• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    用于Escherichia coli O157∶H7直接快速檢測的倏逝波熒光核酸適配體傳感器研究

    2020-08-04 03:02:28方順燕宋丹劉艷萍徐文娟劉佳瑤韓向峙龍峰
    生物技術(shù)通報(bào) 2020年7期
    關(guān)鍵詞:傳感水樣核酸

    方順燕 宋丹 劉艷萍 徐文娟 劉佳瑤 韓向峙 龍峰

    (中國人民大學(xué)環(huán)境學(xué)院,北京 100872)

    病原菌引起的各種傳染病是當(dāng)今危害人類健康與生命安全最為嚴(yán)重的一類疾?。?-2]。病原菌傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測法是一個(gè)金標(biāo)準(zhǔn)方法,但檢測周期長、程序復(fù)雜[1-3]。同時(shí),由于病原菌種類日益增多,且不少病原菌尚無可行的分離培養(yǎng)方法。而對(duì)于臨床檢驗(yàn)和環(huán)境污染應(yīng)急檢測來說,最為關(guān)鍵的要求之一是盡可能簡化分析處理過程、盡快獲得檢測結(jié)果和減少所需樣品量。傳統(tǒng)培養(yǎng)法顯然難以這樣要求。隨著分子生物學(xué)、免疫學(xué)等現(xiàn)代生物學(xué)的飛速發(fā)展,分子生物學(xué)技術(shù)及免疫分析技術(shù)被廣泛應(yīng)用于病原菌的檢測,如PCR技術(shù)、酶聯(lián)免疫分析技術(shù)等。理論上,這些方法可以檢測幾乎所有病原菌,并且可有效提高病原菌檢測的時(shí)效性及靈敏度,但是這些分析技術(shù)仍然需要較長時(shí)間(>2 h)、前處理過程繁雜、易受雜質(zhì)干擾、所需的樣品量較大及存在假陽/陰性結(jié)果等不足之處[1-4]。因此,發(fā)展適用于病原菌現(xiàn)場即時(shí)高靈敏、高特異性及快速經(jīng)濟(jì)的新技術(shù)已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)和前沿[5]。

    在融合現(xiàn)代光學(xué)、分子生物學(xué)和微流控等優(yōu)勢技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來光學(xué)生物傳感技術(shù)是病原菌現(xiàn)場快速檢測領(lǐng)域最為耀眼的明珠[5]。光學(xué)生物傳感器可大致分為比色生物傳感器、基于表面等離子共振的生物傳感器和基于激光誘導(dǎo)熒光的生物傳感器。其中,基于激光誘導(dǎo)熒光的生物傳感器已成為研究最為深入和應(yīng)用最為廣泛的一種光學(xué)生物傳感器。基于夾心法原理,利用納米信號(hào)增強(qiáng)技術(shù),該類傳感器檢測細(xì)菌和病毒污染的靈敏度可達(dá)到10 CFU/mL[5-6]。但要實(shí)現(xiàn)光學(xué)生物傳感器真正的實(shí)用化還存在幾大挑戰(zhàn)。第一個(gè)挑戰(zhàn)是使用現(xiàn)有的生物傳感器要實(shí)現(xiàn)病原菌檢測的關(guān)鍵步驟需將生物識(shí)別分子(如抗體、核酸適體等)固定到傳感元件上,以實(shí)現(xiàn)病原菌的特異性識(shí)別和捕獲。但修飾過程會(huì)造成生物分子活性的降低,且由于位阻效應(yīng),生物分子的固定會(huì)影響其對(duì)病原菌的捕獲,從而影響檢測靈敏度[7]。另一方面,生物傳感器的優(yōu)勢在于其可重復(fù)使用,但當(dāng)固定抗體或核酸適配體等生物識(shí)別分子時(shí),由于再生條件(強(qiáng)酸或強(qiáng)堿)苛刻,使得生物分子的活性快速下降,導(dǎo)致生物傳感器再生次數(shù)非常有限(<10次)。第二個(gè)挑戰(zhàn)是如何簡化病原菌檢測方式以實(shí)現(xiàn)其現(xiàn)場快速分析?,F(xiàn)有的病原菌生物傳感器一般采用夾心法,這就使得檢測過程需要進(jìn)行多個(gè)反應(yīng)步驟,增加了檢測時(shí)間。同時(shí),使用試劑種類多,造成檢測成本比較高。更為重要的是,為提高檢測靈敏度,通常需要使用過濾或免疫磁珠來對(duì)病原菌進(jìn)行富集分離,這進(jìn)一步延長了檢測時(shí)間并使得檢測過程復(fù)雜化。

    為此,本研究提出一種新的倏逝波熒光生物傳感分析策略來實(shí)現(xiàn)病原菌直接快速檢測。根據(jù)我們前期的研究成果和經(jīng)驗(yàn),倏逝波光纖生物傳感器是利用光在光纖進(jìn)行全反射傳播時(shí),在光纖表面產(chǎn)生倏逝波,其強(qiáng)度隨滲入深度呈指數(shù)衰減,有效深度在100 nm以內(nèi),當(dāng)熒光標(biāo)記的生物分子探針進(jìn)入倏逝波有效范圍內(nèi),熒光分子被激發(fā)光激發(fā)發(fā)出熒光,通過檢測熒光強(qiáng)度來實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的檢測[8-9]。而病原菌(如大腸桿菌、沙門氏菌等)的尺寸約為幾百nm到μm級(jí)。因此,我們提出基于倏逝波熒光原理及其與病原菌的尺寸效應(yīng)來實(shí)現(xiàn)病原菌的直接快速檢測。本研究以E.coliO157∶H7為靶標(biāo)物,結(jié)合特異性的核酸適配體來實(shí)現(xiàn)其直接快速檢測?;驹硎钱?dāng)一定濃度熒光標(biāo)記核酸適配體加入樣品檢測池時(shí),倏逝波激發(fā)熒光分子發(fā)出熒光,利用課題組前期研發(fā)的倏逝波全光纖生物傳感器即可實(shí)現(xiàn)熒光信號(hào)的定量檢測。而當(dāng)熒光標(biāo)記的核酸適配體與E.coliO157∶H7混合后加入樣品檢測池,由于部分核酸適配體結(jié)合到E.coliO157∶H7表面,其標(biāo)記熒光分子不能被激發(fā),故導(dǎo)致檢測熒光信號(hào)降低,利用熒光信號(hào)強(qiáng)度與E.coliO157∶H7濃度的比例關(guān)系即可實(shí)現(xiàn)其定量檢測。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 試劑、緩沖溶液及適配體等 濃硫酸、過氧化氫、氫氟酸、氯化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉及鹽酸等化學(xué)試劑均購于北京化學(xué)試劑公司,所有試劑均為分析純或更高。十二烷基硫酸鈉(SDS)購自Sigma-aldrich公司(上海,中國)。自配PBS緩沖溶液(pH 7.4,137 mmol/L NaCl+2.7 mmol/L KCl+4.3 mmol/L Na2HPO4+1.4 mmol/L KH2PO4)、Tris-HCl緩沖液、SDS溶液(0.5% SDS,pH 1.9)。

    與大腸桿菌特異性結(jié)合的核酸適配體序列結(jié)構(gòu)為5'- GCGGGAATAGGATGCGGCTGG AAGGAGAGGTGTTGGTGGGTGGTG -3',其5'-端標(biāo)記熒光分子Cy5.5,該核酸適配體由生工生物工程(上海)股份公司合成。E.coliO157∶H7、發(fā)光細(xì)菌、沙門氏菌使用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)。不同濃度的菌液由10 mmol/L PBS溶液稀釋而成。

    1.1.2 倏逝波熒光光纖生物傳感器 使用的倏逝波熒光光纖生物傳感器如圖1所示。其原理是,激發(fā)光(635 nm,10 mW)經(jīng)過單多模光纖耦合器進(jìn)入光纖傳感探頭,在光纖傳感探頭內(nèi)以全反射方式傳播,并在探頭表面形成倏逝波。當(dāng)熒光分子進(jìn)入倏逝波激發(fā)的有效范圍內(nèi)時(shí),倏逝波激發(fā)熒光分子發(fā)出熒光,部分熒光耦合回光纖傳感探頭,由單多模光纖耦合器進(jìn)行收集與傳輸,經(jīng)濾光片濾除雜散光后被硅光電探測器進(jìn)行檢測。檢測到的熒光信號(hào)值實(shí)時(shí)顯示在用戶界面上。

    圖1 倏逝波熒光光纖生物傳感器原理示意圖

    1.2 方法

    1.2.1 光纖傳感探頭制備 將 5.5 cm長的石英光纖(數(shù)值孔徑為0.22,南京春暉科技發(fā)展有限公司)去除2.5 cm長的涂覆層,將無涂覆層的光纖浸入50%HF溶液中進(jìn)行腐蝕,光纖芯徑腐蝕至225 μm即可。

    1.2.2 病原菌的培養(yǎng)E.coliO157∶H7的菌落用灼燒后冷卻的接種環(huán)接種于1 mL LB液體培養(yǎng)基中,將其在置于37℃恒溫水浴震蕩12 h,然后將震蕩好的菌液加入到100 mL LB液體培養(yǎng)基中,37℃水浴恒溫震蕩24 h。為保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性,每次實(shí)驗(yàn)均使用新鮮菌液。

    1.2.3E.coliO157∶H7的檢測 為獲得E.coliO157∶H7檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線,將500 nmol/L的E.coliO157∶H7核酸適體分別與不同濃度的E.coliO157∶H7混合,在25℃下預(yù)反應(yīng)15 min,然后輸入到樣品檢測池進(jìn)行熒光信號(hào)檢測。每個(gè)濃度進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)。為繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,對(duì)不同濃度E.coliO157∶H7所得到熒光信號(hào)檢測值進(jìn)行歸一化處理,即:

    式中,I為加入不同濃度的E.coliO157∶H7時(shí),傳感器檢測到的熒光信號(hào)值;I0為未加E.coliO157∶H7的空白樣品熒光信號(hào)值。利用Logistics四參數(shù)模型進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合,即:

    式中,[x]為E.coliO157∶H7的濃度;y為x對(duì)應(yīng)的熒光信號(hào)歸一化值;A1為上端漸近線(x=0),常數(shù);A2為下端漸近線(x→∞),常數(shù);[x0]為曲線的拐點(diǎn),常數(shù);p為拐點(diǎn)處曲線的斜率,常數(shù)。根據(jù)Sinibaldi等[10]和 Chiavaioli等[11],傳感器的檢測限一般定義為空白樣檢測的平均信號(hào)值加上其3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差,依據(jù)該定義對(duì)該傳感器的檢測限進(jìn)行計(jì)算。

    1.2.4 實(shí)際水樣的加標(biāo)檢測 以校園景觀水、自來水、污水處理廠出水為例進(jìn)行加標(biāo)分析,考察水體基質(zhì)對(duì)傳感分析性能的影響。由于實(shí)際樣品中所含細(xì)菌種類多樣,如果不進(jìn)行滅菌操作,實(shí)驗(yàn)樣品的各種細(xì)菌均可在LB培養(yǎng)基上生長,導(dǎo)致無法使用傳統(tǒng)培養(yǎng)法進(jìn)行比對(duì)。因此,首先運(yùn)用高溫滅菌鍋對(duì)實(shí)際水樣進(jìn)行高溫滅菌(121℃),以便考察實(shí)際樣品對(duì)傳感器的影響并于傳統(tǒng)培養(yǎng)法進(jìn)行比對(duì)。然后,將擴(kuò)增培養(yǎng)的菌液使用離心機(jī)在10 000 r/min下離心8 min,清洗3次后,加入各種實(shí)際水樣中,并配成3種不同濃度。各種加標(biāo)水樣與500 nmol/L熒光標(biāo)記E.coliO157∶H7核酸適配體混合,在25℃下預(yù)反應(yīng)15 min,然后輸入樣品檢測池進(jìn)行檢測。微生物培養(yǎng)計(jì)數(shù)法將各種加標(biāo)水樣分別稀釋后,取100 μL稀釋液在LB固體培養(yǎng)基上涂布,在37℃恒溫培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)。

    2 結(jié)果

    2.1 基于倏逝波熒光原理的E.coli O157∶H7傳感分析機(jī)制與驗(yàn)證

    基于倏逝波熒光原理的E.coliO157∶H7傳感分析機(jī)制如圖2所示。由菲涅爾公式可知,當(dāng)光束由折射率n大的介質(zhì)進(jìn)入n小的介質(zhì)時(shí),若入射角θ大于臨界角θc,入射光將全部反射回n大的介質(zhì)中。在全反射的條件下,由于橫向電場與橫向磁場的Fresnel傳遞系數(shù)不為零,這意味著雖然光能全部被反射,但電磁場卻可從兩種介質(zhì)的界面延伸至n小的介質(zhì)中,即所謂的“倏逝波”,并遵循式(3)呈指數(shù)衰減[12]:

    式中,z為距光纖探頭界面的距離,E(z)為z處倏逝波振幅,E0為界面處電磁場振幅,dp為滲入深度。對(duì)于多模光纖探頭,滲入深度dp(定義為電磁場為界面處電磁強(qiáng)度1/e的距離),為折射率、入射角和波長的函數(shù):

    式中:λex是激發(fā)光的波長;θ是激發(fā)光與法線間夾角。本試驗(yàn)中激發(fā)光波長為635 nm,光纖探頭折射率為1.456,PBS溶液的折射率為1.33,因此,倏逝波的有效深度約為100 nm。

    當(dāng)500 nmol/L熒光標(biāo)記核酸適配體輸入到樣品檢測池時(shí),從圖3可以看出,倏逝波熒光光纖生物傳感器檢測到突然上升的熒光信號(hào),這是由于倏逝波激發(fā)溶液中游離的核酸適配體標(biāo)記熒光所致。由于倏逝波的強(qiáng)度有限,熒光漂白不明顯,因此傳感器檢測熒光信號(hào)值保持基本不變。當(dāng)500 nmol/L熒光標(biāo)記核酸適配體與1×105CFU/mL大腸桿菌混合反應(yīng)一段時(shí)間后輸入到樣品檢測池時(shí),傳感器檢測到熒光信號(hào)也突然上升,但是熒光信號(hào)值明顯低于未加入大腸桿菌時(shí)的熒光信號(hào)值。這說明部分核酸適配體特異性結(jié)合到大腸桿菌表面,由于大腸桿菌的尺寸在微米級(jí),倏逝波很難激發(fā)結(jié)合到大腸桿菌表面的熒光標(biāo)記核酸適配體,從而導(dǎo)致檢測到的熒光信號(hào)值下降。為進(jìn)一步驗(yàn)證該結(jié)論,我們將500 nmol/L熒光標(biāo)記的大腸桿菌核酸適配體分別與1×109CFU/mL沙門氏菌和發(fā)光細(xì)菌混合并輸入到樣品檢測池,從圖3可以看出,雖然沙門氏菌和發(fā)光細(xì)菌的濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于大腸桿菌的濃度,但是傳感器檢測到的熒光信號(hào)值并沒有明顯下降。這一方面說明大腸桿菌核酸適配體具有良好的選擇性,不會(huì)與其他病原菌結(jié)合,同時(shí)證明本研究提出的基于倏逝波熒光原理和及其與病原菌尺寸效應(yīng)的檢測機(jī)制是可行的,可以用于E.coliO157∶H7的直接快速檢測。

    圖2 基于倏逝波熒光原理的E.coli O157∶H7傳感分析機(jī)制示意圖

    圖3 E.coli O157∶H7傳感分析驗(yàn)證

    2.2 E.coli O157∶H7檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

    為獲得基于倏逝波熒光原理的E.coliO157∶H7生物傳感分析標(biāo)準(zhǔn)檢測曲線,配制不同濃度的E.coliO157∶H7溶液,分別與500 nmol/L的熒光標(biāo)記核酸適配體混合,反應(yīng)15 min后輸入到樣品檢測池進(jìn)行熒光信號(hào)值檢測,得到系列熒光信號(hào)檢測曲線(圖4)。從圖4可以看出,倏逝波熒光光纖傳感器檢測到的熒光信號(hào)值隨E.coliO157∶H7濃度的升高而下降。這是由于隨著E.coliO157∶H7濃度的增加,更多的熒光標(biāo)記核酸適配體結(jié)合E.coliO157∶H7表面。因E.coliO157∶H7的尺寸在微米級(jí),而倏逝波的滲入深度有限,部分標(biāo)記在核酸適配體上熒光分子不能被激發(fā),從而導(dǎo)致熒光信號(hào)值的下降。各個(gè)濃度E.coliO157∶H7重復(fù)測試3次,熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差都少于5%,表明該方法具有良好的穩(wěn)定性。

    圖4 不同濃度E.coli O157∶H7的典型熒光信號(hào)曲線

    將不同濃度下的熒光信號(hào)值根據(jù)式1進(jìn)行歸一化處理,所得歸一化值按式2擬合,得到E.coliO157∶H7的檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖5)。通過計(jì)算可以得出,E.coliO157∶H7檢測范圍為1.1×103-1.4×107CFU/mL,檢測限[10-11]為610 CFU/mL。以上結(jié)果表明該方法具有較好的靈敏度和穩(wěn)定性。

    2.3 實(shí)際水樣的E.coli O157∶H7加標(biāo)測試

    圖5 E.coli O157∶H7檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線

    為驗(yàn)證該方法在實(shí)際水樣中運(yùn)用的可行性,考察水體基質(zhì)對(duì)傳感分析性能的影響,利用該方法分析了校園景觀水、自來水和污水處理廠出水等實(shí)際水樣的加標(biāo)回收率并與傳統(tǒng)培養(yǎng)法進(jìn)行了比對(duì)。在檢測前,先用高溫滅菌鍋對(duì)實(shí)際水樣進(jìn)行高溫滅菌(121℃)。然后,將培養(yǎng)的E.coliO157∶H7加入各種實(shí)際水樣中。各種加標(biāo)水樣與500 nmol/L熒光標(biāo)記E.coliO157∶H7核酸適配體混合,在25℃下預(yù)反應(yīng)15 min,然后輸入樣品檢測池進(jìn)行檢測。從表1可以看出,E.coliO157∶H7的回收率在40%-180%之間,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在10%之內(nèi)。與傳統(tǒng)的培養(yǎng)法具有較好的一致性,這些結(jié)果表明本研究建立的基于倏逝波熒光原理的E.coliO157∶H7生物傳感分析方法可以用于實(shí)際水樣的檢測。

    3 討論

    E.coliO157∶H7是一種腸出血性大腸桿菌,可經(jīng)食物和飲用水在人群中廣泛傳播,可導(dǎo)致腹痛、腹瀉、急性腎衰,甚至死亡。美國和歐盟曾發(fā)生多次E.coliO157∶H7的爆發(fā)性流行[13]。因此,多國衛(wèi)生部門已將E.coliO157∶H7列為常規(guī)檢測項(xiàng)目,我國生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中要求不得檢出[14-15]。因此,發(fā)展高特異性、操作簡單、檢測迅速及成本低廉的病原菌檢測方法具有重要的科學(xué)價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。

    本研究結(jié)合倏逝波熒光光纖傳感器和核酸適配體的優(yōu)勢,提出了基于倏逝波熒光原理及其與病原菌尺寸效應(yīng)的E.coliO157∶H7直接快速檢測方法。該方法可以避免傳統(tǒng)生物傳感器需要固定生物識(shí)別分子造成的諸多不足,如生物識(shí)別分子在固定過程中可能導(dǎo)致活性損失等。由于本研究采用的是將特異性核酸適配體與E.coliO157∶H7在均相中直接反應(yīng),因此,可以有效提高生物識(shí)別分子與病原菌的親和反應(yīng)效率。這種檢測模式無需苛刻的再生條件,僅需在檢測完成后,將樣品排出樣品池即可進(jìn)行下一個(gè)樣品的檢測。同時(shí),傳統(tǒng)生物傳感器常采用夾心法方式來實(shí)現(xiàn)病原菌的檢測,即采用一種生物識(shí)別分子(抗體或核酸適配體等)固定在生物傳感器表面捕獲病原菌,然后用另一種熒光標(biāo)記生物功能分子結(jié)合到病原菌表面作為報(bào)告分子[16-19]。本研究提出的方法僅用一種熒光標(biāo)記核酸適配體即可實(shí)現(xiàn)E.coliO157∶H7快速識(shí)別與定量檢測,這可以大大簡化病原菌檢測程序,減少檢測時(shí)間和反應(yīng)試劑的使用,有效降低檢測成本。更進(jìn)一步,本研究提出的檢測方法僅需更換熒光標(biāo)記的生物識(shí)別分子即可實(shí)現(xiàn)其他不同的病原菌的檢測。因此,基于倏逝波熒光原理及其與病原菌尺寸效應(yīng)的生物傳感分析技術(shù)具有廣泛的適用性和實(shí)用性。

    表1 實(shí)際水樣中E.coli O157∶H7的加標(biāo)回收率(n=3)

    4 結(jié)論

    融合倏逝波熒光光纖傳感器和特異性核酸適配體的優(yōu)勢,提出一種了基于倏逝波熒光原理及其與病原菌尺寸效應(yīng)的病原菌新型檢測方法。研究表明該方法可實(shí)現(xiàn)E.coliO157∶H7的直接快速檢測,檢測限可達(dá)610 CFU/mL,線性檢測區(qū)間為1.1×103-1.4×107CFU/mL。由于使用特異性核酸適配體與E.coliO157∶H7在均相溶液中結(jié)合,利用倏逝波熒光原理及尺寸效應(yīng)來實(shí)現(xiàn)其快速檢測,無需固定生物識(shí)別分子,也無需采用夾心法的檢測模式。因此,該方法可有效縮短檢測時(shí)間(<30 min),減少使用的反應(yīng)試劑和檢測成本。對(duì)實(shí)際水樣進(jìn)行了加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明加標(biāo)回收率在40%-180%之間,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在10%之內(nèi),水樣基質(zhì)對(duì)該方法檢測E.coliO157∶H7沒有明顯影響。因此,本研究建立基于倏逝波熒光原理及其與病原菌尺寸效應(yīng)的生物傳感分析方法可以用于實(shí)際水樣的檢測,同時(shí),僅需更換熒光標(biāo)記的生物識(shí)別分子即可實(shí)現(xiàn)其他不同的病原菌的檢測。

    猜你喜歡
    傳感水樣核酸
    《傳感技術(shù)學(xué)報(bào)》期刊征訂
    新型無酶便攜式傳感平臺(tái) 兩秒內(nèi)測出果蔬農(nóng)藥殘留
    測核酸
    中華詩詞(2022年9期)2022-07-29 08:33:50
    全員核酸
    中國慈善家(2022年3期)2022-06-14 22:21:55
    第一次做核酸檢測
    快樂語文(2021年34期)2022-01-18 06:04:14
    核酸檢測
    中國(俄文)(2020年8期)2020-11-23 03:37:13
    我國相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)水樣總α、總β放射性分析方法應(yīng)用中存在的問題及應(yīng)對(duì)
    平行水樣分配器在環(huán)境監(jiān)測中的應(yīng)用
    綠色科技(2018年24期)2019-01-19 06:36:50
    IPv6與ZigBee無線傳感網(wǎng)互聯(lián)網(wǎng)關(guān)的研究
    電子制作(2018年23期)2018-12-26 01:01:26
    水樣童年
    日本 欧美在线| 天美传媒精品一区二区| 国产精品三级大全| 亚洲五月婷婷丁香| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 在线观看舔阴道视频| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 天天躁日日操中文字幕| 亚洲国产中文字幕在线视频| 波野结衣二区三区在线 | 国模一区二区三区四区视频| www.熟女人妻精品国产| 国语自产精品视频在线第100页| 国产伦精品一区二区三区四那| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 亚洲自拍偷在线| 午夜福利高清视频| 69人妻影院| 男女床上黄色一级片免费看| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 久久久久亚洲av毛片大全| 亚洲成人精品中文字幕电影| 综合色av麻豆| 美女高潮的动态| 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 亚洲无线在线观看| 老熟妇仑乱视频hdxx| 国产老妇女一区| 久久国产精品影院| 日韩中文字幕欧美一区二区| 999久久久精品免费观看国产| 日韩欧美一区二区三区在线观看| tocl精华| 中文字幕av在线有码专区| 欧美一区二区精品小视频在线| 男女床上黄色一级片免费看| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 中文字幕久久专区| 日韩精品青青久久久久久| 国产黄a三级三级三级人| 午夜精品在线福利| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 亚洲成a人片在线一区二区| 国产高清激情床上av| 国产精品三级大全| 亚洲av免费高清在线观看| 亚洲人成网站在线播| 久久久久久久久中文| 精品福利观看| 好男人电影高清在线观看| 国产真实伦视频高清在线观看 | 亚洲av电影不卡..在线观看| 亚洲一区二区三区不卡视频| 亚洲中文字幕日韩| 亚洲成人精品中文字幕电影| 十八禁网站免费在线| 日本免费a在线| 亚洲五月婷婷丁香| 亚洲第一电影网av| www日本在线高清视频| 两个人的视频大全免费| 国产午夜福利久久久久久| 91九色精品人成在线观看| 精品久久久久久久久久久久久| 欧美国产日韩亚洲一区| netflix在线观看网站| 亚洲专区国产一区二区| 又粗又爽又猛毛片免费看| 国产高清激情床上av| 嫩草影院精品99| 成人无遮挡网站| 一级黄片播放器| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 一级毛片高清免费大全| 成年版毛片免费区| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 91字幕亚洲| eeuss影院久久| 日本 av在线| 国产黄a三级三级三级人| 两个人视频免费观看高清| 国产真实乱freesex| 国产真实乱freesex| x7x7x7水蜜桃| 女人被狂操c到高潮| 精品久久久久久成人av| 亚洲精品456在线播放app | 国产高清视频在线播放一区| 一区二区三区高清视频在线| 欧美日本亚洲视频在线播放| avwww免费| 热99在线观看视频| 深夜精品福利| 国产精品三级大全| 香蕉丝袜av| 国产精品免费一区二区三区在线| 黄片小视频在线播放| 色综合站精品国产| 综合色av麻豆| 日韩有码中文字幕| 国产综合懂色| 国内精品一区二区在线观看| 国产精品综合久久久久久久免费| 久久精品国产自在天天线| 老汉色av国产亚洲站长工具| 欧美zozozo另类| 国产真实乱freesex| svipshipincom国产片| 午夜久久久久精精品| 脱女人内裤的视频| 成人精品一区二区免费| 岛国在线观看网站| 全区人妻精品视频| 婷婷精品国产亚洲av在线| 3wmmmm亚洲av在线观看| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 淫秽高清视频在线观看| 亚洲精品影视一区二区三区av| 可以在线观看的亚洲视频| 亚洲av不卡在线观看| 黑人欧美特级aaaaaa片| 国产亚洲精品一区二区www| 成人国产综合亚洲| 国产爱豆传媒在线观看| 男人舔奶头视频| 午夜福利18| 变态另类丝袜制服| www.www免费av| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 91久久精品电影网| 在线免费观看的www视频| 母亲3免费完整高清在线观看| 久9热在线精品视频| 三级毛片av免费| 看片在线看免费视频| 国产一级毛片七仙女欲春2| 大型黄色视频在线免费观看| 亚洲专区中文字幕在线| 91字幕亚洲| 免费看a级黄色片| av中文乱码字幕在线| 日本五十路高清| 亚洲精品在线观看二区| 午夜福利18| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 丁香欧美五月| 少妇丰满av| 国产主播在线观看一区二区| 色噜噜av男人的天堂激情| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 日本 欧美在线| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 成人亚洲精品av一区二区| 国产高清三级在线| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 婷婷精品国产亚洲av| 神马国产精品三级电影在线观看| 草草在线视频免费看| 欧美一区二区国产精品久久精品| a在线观看视频网站| 99久久精品国产亚洲精品| 日本三级黄在线观看| 亚洲av成人精品一区久久| 日韩国内少妇激情av| 欧美一区二区精品小视频在线| 欧美在线黄色| 丰满乱子伦码专区| 美女cb高潮喷水在线观看| 少妇的丰满在线观看| 美女被艹到高潮喷水动态| 在线观看一区二区三区| 男人舔奶头视频| 亚洲美女视频黄频| 18禁国产床啪视频网站| 搞女人的毛片| 亚洲av二区三区四区| 免费在线观看影片大全网站| 最新中文字幕久久久久| 国产精品三级大全| 69av精品久久久久久| 99久久无色码亚洲精品果冻| 一边摸一边抽搐一进一小说| 99riav亚洲国产免费| 一边摸一边抽搐一进一小说| 51国产日韩欧美| 亚洲第一电影网av| 国产精品国产高清国产av| 成年版毛片免费区| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 搡老岳熟女国产| 色吧在线观看| 欧美黄色片欧美黄色片| 听说在线观看完整版免费高清| 国产成人影院久久av| 又爽又黄无遮挡网站| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 国产老妇女一区| 亚洲欧美日韩无卡精品| 宅男免费午夜| 日本 欧美在线| 久久久久久久精品吃奶| 可以在线观看的亚洲视频| 嫁个100分男人电影在线观看| 国产单亲对白刺激| 免费一级毛片在线播放高清视频| 国产老妇女一区| 午夜福利高清视频| 午夜a级毛片| 亚洲av免费在线观看| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 丝袜美腿在线中文| 国产日本99.免费观看| 亚洲久久久久久中文字幕| 窝窝影院91人妻| 18+在线观看网站| 国产精品98久久久久久宅男小说| 2021天堂中文幕一二区在线观| 国产高清视频在线观看网站| 黄色视频,在线免费观看| 成人无遮挡网站| 国产v大片淫在线免费观看| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 少妇的逼好多水| 丝袜美腿在线中文| 夜夜夜夜夜久久久久| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 欧美三级亚洲精品| 精品国产美女av久久久久小说| 天美传媒精品一区二区| 免费在线观看成人毛片| 脱女人内裤的视频| 国产成+人综合+亚洲专区| 波野结衣二区三区在线 | www.999成人在线观看| 淫秽高清视频在线观看| 天天躁日日操中文字幕| 99热6这里只有精品| 女人被狂操c到高潮| 国产精品 欧美亚洲| 免费观看精品视频网站| 亚洲欧美日韩东京热| 亚洲精品在线美女| 国产高清激情床上av| 国产伦人伦偷精品视频| 成人性生交大片免费视频hd| 国产综合懂色| 小说图片视频综合网站| 一级a爱片免费观看的视频| 天堂√8在线中文| 夜夜爽天天搞| 最新在线观看一区二区三区| 一级毛片女人18水好多| 在线a可以看的网站| 日韩成人在线观看一区二区三区| 国产一区二区激情短视频| 亚洲av免费高清在线观看| 亚洲第一电影网av| 黄色成人免费大全| 精华霜和精华液先用哪个| 久久久国产精品麻豆| 热99re8久久精品国产| 怎么达到女性高潮| 亚洲国产高清在线一区二区三| 国产主播在线观看一区二区| 制服丝袜大香蕉在线| 亚洲人成伊人成综合网2020| 精品久久久久久久久久免费视频| 国产极品精品免费视频能看的| 精品国产美女av久久久久小说| 国产成人影院久久av| 狂野欧美激情性xxxx| 欧美一级a爱片免费观看看| 亚洲最大成人中文| 嫩草影视91久久| 香蕉av资源在线| 欧美一区二区亚洲| 精品欧美国产一区二区三| 国产在线精品亚洲第一网站| 在线观看舔阴道视频| 久久人人精品亚洲av| 免费看美女性在线毛片视频| 午夜激情欧美在线| 成人一区二区视频在线观看| 亚洲国产精品999在线| 麻豆国产97在线/欧美| 成年人黄色毛片网站| 免费人成在线观看视频色| 日本免费一区二区三区高清不卡| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 午夜激情福利司机影院| 久久精品国产综合久久久| 精品人妻1区二区| 久久久精品欧美日韩精品| 欧美3d第一页| 免费看光身美女| 欧美日本亚洲视频在线播放| 最近视频中文字幕2019在线8| 亚洲成a人片在线一区二区| 看黄色毛片网站| 91字幕亚洲| 九色成人免费人妻av| 亚洲av电影在线进入| 在线看三级毛片| 特大巨黑吊av在线直播| 白带黄色成豆腐渣| 欧美bdsm另类| 天美传媒精品一区二区| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 全区人妻精品视频| 一进一出好大好爽视频| 免费搜索国产男女视频| 欧美极品一区二区三区四区| 国产探花极品一区二区| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 色播亚洲综合网| 中出人妻视频一区二区| 99久久99久久久精品蜜桃| 中文字幕av成人在线电影| 国产成年人精品一区二区| 成年人黄色毛片网站| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 国产精品亚洲一级av第二区| 男女床上黄色一级片免费看| 免费在线观看亚洲国产| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 桃红色精品国产亚洲av| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 国产精品99久久久久久久久| 国产三级中文精品| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 免费在线观看成人毛片| 搡老熟女国产l中国老女人| 男女午夜视频在线观看| 日韩欧美免费精品| 久久久久性生活片| 亚洲一区二区三区不卡视频| ponron亚洲| 亚洲国产欧美人成| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 精品国内亚洲2022精品成人| 老汉色∧v一级毛片| 久久香蕉国产精品| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 久久久久久久久中文| 亚洲真实伦在线观看| 偷拍熟女少妇极品色| 99热这里只有精品一区| 免费无遮挡裸体视频| 婷婷六月久久综合丁香| 亚洲最大成人手机在线| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 久久香蕉精品热| 88av欧美| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 国产精品野战在线观看| 又粗又爽又猛毛片免费看| 国产一区二区激情短视频| 午夜激情欧美在线| 欧美高清成人免费视频www| 国产av在哪里看| 欧美成人性av电影在线观看| 精品日产1卡2卡| av福利片在线观看| 18禁国产床啪视频网站| 欧美色视频一区免费| 国产精品野战在线观看| 人人妻人人澡欧美一区二区| 天美传媒精品一区二区| 亚洲国产精品久久男人天堂| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 宅男免费午夜| 国产亚洲av嫩草精品影院| 精品国内亚洲2022精品成人| 免费看a级黄色片| 国产成人影院久久av| 国产激情欧美一区二区| 国产男靠女视频免费网站| 51午夜福利影视在线观看| 国产久久久一区二区三区| 精品不卡国产一区二区三区| 国产精品免费一区二区三区在线| 一级黄片播放器| 国产精品99久久99久久久不卡| 丰满人妻一区二区三区视频av | 国产精品久久电影中文字幕| 欧美+亚洲+日韩+国产| av在线天堂中文字幕| 成人18禁在线播放| 精品电影一区二区在线| 天美传媒精品一区二区| 高清在线国产一区| 国产精品综合久久久久久久免费| 99国产综合亚洲精品| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 国产国拍精品亚洲av在线观看 | 国产高清videossex| 国产精品久久久久久久电影 | 久久久精品大字幕| 在线观看av片永久免费下载| 叶爱在线成人免费视频播放| 亚洲精品456在线播放app | 成人午夜高清在线视频| svipshipincom国产片| 欧美三级亚洲精品| 国产精品三级大全| 欧美黄色淫秽网站| 国产精品一区二区三区四区久久| 在线观看日韩欧美| netflix在线观看网站| 在线视频色国产色| 日本 欧美在线| 久久久精品大字幕| 欧美+亚洲+日韩+国产| 亚洲av一区综合| 校园春色视频在线观看| 熟女电影av网| 国产一区二区在线av高清观看| 三级毛片av免费| 日本熟妇午夜| 美女黄网站色视频| 欧美日韩福利视频一区二区| 香蕉久久夜色| 国产主播在线观看一区二区| 禁无遮挡网站| 在线国产一区二区在线| 91av网一区二区| 男人的好看免费观看在线视频| 中文字幕av在线有码专区| 啦啦啦免费观看视频1| 成年人黄色毛片网站| 9191精品国产免费久久| 国产高清视频在线观看网站| www国产在线视频色| 成年女人看的毛片在线观看| 天天添夜夜摸| 欧美国产日韩亚洲一区| 一进一出抽搐gif免费好疼| 俄罗斯特黄特色一大片| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 国产精品综合久久久久久久免费| 免费大片18禁| 国产在线精品亚洲第一网站| 亚洲精品在线观看二区| 好男人在线观看高清免费视频| 老鸭窝网址在线观看| 日本 欧美在线| 最新美女视频免费是黄的| 久久人人精品亚洲av| 午夜福利视频1000在线观看| 特级一级黄色大片| 久久久久久久久大av| 欧美色欧美亚洲另类二区| 熟女电影av网| 国产精品女同一区二区软件 | 日本 av在线| 日韩有码中文字幕| 手机成人av网站| 变态另类丝袜制服| 亚洲欧美精品综合久久99| 色哟哟哟哟哟哟| 欧美日韩乱码在线| 黑人欧美特级aaaaaa片| 亚洲欧美日韩无卡精品| 1024手机看黄色片| 婷婷亚洲欧美| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 欧美中文综合在线视频| 久久久久久人人人人人| 亚洲av熟女| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 日本 av在线| 亚洲成人久久爱视频| 国产精品98久久久久久宅男小说| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 欧美国产日韩亚洲一区| 国产av在哪里看| 美女cb高潮喷水在线观看| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 国产黄a三级三级三级人| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 成人国产一区最新在线观看| 一本久久中文字幕| 欧美激情久久久久久爽电影| 综合色av麻豆| 99热这里只有是精品50| www日本黄色视频网| 日韩有码中文字幕| 亚洲专区国产一区二区| 黄色视频,在线免费观看| 国产成人av激情在线播放| 色噜噜av男人的天堂激情| aaaaa片日本免费| 中文亚洲av片在线观看爽| 男女之事视频高清在线观看| 国产精品野战在线观看| 国产91精品成人一区二区三区| 99久久综合精品五月天人人| 中文字幕av成人在线电影| 久久久久国内视频| 亚洲欧美日韩东京热| 淫秽高清视频在线观看| 久久久精品大字幕| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 国产v大片淫在线免费观看| 99国产极品粉嫩在线观看| 精品一区二区三区视频在线 | 91久久精品国产一区二区成人 | 日本与韩国留学比较| 女警被强在线播放| 国产精品久久久久久久电影 | 成人永久免费在线观看视频| 亚洲av成人av| 最近最新中文字幕大全电影3| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| www国产在线视频色| 波多野结衣高清无吗| 日韩有码中文字幕| 1000部很黄的大片| 青草久久国产| 国产精品亚洲一级av第二区| 欧美成人a在线观看| 99久久九九国产精品国产免费| av在线天堂中文字幕| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 偷拍熟女少妇极品色| 色综合婷婷激情| 国产一区二区激情短视频| 欧美一级a爱片免费观看看| 国产欧美日韩一区二区三| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 最好的美女福利视频网| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 日韩亚洲欧美综合| av在线蜜桃| 好男人在线观看高清免费视频| 999久久久精品免费观看国产| 真人一进一出gif抽搐免费| 一级黄色大片毛片| 色播亚洲综合网| 少妇高潮的动态图| 精品免费久久久久久久清纯| 又黄又粗又硬又大视频| 国产精品精品国产色婷婷| 在线观看舔阴道视频| 一个人免费在线观看的高清视频| 精品一区二区三区av网在线观看| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 男女那种视频在线观看| 国产精品,欧美在线| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 午夜两性在线视频| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 免费看光身美女| 搡老妇女老女人老熟妇| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 叶爱在线成人免费视频播放| 欧美日韩国产亚洲二区| 中文字幕熟女人妻在线| 搡老熟女国产l中国老女人| 偷拍熟女少妇极品色| 91九色精品人成在线观看| 免费观看人在逋| 欧美乱色亚洲激情| 深爱激情五月婷婷| 国产伦一二天堂av在线观看| 香蕉丝袜av| 日韩国内少妇激情av| 18禁美女被吸乳视频| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 免费观看人在逋| 99国产精品一区二区三区| 69人妻影院| 婷婷亚洲欧美| 嫩草影院入口| 中文亚洲av片在线观看爽| 青草久久国产| 日韩欧美 国产精品| 欧美日韩一级在线毛片| 97碰自拍视频| 很黄的视频免费| 无遮挡黄片免费观看| 欧美一级毛片孕妇| 男人舔女人下体高潮全视频| 国产成人啪精品午夜网站| 久久99热这里只有精品18| 最近最新中文字幕大全电影3| 男女床上黄色一级片免费看| 国产探花在线观看一区二区| 亚洲国产欧美人成| 在线播放无遮挡| 日本免费a在线| www日本在线高清视频| 最近最新免费中文字幕在线| 日韩中文字幕欧美一区二区| 国产欧美日韩一区二区精品| 久久久久久人人人人人| 午夜激情欧美在线| 2021天堂中文幕一二区在线观| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 美女免费视频网站| 日本在线视频免费播放| 国产私拍福利视频在线观看| 怎么达到女性高潮| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 亚洲国产欧美网| 精品免费久久久久久久清纯| 少妇熟女aⅴ在线视频| 老鸭窝网址在线观看| 欧美日韩黄片免| 一级作爱视频免费观看|