細胞特異性核酸適配體的篩選及評價策略

余韓潔鈺 朱麗葉 陳旭 賀曉云 許文濤

（中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083）

生命科學的許多應用研究，如分子診斷和治療等，都需要基于不同細胞的特性標志物進行，并使用高親和力和特異性的工具。允許進行這些過程的工具通常稱為親和力工具［1］，其中主要是抗體和適配體。

目前，哺乳動物的抗體是最成功的提供廣泛分子識別需求的親和力工具，表征最充分，已經(jīng)存在了40多年［2］?？贵w作為生物體免疫系統(tǒng)自身產(chǎn)生的蛋白質，在當今臨床醫(yī)療實踐中應用甚廣，如酶聯(lián)免疫吸附測定（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）和Western blotting。但是抗體也有局限性，包括高生產(chǎn)成本和低穩(wěn)定性。近年來， 一些親和力工具，如工程結合蛋白［3］、適配體［2］和分子印跡聚合物（Molecular imprinted polymer，MIP）［4］都引起了人們的廣泛關注。適配體是一類新的具有類似抗體識別功能的核酸分子，它作為新興的領域，能以高親和力和特異性識別靶分子，其特異性可與單克隆抗體的同類靶標和特異性相媲美。適配體的出現(xiàn)為生物和醫(yī)學界提供了一種新的高效快速識別的研究平臺，發(fā)展迅速，具備良好應用潛力。

細胞特異性核酸適配體是適配體中特殊的一類，其特異性識別的靶分子為細胞。靶標未知的內(nèi)源狀態(tài)、細胞活性及細胞表面的復雜性等因素，都對細胞特異性核酸適配體的篩選提出了挑戰(zhàn)。該綜述針對細胞特異性核酸適配體基于細胞表面標志物、全細胞、組織和體內(nèi)的篩選，以及細胞適配體的親和性、特異性、細胞活力、臨床組織和體內(nèi)可行性等幾方面的評價進行總結，旨在為未來細胞適配體的篩選提供高效的篩選和評價方式。

1 細胞特異性適配體概述

1.1 適配體簡介

適配體（Aptamer）最早在1990年被發(fā)現(xiàn)和描述［5-6］，是長度一般為20-100個核苷酸的單鏈DNA或RNA，名稱“aptamer”來源于拉丁語aptus（合適），和希臘語merus（粒子）［7］，中文譯名為“核酸適配體”。

適配體能夠折疊形成特定且穩(wěn)定的三級結構，從而以高親和力和特異性結合靶分子。靶分子類型十分廣泛，包括氨基酸、金屬離子、蛋白質、病毒、菌和全細胞等［8］。適配體與抗體相似，被稱為“化學抗體”。但與傳統(tǒng)蛋白質抗體相比，適配體具有獨特的優(yōu)勢，包括尺寸小、分子量低、可快速滲透到組織和器官中、特異性強、化學改性較簡單、沒有批次間的變化、穩(wěn)定性高、毒性低和免疫原性低等［9-10］。由于適配體的天然狀態(tài)、構象及優(yōu)點，使其具備探索臨床運用的巨大前景。

1.2 細胞特異性適配體

當前，細胞特異性核酸適配體在疾病成像及診斷［11-12］、藥物遞送［13-15］和免疫治療［16］等方面得到了很大的發(fā)展，所以可用的細胞特異性適配體庫的不斷擴充尤為重要。

近年來，研究者們已進行大量的努力來篩選適配體，并不斷發(fā)展和改進篩選方式。適配體一般是通過體外選擇寡核苷酸文庫中分離出來的，這個過程稱為指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化技術（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）?；赟ELEX，也有研究者提出了非SELEX（Non-SELEX）的篩選方式，SELEX和非SELEX是通過篩選過程中是否有序列的擴增富集來區(qū)分的。Berezovski等［17］首先報道了非SELEX篩選的適配體，他們運用平衡混合物的非平衡毛細管電泳進行分配，僅3個步驟就將DNA文庫與靶蛋白的親和力提高4個數(shù)量級以上。非SELEX沒有聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction，PCR）擴增和鏈分離富集的重復步驟，一個明顯優(yōu)勢就是它的速度和簡單性，與典型SELEX需要的數(shù)天到數(shù)周相比，非SELEX能在1 h內(nèi)完成，且可以為不能被擴增的小分子庫中的篩選提供可能。

在細胞特異性適配體的篩選方法中，SELEX是主要的方式，以全細胞作為靶標的方法最為常用， 稱 為 細 胞 SELEX（Cell-SELEX）。1990年，SELEX由兩個實驗室獨立開發(fā)［5-6］，它是一個循環(huán)的過程，涉及結合、洗脫、擴增等步驟。SELEX過程從1013-1016單鏈脫氧核糖核酸（Single-stranded deoxyribonucleic acid，ssDNA）或單鏈核糖核酸（Single-stranded ribonucleic acid，ssRNA）分子的隨機庫開始，每個序列含有隨機區(qū)域和側翼兩個已知序列的區(qū)域，以便于擴增時的引物結合。篩選DNA適配體時，將隨機庫與靶分子孵育，除去未結合的序列并分離DNA/靶分子復合物，PCR擴增相應DNA序列，并進行下一輪篩選，多輪篩選后對候選適配體進行測序，并評價其靶親和力等。篩選RNA適配體的過程與其類似，但需體外轉錄得到一個RNA隨機庫，且將結合靶分子的RNA序列進行逆轉錄并擴增。第一次Cell-SELEX是用于非洲布氏錐蟲［18］，研究者從RNA適配體庫中篩選高親和力適配體，其結合到血流階段的非洲錐蟲鞭毛袋上。目前Cell-SELEX已經(jīng)應用于各類腫瘤細胞［19-20］、病毒感染的細胞［21］、正常細胞［22］及寄生蟲［23］等特異性適配體的篩選。

常規(guī)的SELEX成熟且有效，但是有的富集次數(shù)多達20輪，時間從數(shù)周到幾個月，消耗大量的時間和勞動力，所以用于篩選適配體的方法得到了不斷的更新和發(fā)展。包括細胞表面表達靶標（Target expressed on cell surface，TECS）-SELX、 熒光激活細胞分選（Fluorescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS）-SELEX、交叉SELEX、配體引導選擇（Ligand-guided selection，LIGS）、3D 細 胞 SELEX、細胞內(nèi)化SELEX，以及基于組織載玻片的SELEX和體內(nèi)SELEX等。

2 細胞表面標志物適配體篩選

針對細胞的適配體可以使用純化的蛋白質作為靶標，該種蛋白質往往在某種或某類細胞表面特異性表達。有研究者通過重組人CD4，從含有2'-F-嘧啶的RNA文庫中篩選人CD4特異性適配體，將這些適配體與熒光團偶聯(lián)用于流式細胞術，觀察具有不同密度CD4表達能力的細胞的染色情況［24］。Hu等［25］篩選出MUC1特異性適配體MA3，MUC1是在大多數(shù)惡性腫瘤細胞上過表達的跨膜糖蛋白，在正常組織中，MUC1的蛋白質核被糖鏈覆蓋，而在腫瘤中，蛋白質核心由于糖基化不足而暴露出來，成為抗癌治療的靶點［26］。經(jīng)驗證，適配體MA3可特異性地結合到MUC1陽性細胞上，包括A549和MCF-7［25］。此外，SELEX也可以不針對純化的蛋白質，而針對細胞膜進行，Morris等［27］以人紅細胞膜為靶物質篩選適配體，同時獲得多個靶標的適配體，且其親和力與針對純靶標篩選出來的相當，證明了SELEX在復雜生物體系中的應用。Ababneh等［28］利用人類重組全長CD44蛋白和2’-F-嘧啶修飾的RNA文庫，篩選出RNA適配體。細胞表面糖蛋白CD44是用于鑒定癌癥干細胞（Cancer stem cell，CSC）最常見表面標記之一。而后使用表達CD44的代表性乳腺癌細胞系評估發(fā)現(xiàn)選定的RNA適配體（Apt1）與此類癌細胞發(fā)生特異性相互作用。

但是長期以來觀察到，篩選自純化蛋白質的適配體，有的時候可能不能以其內(nèi)源狀態(tài)（如細胞中）結合相同的蛋白質［29-30］，Elle等［29］通過 SELEX 分離了針對CD73的含鎖核酸（Locked Nucleic Acid，LNA）的DNA適配體，CD73是在實體瘤中經(jīng)常過度表達的蛋白質。然而，當將適配體與CD73陽性的MDA-MB-231人乳腺癌細胞孵育時發(fā)現(xiàn)，沒有顯示出適配體對細胞的結合。細胞CD73是一種糖基磷脂酰肌醇（Glycosylphosphatidylinosi-tol，GPI）錨定的細胞表面蛋白，而在重組蛋白中適配體顯示與CD73的C末端結構域結合，所以適配體識別的表位可能不可用于結合細胞蛋白。

使用活細胞作為靶標篩選適配體的方法則可以克服這一缺陷。在Cell-SELEX中，靶分子具有其自身的天然構象，也不需要對靶標進行純化或將靶分子進行固定，可以在未知靶標的情況下對細胞的適配體進行篩選，能同時獲得幾條與靶細胞膜上不同位點結合的適配體，具備廣泛的優(yōu)勢［31］。Cell-SELEX為靶向細胞表面蛋白提供了十分有用的策略，特別是對于轉錄后嚴重修飾，且不能容易地通過細菌表達系統(tǒng)以其天然修飾和折疊形式獲得的蛋白。

3 全細胞適配體SELEX篩選方法

3.1 細胞表面表達靶標SELEX（TECS-SELEX）

Cell-SELEX面臨著許多挑戰(zhàn)，其中一個重要的挑戰(zhàn)是細胞在其表面上表達大量的蛋白質和其他化學部分，這些都是適配體的潛在靶標。為了解決這一問題，TECS-SELEX通過使用在其表面上過表達所需靶蛋白的細胞進行篩選，把正向篩選和不表達靶蛋白的細胞的負向篩選相互交替。Ohuchi 等［32］在中國倉鼠卵巢細胞（Chinese hamster ovary，CHO）表面上異位表達人轉化生長因子-β（TGF-β）III型受 體（TbRIII）， 在 11輪 TECS-SELEX后， 分 離出針對TbRIII的RNA適配體，從而無需純化重組蛋白。Kim等［33］通過逆轉錄病毒介導的感染，在HepG2細胞中過表達上皮細胞黏附分子（Epithelial cell adhesion molecule，EpCAM），將過表達EpCAM的HepG2細胞作為正篩細胞，普通HepG2細胞作為負篩細胞，篩選出的適配體可用于干細胞和癌癥中的研究。

3.2 熒光激活細胞分選SELEX（FACS-SELEX）

死細胞的存在是所有類型SELEX的主要缺陷，因為死細胞會對適配體產(chǎn)生非特異性攝取，從而出現(xiàn)假陽性，導致選擇過程的失?。?4］。運用FACS，通過流式細胞儀根據(jù)細胞不同的光散射特性或將細胞用可滲透染料酶促轉化成熒光，將活細胞和死細胞分開，能夠使得篩選更有效，且周期較短。Raddatz等［34］運用FACS在選擇過程中實施了死細胞的分離步驟，篩選CD19+Burkitt淋巴瘤的適配體，證明了FACS-SELEX方法適用于細胞亞群的有效靶向。Kim等［35］在篩選成熟白色脂肪細胞適配體時，也運用FACS細胞分選富集DNA文庫結合的細胞，并在篩選完成后運用其分析適配體對細胞的結合親和力。

對于適配體篩選過程中死細胞干擾的去除，除了FACS，還有微珠的方法［36］，在與DNA文庫孵育前除去死細胞，可以減少靶結合序列的損失和富集的適配體被非特異性結合的序列污染。

3.3 交叉SELEX（Cross-over SELEX）

在交叉SELEX中，純化的蛋白質和全細胞都作為靶標，Hicke等［37］首先提出和應用這樣的方式，從惡性膠質瘤細胞U251和純化的tenascin-C蛋白中篩選了tenascin-C蛋白的特異性RNA適配體。與之對應，還存在反向交叉SELEX，即先在蛋白質上進行篩選，再在活細胞上篩選。但交叉SELEX由于涉及其他的篩選方式，所以會相對耗時［25］。

3.4 配體引導選擇（LIGS）

LIGS利用了SELEX的核心選擇步驟，使用預先確定好的天然存在的更強和高度特異性的二價結合劑，與其同源抗原相互作用的抗體（Ab），從部分富集的SELEX文庫中競爭特定的適配體，從而獲得細胞表面已知靶標的適配體。Zumrut 等［38］在表達膜結合的免疫球蛋白M（Membrane-bound immunoglobulin M，mIgM）的Ramos細胞的適配體篩選中，用mIgM的抗體選擇性地洗脫特異性mIgM的適配體，將其作為分離步驟鑒定出了3種適配體的候選物。

3.5 細胞內(nèi)化SELEX

有的適配體不僅與細胞表面的靶標結合，還能在與靶標結合之后發(fā)生細胞內(nèi)化。這樣的適配體介導的siRNA和藥物的遞送對于癌癥等疾病的治療具有重要意義。Thiel等［39］將Cell-SELEX與高通量測序（High-throughput sequencing，HTS）和生物信息學相結合，富集了能夠選擇性內(nèi)化到血管平滑肌細胞（VSMC）的RNA適配體。

3.6 3D細胞SELEX

3D細胞SELEX運用基于磁懸浮技術的磁化噬菌體水凝膠來進行3D細胞培養(yǎng)，從而模擬自然狀態(tài)下的細胞環(huán)境［40］，在此基礎上與Cell-SELEX相結合的方法。Souza等［41］對PC-3前列腺癌細胞系進行3D培養(yǎng)，形成球形細胞模擬腫瘤微環(huán)境，結合Cell-SELEX篩選出了8個PC-3特異性RNA適體。

3.7 消減SELEX（Subtractive SELEX）

減法SELEX在每輪選擇之前將文庫與正常細胞孵育，分化的細胞作為靶標，從而能夠區(qū)分同源來源和不同亞型等兩個密切相關的細胞的適配體。Wang等［42］用分化的PC12細胞作為靶標，每輪選擇之前，使用未分化的PC12細胞減去SELEX文庫。經(jīng)過6輪選拔，獲得了僅對分化的PC12細胞具有特異性結合能力的高親和力適配體。

3.8 SWCNTs輔助細胞SELEX（SWCNTs-assisted cell-SELEX）

將特異性與非特異性結合的單鏈DNA（ssDNA）分離是提高篩選效率的重要步驟。為了克服大多數(shù)細胞SELEX僅使用洗滌導致分離不完全的問題，運用單壁碳納米管（Single-walled carbon nanotubes，SWCNT）吸附ssDNA的性質，將其結合到細胞SELEX方法中。分離時，SWCNT吸附未結合或非特異性ssDNA，再對細胞上特異性結合的適配體進行富集。Tan等［43］將兩個鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma，NPC）細胞系CNE2細胞和HONE細胞分別用作靶細胞和陰性細胞，在SWCNTs輔助下，僅6個循環(huán)就篩選出了對CNE2細胞顯示出高特異性和親和力的適配體，有效提高了篩選效率。

3.9 高效的SELEX

在磁珠（Magnetic bead，MB）上固定靶分子的SELEX方法由Bruno等［44］在1997年提出，磁珠-SELEX（MB-based SELEX）主要針對的靶標是蛋白質，通過磁分離將結合的適配體分離出來。Stoltenburg等［45］在 2005年提出了 FluMag-SELEX，結合了DNA熒光標記和磁分離技術的優(yōu)點，每輪選擇后通過熒光素標記進行DNA定量。針對不適合固定在固體表面的靶分子，在FluMag-SELEX的基礎上發(fā)展了Capture-SELEX［46］，創(chuàng)建特殊的DNA文庫，將其通過對接序列固定在磁珠上。磁珠-SELEX也與微流體應用相結合，開發(fā)了微流體-SELEX，Gopinathan等［47］研發(fā)了一種能夠自動識別膽管癌細胞特異性適配體的集成微流體系統(tǒng)，通過微流控芯片，顯著提高了篩選速度，只需6輪即成功篩選出了3種特異性結合膽管癌細胞的適配體。

高通量測序目前也已成為一種相對便宜且用戶友好的方法，可以運用其鑒定功能和稀有基序，比較每個寡核苷酸群體中的功能基序并定量其豐度。高通量測序輔助SELEX（HTS-SELEX）［39］也能夠使得篩選過程更加高效。單克隆表面展示（Monoclonal surface display，MSD）SELEX（MSD-SELEX）［48］也是一種發(fā)展起來的高效的SELEX技術。

4 基于組織載玻片的SELEX

基于組織載玻片的SELEX是把適配體文庫和癌組織切片孵育，從載玻片上刮下癌組織和結合序列的復合物，并擴增結合序列，再與正常組織切片的孵育作為負篩步驟。Li 等［49］使用乳腺導管癌的石蠟組織切片作為靶標，相同病例或鄰近組織作為對照，篩選驗證了特異性識別來自不同病理類型的臨床組織切片的乳腺癌細胞和具有異質性核糖核蛋白 A1（Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1，hnRNP A1）的細胞內(nèi)靶標的乳腺癌細胞系的適配體，是一種具備優(yōu)勢的原位篩選策略。

5 體內(nèi)SELEX

體內(nèi)SELEX與傳統(tǒng)SELEX非常相似，但是使用活的生物體進行選擇，一般通過尾靜脈注射將文庫注入特定小鼠體內(nèi)，再將瘤體或組織取出，分離適配體并擴增，再進入下一輪注射篩選。由于機體內(nèi)的生理環(huán)境復雜多變，所以體內(nèi)SELEX可以克服體外篩選的一些缺陷，實現(xiàn)活體生物體腫瘤的特異性定位。Wang等［50］在非小細胞肺癌異種移植的小鼠模型中，從聚乙二醇化的RNA文庫中篩選出適配體RA16，且該適配體劑量依賴性地抑制小鼠體內(nèi)NCI-H460腫瘤的增殖。目前，通過體內(nèi)SELEX篩選適配體已經(jīng)應用在小鼠模型的多種組織或器官，包括大腦［51］、骨轉移的前列腺癌［52］、雄性激素非依賴性前列腺腫瘤［53］及肝內(nèi)轉移的結腸癌［54］等。

6 細胞適配體的評價策略

6.1 適配體的親和力評價

親和力表征是確定適配體篩選成功與否、評價其可用性的關鍵步驟。適配體與靶標的結合是一個動態(tài)平衡的過程，所以通常用平衡解離常數(shù)Kd值來衡量適配體與靶標的結合親和力，Kd值的定義如式（1）所示，其中c指濃度，Kd值越小，表明二者相互作用越強，即親和力越高。

細胞特異性適配體最常用的親和力表征方法是流式細胞術。通過配制一系列不同濃度的帶熒光標記的適配體與細胞孵育，將孵育混合物通過流式細胞儀并檢測每組的平均熒光強度，流式細胞儀可以將細胞-適配體復合物與游離的適配體或細胞分離，并測定帶有熒光標記的復合物的數(shù)量。按照式（2）并運用軟件（如Origin）即可進行非線性擬合并計算得到Kd值。其中適配體的濃度X為自變量，各組平均熒光強度值與對照組熒光強度值之差Y為因變量，Bmax指飽和熒光強度。

Li等［55］為了確定所選適體的結合親和力，將LoVo細胞（1 × 106）與不同濃度的FITC標記的適體在BB中于4℃ 溫育20 min，并通過流式細胞術分析。ssDNA文庫用作陰性對照。然后通過Sigma Plot軟件（Jandel，San Rafael，CA）獲得適配體-細胞相互作用的平衡解離常數(shù)（Kd）。Aptaker等［56］將膠質母細胞瘤U87MG細胞與不同濃度的Cy3標記的適配體SA43和SA44分別孵育，PBS洗滌并重懸于PBS中以進行流式細胞術分析，最終非線性回歸分析得出，SA43和SA44適配體都以納摩爾范圍的高親和力結合U87MG靶細胞。

6.2 適配體的特異性評價

在評價適配體的特異性時，通常用到流式細胞儀和共聚焦顯微鏡檢測。將熒光修飾的隨機文庫和適配體與靶細胞及各類非靶細胞孵育，并用流式細胞儀測定細胞表面的平均熒光強度，分析適配體與靶細胞和各類非靶細胞的結合情況，從而評價其特異性。為了使結果更加清晰明了，研究者們通常對流式檢測結果進行處理，設置熒光強度的閾值。

Li等［55］為了確定所篩選適配體的細胞選擇性，用流式細胞術對各類細胞系進行了適配體結合測定，并設定了流式細胞術分析的熒光強度的閾值，使得與FITC標記的ssDNA文庫一起孵育的95%的細胞具有低于其的熒光強度。具有高于設定熒光閾值的細胞的百分比用于評價適配體與細胞的結合能力，并用不同符號加以清晰表示（-，＜10%；+，11%-35%；++，36%-60% ；+++，61%-85% ；++++，＞85%）。

此外，還可以通過細胞熒光成像評價適配體的特異性。一般把FAM熒光修飾的隨機文庫和適配體分別與靶細胞孵育，在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察細胞表面的熒光強度。Ababneh等［28］利用流式細胞術和熒光顯微鏡分析，發(fā)現(xiàn)體外篩選的適配體RNA適配體Apt1與CD44陽性的腫瘤干細胞發(fā)生特異性相互作用，不同的熒光強度反映了細胞表面CD44的表達水平。

6.3 細胞凋亡評價

評價所篩適配體對細胞活力的影響，對于適配體的后續(xù)應用是十分關鍵的?？梢杂煤Y選得到的適配體對靶細胞進行處理，測定細胞早期凋亡率和晚期凋亡率［56］，同時設置隨機文庫的對照組。Aptaker等［57］在用適配體處理細胞后，運用顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化，并分別在并在24 h、48 h和72 h下評估了細胞的增殖活性。判斷所篩適配體是否對靶細胞有明顯促凋亡作用，能夠指導適配體的可用性。當所篩適配體對靶細胞有適度抑制作用時，可能用于腫瘤細胞的抑制［58］，而當適配體具有最小細胞毒性時，則可以被應用于藥物、siRNA等的靶向遞送。

6.4 臨床組織和體內(nèi)可行性評價

對于體外篩選的細胞特異性適配體，為了更符合實際醫(yī)學領域的應用，體內(nèi)可行性評價也是比較重要的。Huang等［59］為了考察篩選所得適配體能否與實體瘤特異性結合，在裸鼠體內(nèi)種植移植瘤，而后取出腫瘤做成冰凍切片。核酸適配體apt-A和apt-B與組織切片孵育和清洗后，熒光顯微鏡下出現(xiàn)明顯綠色熒光，而隨機文庫則沒有，證明了適配體與實體瘤的結合，為體內(nèi)靶向奠定了一定基礎。Wu等［60］為了測試適配體XQ-2d是否在體內(nèi)保持其識別能力，將其用Cy5標記，并通過尾靜脈注射到胰腺導管腺癌（Pancreaticductal adenocarcinoma，PDAC）荷瘤小鼠中，小鼠的腫瘤位點比隨機文庫的對照組顯示出更高的熒光信號，且腫瘤中的積累也比心臟、脾、肺中更多，表明了適配體XQ-2d具有體內(nèi) PDAC靶向能力，為PDAC的診斷和治療提供了潛在的分子探針。

7 總結與展望

近年來，核酸適配體的篩選方法得到了不斷的發(fā)展，其中，細胞特異性適配體的篩選方法也結合細胞本身的特點而不斷改進。本文綜述了細胞特異性適配體的篩選方式，以及評價適配體的特異性、親和力、體內(nèi)可行性等的策略。細胞特異性適配體的篩選方式包括基于細胞標志物的篩選、全細胞篩選和組織及體內(nèi)篩選等?，F(xiàn)列出目前常見的細胞特異性適配體，如表1所示。

相較于其他靶標，在細胞適配體的篩選過程中，細胞活力的保持及死細胞的去除都十分關鍵。在整個篩選過程中，要防止吹打和過度酶處理對細胞膜造成的損傷，多種死細胞的去除方法也被結合到細胞適配體的篩選中，包括熒光激活細胞分選和微珠處理等。相較于特定靶標分子，細胞特異性適配體的篩選可以在未知靶標的前提下進行，并且能夠一次性獲得多條結合不同靶標的適配體，但同時細胞表面的復雜性又會對篩選成功率產(chǎn)生不利影響。

針對現(xiàn)有的篩選方法，篩選所得適配體，及其相應評價策略，從3個方面展開如下討論。

首先，從細胞適配體的篩選方法角度分析。目前的篩選方法仍有很大的進步空間。雖然篩選細胞適配體的方法有很多，但針對這些篩選方法還沒有一個合理且普遍通用的標準，仍需要一些研究來彌補空白。而且，在篩選過程中往往只采用一種細胞作為負篩細胞，這樣的實驗設置是不嚴謹?shù)?。另外，隨著計算機模擬和高通量測序方法在細胞適配體篩選中的應用，核酸適配體的篩選周期被大大縮短。

其次，從篩選得到的細胞適配體的評價角度分析。目前得到的細胞適配體還存在以下不足:針對篩選得到的核酸適配體的評價標準仍不明確；關于適配體在細胞上的結合位點及與細胞的作用力、作用方式的探究是缺乏的；現(xiàn)有研究大多是將篩選得到細胞適配體，與經(jīng)由胰蛋白酶或蛋白酶K處理的細胞樣品結合，從而判定適配體的結合位點是否為膜蛋白，對于非膜蛋白的結合位點鮮有進一步的探索。

再者，從篩選得到的核酸適配體的應用角度分析。人工堿基對的應用、計算機的應用及文庫修飾等都迫使適配體的文庫設計不斷改進，其可能會增加適配體篩選過程的成本，但文庫的改善對于篩選具備重要意義。經(jīng)系列篩選后，適配體的修飾、定點誘變、截短等增強其特性的手段也在不斷發(fā)展，使篩選得到的適配體在應用性上可以大大加強。

表1 常見的細胞特異性適配體

此外，當前細胞特異性適配體的篩選大多集中在癌細胞上。而針對人源正常細胞的適配體篩選還存在很大的空白。希望廣大研究者能夠進一步努力，繼續(xù)發(fā)展高效省時的適配體篩選方法，逐步豐富和完善適配體庫。