶來的毒性反應(yīng)和其他不良反應(yīng)。

由雞貧血病毒的VP3基因編碼的Apoptin具有在不損害正常細胞的基礎(chǔ)上特異性殺死腫瘤細胞的特性［18］。但是，盡管Apoptin的這種選擇性抗腫瘤的能力在上世紀末就被發(fā)現(xiàn)，但20多年來由于Apoptin本身的一級結(jié)構(gòu)特點（N端富集亮氨酸，蛋白易產(chǎn)生聚集沉淀），給它的表達純化帶來困難，限制了其應(yīng)用［21］。有研究表明，去掉Apoptin N端的43個氨基酸后獲得的突變體tApoptin可以在原核細胞中實現(xiàn)可溶性表達，并且仍對腫瘤細胞保持生長抑制活性，但引起細胞凋亡的效應(yīng)有所降低［20］。如果要保持tApoptin原有的抗腫瘤活性，就需要大大提高用藥量。因此，我們課題組前期通過tApoptin與EsA聯(lián)合用藥的方式（tApoptinE），使得tApoptin的藥效顯著提高［22］。

由于Celastrol與tApoptin都以Nur77途徑誘導(dǎo)細胞凋亡起到抗腫瘤作用，所以我們將這兩種藥物聯(lián)用。MTT結(jié)果顯示，濃度固定的Celastrol與tApoptinE聯(lián)用后可以提升tApoptin的抗腫瘤效果，尤其是同較低濃度的Celastrol（75、150、300 nmol/L）聯(lián)用相比較，tApoptinE與600 nmol/L或者1 200 nmol/L的Celastrol聯(lián)合用藥更加顯著地提高單獨tApoptinE對腫瘤細胞SMMC的生長抑制作用，并且這兩組的藥效提升效果接近。這可能是由于Celastrol本身對細胞抑制活性較弱，所以當(dāng)?shù)蜐舛鹊腃elastrol與tApoptinE聯(lián)用時由于Celastrol濃度較低不能很好地發(fā)揮提高tApoptinE活性的作用，而當(dāng)Celastrol提高到一定濃度時，二者聯(lián)合對細胞生長有較強的抑制作用，藥效達到峰值很難再提升。

CI值小于1表示兩藥具有協(xié)同作用［45］，當(dāng)與tApoptinE聯(lián)用的Celastrol濃度高于300 nmol/L時，聯(lián)用組CI值均小于1，這說明在某些濃度范圍內(nèi)Celastrol與tApoptinE聯(lián)用后確實存在協(xié)同作用。此外，600 nmol/L Celastrol與tApoptinE聯(lián)用后，CI計算所得的值為所有Celastrol組中最低，CI值越低表示協(xié)同效果越好［46］，因此可以判斷，600 nmol/L Celastrol與tApoptinE聯(lián)用后協(xié)同作用在所有聯(lián)用組中最強。文獻報道在一些特定的情況下，兩種藥物的協(xié)同效應(yīng)僅在一定的藥物濃度范圍內(nèi)才能體現(xiàn)，特別是其中一種藥物濃度過高易使得協(xié)同效果反而不明顯［47］，據(jù)此推斷，當(dāng)Celastrol濃度過低時（75、150 nmol/L），Celastrol尚未達到與tApoptinE協(xié)同抗腫瘤的條件，因此兩藥聯(lián)用不表現(xiàn)正協(xié)同作用；當(dāng)Celastrol濃度高達1 200 nmol/L時，單藥對腫瘤細胞的生長抑制作用已非常強，所以協(xié)同效果不如600 nmol/L Celastol?？紤]到 Celastrol的細胞毒性［43］，在保障協(xié)同作用及藥效的情況下盡可能地降低Celastrol用量，因此我們選擇600 nmol/L的Celastrol作為固定聯(lián)用濃度。

對聯(lián)合用藥的流式凋亡分析實驗表明，協(xié)同作用加強了對細胞的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)。通過Western blot實 驗 分 析 MRC-5、SMMC、HeLa和A549四種細胞的Nur77表達量，并結(jié)合Celastrol（600 nmol/L）與不同濃度tApoptinE聯(lián)用對上述四種細胞的MTT實驗結(jié)果顯示，在相同用藥濃度下，聯(lián)合用藥對Nur77低表達的正常細胞不表現(xiàn)協(xié)同抑制作用，生長抑制作用??；但對Nur77高表達的腫瘤細胞（SMMC、HeLa和A549細胞）均有明顯的協(xié)同抑制作用，生長抑制作用強。進一步表明這兩種藥物的細胞生長抑制作用必須通過Nur77這個靶點才能實現(xiàn)。此外，Celastrol與tApoptinE聯(lián)用具有一定的靶向作用效果，其對Nur77高表達的細胞更具殺傷性。這種增強誘導(dǎo)細胞凋亡效應(yīng)直接與Nur77的表達量呈正相關(guān)。

Nur77途徑的誘導(dǎo)凋亡效應(yīng)只有在Nur77磷酸化，并且磷酸化的Nur77移動到線粒體才能進行觸發(fā)內(nèi)源性細胞凋亡［48］。從Western blot的結(jié)果可以看到Celastrol或tApoptinE單獨給藥后均可以誘導(dǎo)Nur77發(fā)生磷酸化，上調(diào)Bax/Bcl-2比值，活化Caspase 9以及下游的Caspase 3，引發(fā)細胞凋亡［49］。這一方面證實了Celastrol與tApoptinE在胞內(nèi)發(fā)揮誘導(dǎo)細胞凋亡作用是通過共同作用于Nur77通路來實現(xiàn)的；另一方面也顯示了聯(lián)合用藥組Nur77的磷酸化水平提高更為顯著，引起B(yǎng)cl-2家族蛋白和Caspase家族蛋白相關(guān)變化更加顯著。因此Celastrol與tApoptinE的聯(lián)合用藥可利用兩種藥物間的正協(xié)同效應(yīng)提升抗腫瘤作用效果，降低這兩種藥物各自的使用量，從而有可能減少不良反應(yīng)的發(fā)生，促進這兩種藥物的臨床應(yīng)用開發(fā)進程。

4 結(jié)論

本研究證實Celastrol與tApoptinE聯(lián)合用藥對多種Nur77高表達的腫瘤細胞存在協(xié)同抑制作用，能夠在提升藥效的同時降低用藥劑量，聯(lián)用的藥物協(xié)同作用于同一條Nur77誘發(fā)的細胞凋亡通路，強化激活線粒體凋亡途徑，誘導(dǎo)細胞凋亡。本研究提出的聯(lián)用方案為聯(lián)合用藥治療癌癥提供了新的策略。