KPC-rg1抗H1N1流感病毒活性研究初探

李 瀅 董艷萍 任 超 黃 茜 李 寧 楊兆祥 張建文

(昆藥集團(tuán)股份有限公司藥物研究院,云南 昆明 650100)

0 引 言

病毒是人和動(dòng)物的重要病原體.據(jù)統(tǒng)計(jì),病毒所導(dǎo)致的疾病占所有感染性疾病的75.0%以上,抗病毒治療在臨床上顯得尤為重要[1],目前接種疫苗仍然是防止病毒性疾病擴(kuò)散的最有效方法.

傳統(tǒng)病毒疫苗滅活制備工藝中常用的滅活劑有甲醛和β-丙內(nèi)酯,但制作這類滅活劑疫苗不僅耗時(shí)、工藝復(fù)雜,而且滅活過程中難以保證病毒抗原的完整性.因此,在保證滅活絕對(duì)安全的前提下,縮短滅活時(shí)間,降低有效抗原的損失和簡(jiǎn)化純化工藝步驟一直是疫苗制作追求的目標(biāo),探索新型病毒滅活制劑與佐劑技術(shù)成為當(dāng)今國(guó)際研發(fā)抗病毒疫苗領(lǐng)域新的熱點(diǎn)之一.

使用不同性質(zhì)的材料進(jìn)行病毒滅活和相關(guān)防毒設(shè)備的研發(fā)已有大量報(bào)道,如高硫酸化K5大腸桿菌多糖衍生物[2]、硫酸乙酰肝素[3]和各種材料制備的納米制劑[4]等,這些物質(zhì)主要通過與病毒表面的黏附蛋白配基(viral attachment ligands,VALs)發(fā)生強(qiáng)烈的結(jié)合而阻止病毒感染細(xì)胞.在自然界也存在一些天然物質(zhì)(如肝素)能模擬細(xì)胞膜對(duì)應(yīng)受體的構(gòu)像(mimicking heparan sulfate proteoglycans,MHSP),與病毒外殼的VALs形成穩(wěn)定結(jié)合從而屏蔽病毒進(jìn)入細(xì)胞.科研人員也努力嘗試將MHSP連接到不同的納米載體上以獲得與各種病毒結(jié)合力更強(qiáng)且病毒滅活效果更高的廣譜抗病毒滅活劑[5].

盡管傳統(tǒng)的中醫(yī)藥中沒有特效殺滅病毒的單味藥或復(fù)方,但不可否認(rèn)的是中醫(yī)藥已對(duì)某些病毒性疾病的治療,如獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)、病毒性感冒、蕁麻疹和乙型病毒性肝炎,顯示出了一定的優(yōu)勢(shì)[6].已有報(bào)道中藥植物多酚類物質(zhì)具有強(qiáng)大的抗病毒活性[7],而多糖類擁有抗病毒的活性早已為人所知[8].

肉桂及其所含的成分具有多方面的藥理作用,包括降血糖[9-10]、抗氧化[11]、抗腫瘤[12]、抗炎[13]和神經(jīng)保護(hù)[14]等作用.近期有研究報(bào)道肉桂用于預(yù)防和治療病毒感染,周明等[15]的研究顯示肉桂中的桂皮醛具有抗病毒活性,美國(guó)?？怂菇】敌侣剤?bào)道Milton Schiffenbauer博士團(tuán)隊(duì)在家養(yǎng)肉桂植物中發(fā)現(xiàn)抗病毒活性成分[16],以色列特拉維夫大學(xué)在中國(guó)專利局公開了1項(xiàng)與肉桂提取物抗病毒相關(guān)的專利[17].本研究組也使用不同的病毒細(xì)胞感染模型對(duì)肉桂抗病毒有效組分進(jìn)行了系統(tǒng)分析,已證明肉桂水提物KPC-rg1在細(xì)胞水平可以對(duì)包括單純皰疹(HSV-1)病毒[18]和人類免疫缺陷(human immunodeficiency virus,HIV)病毒在內(nèi)的多種包膜病毒產(chǎn)生有效的攻擊.

為了進(jìn)一步研究肉桂提取物KPC-rg1對(duì)H1N1流感病毒的抗病毒活性,本研究使用小鼠適應(yīng)型H1N1流感病毒進(jìn)行動(dòng)物攻毒感染實(shí)驗(yàn),研究KPC-rg1對(duì)在抗H1N1流感病毒的抗病毒活性,以為其進(jìn)一步研發(fā)成為新型病毒滅活材料提供理論支撐.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

小鼠適應(yīng)型H1N1流感病毒(A/Puerto Rico/8/1934)由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所呼吸道病毒研究室提供;Vero E6細(xì)胞株購(gòu)自美國(guó)模式菌種收集中心(ATCCCRL-1586);肉桂購(gòu)自滇芝堂中藥材經(jīng)營(yíng)部,經(jīng)鑒定為樟科植物肉桂的干燥樹皮;細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(Cell Counting Kit-8,CCK-8)購(gòu)自天津百螢生物科技有限公司;Gibco16010-078小牛血清購(gòu)自上海素冉生物科技有限公司;DMEM高糖完全培養(yǎng)基[含10%胎牛血清(FBS)]購(gòu)自上海雅吉生物科技有限公司,使用時(shí)稀釋為5%FBS的DMEM培養(yǎng)基;TRN zol A+試劑購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司;One Step Prime ScriptTMRT-PCR Kit購(gòu)自TAKARA Biotechnologies公司;分析純硫酸銅(CuSO4)購(gòu)自天津化學(xué)試劑三廠;分析純?nèi)然F(FeCl3)、氯化鉀(KCl)、磷酸二氫鈉(NaH2PO4)和磷酸氫二鈉(Na2HPO4)均購(gòu)自西隴化工股份有限公司;分析純鹽酸(HCl)購(gòu)自汕滇藥業(yè)有限公司;鼠用配合飼料購(gòu)自浙江科力飼料有限公司;0.1%新潔爾滅消毒液購(gòu)自江西草珊瑚消毒用品有限公司;0.5%過氧乙酸消毒液購(gòu)自福建維真園醫(yī)藥科技有限公司.實(shí)驗(yàn)所用水(H2O)均為蒸餾水.

使用美國(guó)Molecular Devices公司生產(chǎn)的Spectra Max 340 PC 384型酶標(biāo)儀進(jìn)行溶液吸光度的測(cè)定;使用丹佛儀器有限公司UB-7型pH計(jì)測(cè)量溶液pH;使用騰泉生命科技有限公司的Acumen eX3血細(xì)胞分析儀檢測(cè)小鼠血凝抑制效價(jià)(抗體水平);使用美國(guó)Life Technologies公司的ABI 7500 Real-Time PCR儀進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈(RT-PCR)反應(yīng);使用賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司的二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng);使用梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司的METTLER TOLEDO MS電子天平稱量試劑;使用賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司的Thermo Biofuge Stratos高速冷凍離心機(jī)進(jìn)行溶液的離心;使用江南光學(xué)儀器廠的XD-202型光學(xué)顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞觀察.

1.2 研究對(duì)象

雌性28～30日齡C57BL/6近交系小鼠由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供.將小鼠分為3組:健康空白組、對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組,每組8只.小鼠每日喂飼鼠用配合飼料,自由飲水,隔日更換墊料;動(dòng)物房控制溫度為(20.0±2.0)℃,相對(duì)濕度45.0% ～50.0%,換氣次數(shù)為每小時(shí)10～20次,氣流速度0.1～0.2 m/s,噪音≤60 dB,工作光照強(qiáng)度150～300 lx,明、暗照明交替時(shí)間為12 h;動(dòng)物房每周消毒2次,消毒劑以0.1%新潔爾滅和0.5%過氧乙酸交替使用.本研究涉及的動(dòng)物病毒攻擊(以下簡(jiǎn)稱攻毒)保護(hù)實(shí)驗(yàn)方案嚴(yán)格按國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物指南設(shè)計(jì),并得到中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(審批號(hào):2015-03).

1.3 KPC-rg1制備

將200.0 g肉桂干燥樹皮經(jīng)粉碎后置于10倍質(zhì)量的H2O(2.0 L)中20.0℃浸泡提取,濾液濃縮后加入 KCl至終濃度 0.5 mol/L并用 HCl調(diào)至pH 4.0,室溫靜置后取沉淀減壓干燥得KPC-rg1.取干燥至恒質(zhì)量的KPC-rg1樣品100.0 mg,以配制的磷酸緩沖鹽(PBS)溶液進(jìn)行溶解并定容至100.0 mL,得終質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL的KPC-rg1溶液;從中分別取20.0、12.5和2.5 mL放至25 mL的容量瓶中,以PBS溶液定容得KPC-rg1質(zhì)量濃度為0.80、0.50和0.10 mg/mL的溶液;再?gòu)馁|(zhì)量濃度為0.10 mg/mL的溶液中分別取5.0和1.0 mL放至10 mL的容量瓶中,以PBS緩沖液定容得KPC-rg1質(zhì)量濃度為0.01和0.05 mg/mL的溶液.

取干燥至恒質(zhì)量的KPC-rg1樣品800.0 mg,以PBS溶液進(jìn)行溶解并定容至100.0 mL,得終質(zhì)量濃度為8.00 mg/mL的KPC-rg1溶液備用.

1.4 KPC-rg1細(xì)胞不良反應(yīng)實(shí)驗(yàn)

取Vero細(xì)胞鋪96孔板,每孔鋪細(xì)胞液100.0 μL,在37.0℃、5.0%CO2培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng),至單層鋪滿后,于預(yù)設(shè)定的孔內(nèi)加入5.0 μL不同質(zhì)量濃度的KPC-rg1溶液使之形成藥物質(zhì)量濃度梯度,作為實(shí)驗(yàn)組;于預(yù)設(shè)定的孔內(nèi)加入 5.0 μL的PBS溶液作為對(duì)照組;于未接種細(xì)胞的孔內(nèi)加入等體積的培養(yǎng)液[DMEM培養(yǎng)基(5%FBS)100.0 μL]和溶劑(PBS 5.0 μL),作為空白組,即 KPC-rg1的質(zhì)量濃度為0.將96孔板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后,使用 CCK-8檢測(cè)不同質(zhì)量濃度下,入射光為570 nm時(shí)的吸光度(A)值,根據(jù)A值計(jì)算細(xì)胞存活率(P),公式如下[19]:

P=[(A2-A1)/(A0-A1)]×100%,

式中A0、A1和A2分別是空白組、對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的吸光度.

1.5 H1N1流感病毒溶液制備

將H1N1流感病毒稀釋液混合到經(jīng)復(fù)蘇傳代的Vero細(xì)胞懸液中,共同孵育進(jìn)行流感病毒的繁殖并收集[20].使用PBS溶液將H1N1流感病毒原溶液稀釋至預(yù)定的滴度(29 HAU/50.0 μL)備用.

1.6 H1N1流感病毒攻毒實(shí)驗(yàn)

健康空白組:每只小鼠左鼻內(nèi)接種 50.0 μL PBS緩沖液;對(duì)照組:取24.4 μL病毒稀釋液,加入25.6 μL PBS 溶液,得到250 HAU/50.0 μL 的 H1N1流感病毒溶液,每只小鼠左鼻內(nèi)接種50.0 μL H1N1流感病毒溶液;實(shí)驗(yàn)組:取24.4 μL病毒稀釋液加入12.5 μL的8.0 mg/mL KPC-rg1 溶液,再加 13.1 μL PBS緩沖液,37.0℃、5.0%CO2培養(yǎng)箱中溫育5～10 min,得到250 HAU/50.0 μL的H1N1流感病毒+2.0 mg/mL的KPC-rg1混合稀釋液,每只小鼠左鼻內(nèi)接種50.0 μL混合溶液.接種過程中不麻醉.

1.7 小鼠體質(zhì)量變化及存活率

觀察并記錄小鼠28 d體質(zhì)量變化和存活情況.體質(zhì)量增長(zhǎng)指數(shù)(w)為從實(shí)驗(yàn)開始之日起每隔2～3 d對(duì)每只小鼠進(jìn)行精確稱體質(zhì)量(mi)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束或動(dòng)物死亡.小鼠的w和存活率(r)計(jì)算公式如下:

w=mi/m0,

r=(ni/n0)×100%,

式中m0為首次體質(zhì)量,ni為第i天存活只數(shù),n0為起始只數(shù).

1.8 小鼠血凝抑制效價(jià)(抗體水平)

本研究使用Hirst[21]的方法確定小鼠左鼻接種后抗H1N1流感病毒抗體產(chǎn)生情況,即使用已知病毒來(lái)檢查被檢血清中的相應(yīng)抗體和滴定抗體的含量.在培養(yǎng)28 d后,采集眼球血清,每只小鼠采血0.2～0.3 mL,根據(jù)國(guó)家流感中心標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行紅細(xì)胞凝集抑制實(shí)驗(yàn)(HI),檢測(cè)小鼠血清中針對(duì)H1N1流感病毒的 HI效價(jià)[22].血凝抑制結(jié)果≥20 HAU為陽(yáng)性有效HI效價(jià).

1.9 小鼠肺部病毒載量檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)各設(shè)平行組,給藥第3和28天,處死平行組中的任何一組,獲取小鼠的肺,研磨制備勻漿后利用TRN zol A+試劑提取總RNA.利用紫外-可見分光光度計(jì)進(jìn)行定量測(cè)定樣品RNA濃度.每100 ng總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA并進(jìn)行RT-PCR定量檢測(cè)病毒載量.檢測(cè)引物針對(duì)H1N1流感病毒M基因編碼區(qū)進(jìn)行設(shè)定,序列如下:

FluA-F GACCAATCCTGTCACCTCTGAC,

FluA-R AGGGCATTTTGGACAAAGCGTCTA,

Flu-probe(FAM)-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-(BHQ1).

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 KPC-rg1細(xì)胞不良反應(yīng)實(shí)驗(yàn)

當(dāng) KPC-rg1溶液質(zhì)量濃度為 0.01、0.05、0.08、0.10、0.50、0.80 和 1.00 mg/mL 時(shí),Vero細(xì)胞存活率分別是 89.3%、84.1%、82.7%、78.4%、26.9%、20.6%和19.2%.即細(xì)胞培養(yǎng)48 h后,與 KPC-rg1質(zhì)量濃度為 0相比,0.50、0.80和 1.00 mg/mL時(shí)Vero細(xì)胞的存活率明顯低于 100%(t=0.017、0.048和 0.025,P＜0.05);而質(zhì)量濃度為 0.01、0.05、0.08和0.10 mg/mL時(shí),KPC-rg1對(duì) Vero細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)明顯的不良反應(yīng)(P＞0.05).因此,將KPC-rg1質(zhì)量濃度為0.10 mg/mL作為本實(shí)驗(yàn)小鼠攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)時(shí)劑量設(shè)計(jì)的基礎(chǔ).

2.2 小鼠存活率和體質(zhì)量變化

H1N1流感病毒攻毒后,各組小鼠的w和r變化情況如圖1所示.健康空白組小鼠無(wú)死亡現(xiàn)象,小鼠平均體質(zhì)量隨喂養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)有一定的增長(zhǎng)(23.5～26.8 g);對(duì)照組小鼠接受攻毒后,在第3天出現(xiàn)死亡,第3～5天,小鼠體質(zhì)量急劇下降(14.5～18.9 g),至第 7天僅存活 3只,即r=37.5%;第6天開始,存活小鼠體質(zhì)量也有一定的增長(zhǎng)(15.8～29.3 g);實(shí)驗(yàn)組小鼠無(wú)死亡現(xiàn)象,小鼠接受攻毒后2 d內(nèi)平均體質(zhì)量略微下降(20.2～20.5 g),之后恢復(fù)到正常增長(zhǎng)水平,且喂養(yǎng)第10天后小鼠平均體質(zhì)量略高于健康空白組(27.3～30.6 g);對(duì)各組小鼠最終平均體質(zhì)量進(jìn)行組間t檢驗(yàn)比較,各組之間平均體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),說(shuō)明小鼠自身免疫抵抗及KPC-rg1預(yù)防H1N1流感病毒對(duì)存活小鼠最終體質(zhì)量不會(huì)產(chǎn)生顯著性影響.通過小鼠體質(zhì)量變化和生存率結(jié)果推測(cè)KPC-rg1可以在短時(shí)間內(nèi),即病毒與 KPC-rg1混合溫育的過程中(5～10 min)將H1N1流感病毒滅活,起到預(yù)防H1N1流感病毒的作用.

3組小鼠接受攻毒后第15天鼻部變化如圖2所示,健康空白組和實(shí)驗(yàn)組小鼠均未出現(xiàn)鼻毛脫落的現(xiàn)象,而對(duì)照組存活小鼠鼻毛出現(xiàn)嚴(yán)重的脫落現(xiàn)象,脫落面積約20.0% ～33.3%.

圖1 H1N1攻毒后各組小鼠基本情況

圖2 小鼠接種后第15天鼻部變化

2.3 小鼠血凝抑制效價(jià)(抗體水平)檢測(cè)

小鼠攻毒后28 d,對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中均檢測(cè)出高滴度的血凝抑制效價(jià),2組HI效價(jià)均為128 HAU,表明H1N1流感病毒對(duì)小鼠的攻擊使小鼠免疫系統(tǒng)產(chǎn)生了相應(yīng)抗體和保護(hù)性.對(duì)照組存活動(dòng)物血清出現(xiàn)高滴度的血凝抑制效價(jià)屬于天然免疫所致,而實(shí)驗(yàn)組小鼠的血凝抑制效價(jià)特征則屬于人工免疫的結(jié)果.這提示 KPC-rg1與 H1N1流感病毒的接觸使病毒失去攻擊活性,還有可能保留了病毒完整的中和免疫原性.

2.4 小鼠肺部病毒載量檢測(cè)

對(duì)攻毒3 d后的小鼠肺組織進(jìn)行病毒載毒量分析,對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠肺部病毒載量均達(dá)到1×107copies/50 mg(1 IU≈5.6 copies)肺組織,表明攻毒后小鼠肺部受到嚴(yán)重感染.在第28天對(duì)19只存活小鼠的肺組織進(jìn)行載毒量分析,在肺組織沒有發(fā)現(xiàn)殘留病毒,表明體內(nèi)病毒已被小鼠免疫系統(tǒng)有效清除.

綜上所述,通過鼻黏膜點(diǎn)樣感染H1N1流感病毒的小鼠均發(fā)生了肺部感染,對(duì)照組小鼠在攻毒后7 d內(nèi)死亡率為62.5%,存活的3只小鼠在感染后第15天出現(xiàn)了嚴(yán)重的鼻毛脫落癥狀;而實(shí)驗(yàn)組在攻毒后2 d出現(xiàn)體質(zhì)量不增長(zhǎng)或降低現(xiàn)象,但7 d后恢復(fù)正常增長(zhǎng)狀態(tài),動(dòng)物的r=100%,且沒有出現(xiàn)鼻毛脫落現(xiàn)象.針對(duì)H1N1流感病毒的血凝抑制實(shí)驗(yàn)及肺部病毒載量分析結(jié)果表明,實(shí)驗(yàn)組小鼠在攻毒后產(chǎn)生了強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答反應(yīng),使機(jī)體產(chǎn)生高滴度的抗病毒抗體,這可能是小鼠清除病毒的關(guān)鍵機(jī)制.本研究數(shù)據(jù)提示 KPC-rg1對(duì) H1N1流感病毒有一定的滅活作用,可用于抗淺表皮病毒感染用藥研制,這也為下一步探索KPC-rg1處理后病毒中和抗原的完整性以及可能的病毒滅活疫苗的制備研究打下基礎(chǔ).

3 結(jié)束語(yǔ)

本研究顯示KPC-rg1對(duì)H1N1流感病毒的滅活作用不但強(qiáng)大,而且推測(cè)可以在短時(shí)間內(nèi)(室溫下溫育5 min)即可達(dá)到病毒的完全失活效果,對(duì)小鼠有顯著的保護(hù)預(yù)防作用;被滅活的病毒保留了完整的抗原性,形成了“原位固化滅活”效應(yīng);KPC-rg1可促使小鼠產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答反應(yīng),使機(jī)體產(chǎn)生高滴度的抗病毒抗體.

除此之外,本研究組還開展了 KPC-rg1對(duì)H3N2流感病毒、單純皰疹(HSV-1)病毒、人巨細(xì)胞(HCMV)病毒和HIV病毒等也有顯著的滅活作用研究,研究結(jié)果證明KPC-rg1具有相當(dāng)廣譜的抗病毒作用[18].

鑒于KPC-rg1具有的快速、強(qiáng)大和廣譜的病毒滅活作用特點(diǎn),對(duì)KPC-rg1進(jìn)一步研發(fā)極有可能使其發(fā)展成為制備包括流感病毒在內(nèi)的多種病毒滅活疫苗制備所必須的新型病毒滅活材料,也可用于治療各種包膜類病毒感染的皮膚類用藥的研制.

致謝：感謝中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所李琦涵、劉龍丁和陳元鼎3位教授對(duì)本研究進(jìn)行的指導(dǎo).