北京松山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)有毒大型真菌物種多樣性研究?

吳記貴 周 昊 侯成林

(1.北京松山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理處,北京 102115;2.首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,北京 100048)

0 引 言

大型真菌(Macrofungi)泛指一類子實(shí)體較大的真菌,也被稱為蕈菌,屬于真菌界,是一類在資源開發(fā)應(yīng)用方面被廣泛關(guān)注的一類真菌[1].早在我國(guó)古代著作中,就有對(duì)部分大型真菌鑒定、食用和栽培等方面的記載.如多部古代著作中有多種靈芝的記載,有將塊菌(Tuber)稱為麥蕈,將食用木耳稱為桑耳等[2].

大型真菌在生態(tài)系統(tǒng)中扮演重要的角色,而有毒大型真菌(簡(jiǎn)稱毒菌)是一類含有毒素物質(zhì)的真菌.在我國(guó),毒菌所引起的中毒類型主要包含肝損害型、胃腸炎型、神經(jīng)精神型、溶血性型、呼吸循環(huán)衰竭型和光過敏皮炎型[3].近年來,隨著生活水平的提高,人們采食野生蘑菇的需求增加,隨之而來的有關(guān)采食毒菌中毒事件的報(bào)道也不斷增加,對(duì)毒菌的生物毒素的研究以及毒菌資源在醫(yī)藥上的開發(fā)與利用引起了大家的廣泛關(guān)注.據(jù)筆者調(diào)研,北京周邊大型真菌的相關(guān)研究仍較少,僅有蔡懷頫等[4]和盧維來等[5]對(duì)北京周邊區(qū)域進(jìn)行了大型真菌調(diào)查,這些調(diào)查的主要目的是為統(tǒng)計(jì)區(qū)域內(nèi)大型真菌種類和分布,列出相應(yīng)物種名錄或優(yōu)勢(shì)大型真菌的科、屬,為之后的研究提供了相關(guān)數(shù)據(jù)參考,但并未對(duì)詳細(xì)資源真菌進(jìn)行具體的分析和描述.

2017—2018年本研究對(duì)北京松山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)有毒大型真菌進(jìn)行了調(diào)查和標(biāo)本采集,并采用形態(tài)學(xué)結(jié)合分子分析對(duì)采集的標(biāo)本進(jìn)行鑒定.

1 基本情況

北京松山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)成立于1985年,位于北京市延慶區(qū)境內(nèi),地處燕山山脈的軍都山中,西臨河北省張家口市懷來縣,北接河北省張家口市赤城縣,東、南與張山營(yíng)鎮(zhèn)佛峪口、南水峪等村相鄰,距市區(qū)約 80 km,地理坐標(biāo)為 115°43′44″～115°52′38″E,40°29′05″～ 40°35′40″N,保護(hù)區(qū)總面積為6 212.96 hm2.

保護(hù)區(qū)內(nèi)年平均溫度8.5℃,累積降水量493 mm,屬暖溫帶大陸性季風(fēng)氣候.保存有華北地區(qū)唯一的大片天然次生油松(Pinus tabuliformisCarr.)林以及由樺木(Betulaspp.)、椴樹(Tilia tuanSzyszyl.)、榆樹(Ulmus pumilaL.)和核桃楸(Juglans mandshuricaMaxim.)等構(gòu)成的天然次生闊葉林[6],各大主溝常年溪水潺潺,營(yíng)造了復(fù)雜的野生動(dòng)植物天然棲息地,致使該地生物多樣性較高.特別是近年封山育林效果明顯,極大地改善了野生動(dòng)植物的棲息環(huán)境,也為大型真菌的繁衍創(chuàng)造了條件.

2 材料與方法

2.1 調(diào)查與標(biāo)本采集

結(jié)合大型真菌的生長(zhǎng)特點(diǎn),調(diào)查選擇在每年8—9月有連續(xù)降雨天氣后進(jìn)行.調(diào)查過程采取樣線法和踏查法相結(jié)合的方法.對(duì)調(diào)查中遇到的大型真菌單獨(dú)編號(hào),記錄生長(zhǎng)環(huán)境、特征和營(yíng)養(yǎng)類型等詳細(xì)信息.采集大型真菌個(gè)體,通過烘干制成標(biāo)本,用于后期DNA提取和鑒定,標(biāo)本保存在首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院標(biāo)本館(BJTC).

2.2 標(biāo)本鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

有毒大型真菌標(biāo)本通過形態(tài)特征與已知文獻(xiàn)[1,7-9]對(duì)比進(jìn)行初步鑒定.通過標(biāo)本和野外拍攝的圖片觀察宏觀特征,包括大小、顏色、形態(tài)特征和氣味等;在日本奧林巴斯株式會(huì)社生產(chǎn)的 BX51型光學(xué)顯微鏡下觀察微觀特征,包括擔(dān)子、子囊、菌絲和孢子大小等.

2.2.2 分子鑒定

(1)DNA提取.對(duì)形態(tài)學(xué)鑒定一致的標(biāo)本,選取代表性標(biāo)本進(jìn)行DNA提取,DNA提取采用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法.首先,向研磨充分的樣品中加入預(yù)熱好的提取緩沖液,70℃金屬浴30 min;再向樣品中加入500.0 μL的氯仿與異戊醇混合液(體積比為24∶1),迅速混勻,10 000 r/min離心5 min,離心半徑9 cm(離心半徑下文相同);收集上層水相轉(zhuǎn)移到新離心管中,加入2倍體積的無(wú)水乙醇為沉淀緩沖液,混勻,13 000 r/min離心15 min,收集沉淀;將沉淀物溶于350.0 μL濃度為2 mol/L氯化鈉(NaCl)溶液中,加入RNA酶5.0 μL,37 ℃酶解 1 h,之后加入 350.0 μL氯仿與異戊醇混合液,混勻,室溫 10 000 r/min離心5 min;吸取上清液到新的離心管中,加入提前-20℃ 預(yù)冷的 180.0 μL異戊醇中,混勻,在-20℃ 保存15 min,取出后在4℃ 13 000 r/min條件下離心20 min,收集沉淀;將最終沉淀物懸浮于1.0 mL的體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇溶液中,在4℃13 000 r/min條件下離心3 min,收集沉淀,并重復(fù)該步驟1次并洗脫;收集DNA沉淀,干燥后溶于TE緩沖液或無(wú)菌去離子水中,-20℃保存[10].

其中主要溶液的配制如下:①1 mol/L三羥甲基氨基甲烷(Tris)-鹽酸(HCl)緩沖液:每100.0 mL溶液中加入 Tris堿12.1 g,用濃 HCl調(diào)節(jié)到pH 8.0,加蒸餾水定容到 100.0 mL,高壓滅菌.②0.5 mol/L乙二胺四乙酸(EDTA)溶液:在400.0 mL蒸餾水中加入90.0 g二水乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na2H2O),攪拌溶解,用氫氧化鈉(NaOH)調(diào)節(jié)到pH 8.0,加蒸餾水定容到500.0 mL,高壓滅菌.③2 mol/L NaCl溶液:116.9 g NaCl溶于蒸餾水中,定容到1.0 L,高壓滅菌.④提取緩沖液:在70.0 mL蒸餾水中加入 CTAB 4.0 g、NaCl 16.4 g、 1 mol/L Tris-HCl(pH 8.0) 20.0 mL、0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)8.0 mL,溶解后定容至200.0 mL,高壓滅菌.⑤TE緩沖液:在400.0 mL蒸餾水中加入1 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)5.0 mL、0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)1.0 mL,定容至500.0 mL后高壓滅菌.

(2)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增.PCR反應(yīng)體系:DNA模板2.0 μL,上下引物各 1.0 μL,PCR反應(yīng)混合物(Mix)12.5 μL,無(wú)菌二次蒸餾水8.5 μL,引物選用核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)域(internal transcribed spacer,ITS)的ITS 1F和ITS 4對(duì)提取的DNA進(jìn)行擴(kuò)增.PCR反應(yīng)條件為:95℃ 5 min,之后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)重復(fù)反應(yīng)(95℃30 s;55℃30 s;72℃60 s),最后72℃10 min[11].PCR產(chǎn)物送北京中科希林生物科技有限責(zé)任公司進(jìn)行測(cè)序.

(3)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的序列來自于采集標(biāo)本擴(kuò)增得到的ITS序列和從國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)網(wǎng)站下載得到的相關(guān)物種最近發(fā)表的可靠的 ITS序列.采用 Mafft v.6軟件(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/mafft/)對(duì)全部序列進(jìn)行多序列比對(duì)[12],采用Gblocks 0.91b對(duì)序列進(jìn)行調(diào)整剪切,處理完成的序列采用MrBayes v.3.1.2進(jìn)行貝葉斯分析,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[13].采用馬爾可夫鏈蒙特卡羅(markov chain monte carlo,MCMC)算法進(jìn)行貝葉斯推理(bayesian inference,BI)分析[14],MrModeltest v.2.3被用來估計(jì)最佳模型.2個(gè)MCMC鏈從隨機(jī)樹中運(yùn)行了10 000 000代,當(dāng)分裂頻率的平均標(biāo)準(zhǔn)偏差降至0.01以下時(shí)停止,樹每1 000代保存1次.每次分析的前25%的樹被丟棄.在剩下的樹中估計(jì)具有顯著貝葉斯后驗(yàn)概率(bayesian posterior probabilities,BPP)的分支[15].

3 結(jié) 果

3.1 基本概況

2017—2018年間,本研究在北京松山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)內(nèi)共開展了3次大型真菌多樣性調(diào)查,共采集標(biāo)本200余份.結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子數(shù)據(jù)鑒定結(jié)果,參考 Wu等[16]對(duì)中國(guó)可食用、藥用和有毒大型真菌資源的統(tǒng)計(jì),保護(hù)區(qū)內(nèi)采集得到的大型真菌中含有毒菌17種,隸屬于4目12科13屬,詳細(xì)名錄列于表1.

表1 北京松山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)有毒大型真菌名錄

3.2 ITS系統(tǒng)發(fā)育樹

對(duì)保護(hù)區(qū)有毒大型真菌采用貝葉斯分析構(gòu)建的ITS系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1所示.其中子囊菌中的皺馬鞍菌(Helvella crispaBull)、擬展馬鞍菌(Helvella pseudoreflexaQ Zhao,Zhu L Yang&K D Hyde)與其他的擔(dān)子菌分成了明顯2支.同時(shí)標(biāo)本自測(cè)序列與下載序列在系統(tǒng)發(fā)育上的關(guān)系,也為本研究的物種鑒定提供了較好的支持.

3.3 常見毒菌及致毒類型

注:數(shù)字代表貝葉斯分析的后驗(yàn)概率;黑色字體物種表示從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載的序列+GenBank登錄號(hào);紅色字體物種表示保護(hù)區(qū)內(nèi)采集的標(biāo)本序列+采集標(biāo)本號(hào);ITS.核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)域.圖1 北京松山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)有毒大型真菌ITS系統(tǒng)發(fā)育樹

綜合野外調(diào)查和采集標(biāo)本記錄,北京松山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)常見有毒真菌有6種(圖2),分別是輪紋乳菇[Lactarius zonarius(Bull)Fr]、光硬皮馬勃[Scleroderma cepaPers]、落葉杯傘[Clitocybe phyllophila(Pers)P Kumm.]、點(diǎn)柄乳牛肝菌[Suillus granulatus(L)Roussel]、黃蓋小脆柄菇[Psathyrella candolleana(Fr)Maire]和潔小菇[Mycena pura(Pers)P Kumm].結(jié)合陳作紅[17]的研究,能確定部分北京松山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)有毒真菌致毒類型.如:半毛蓋絲膜菌[Cortinarius hemitrichus(Pers)Fr]會(huì)致急性腎衰竭型中毒,該菌含有奧萊毒素物質(zhì),發(fā)病潛伏期較長(zhǎng),誤食后易出現(xiàn)腹痛、嘔吐、腹瀉、少尿及肝轉(zhuǎn)氨酶上升的癥狀;東方黃蓋鵝膏[Amanita orientigemmataZhuL Yang& Yoshim Doi]、落葉杯傘、潔小菇、桔黃裸傘[Gymnopilus spectabilis(Fr)Singer]等會(huì)致神經(jīng)精神型中毒,該類菌含有毒蕈堿、異惡唑衍生物等有毒物質(zhì),誤食后發(fā)病快,多出現(xiàn)眩暈、興奮、惡心和嘔吐等癥狀;導(dǎo)致胃腸炎型中毒的毒菌有黑耳[Exidia glandulosa(Bull)Fr]、輪紋乳菇[Lactarius zonarius(Bull)F]、光硬皮馬勃和點(diǎn)柄乳牛肝菌等,誤食后發(fā)病快,癥狀以腹瀉、腹痛、惡心和嘔吐為主.經(jīng)過調(diào)查,在松山附近區(qū)域的市場(chǎng)上,點(diǎn)柄乳牛肝菌也是一種較為常見的食用野生菌.該菌由于部分有毒,在食用前只要充分加熱至熟,食用后并不會(huì)產(chǎn)生中毒癥狀[7].但并不是所有有毒真菌加熱至熟后毒性都會(huì)消失,建議大家在野外不要擅自采集食用野生菌.

4 討 論

北京松山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)成立于1985年,1986年經(jīng)國(guó)務(wù)院批準(zhǔn)為森林和野生動(dòng)物類型的國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū),2014年保護(hù)區(qū)進(jìn)行了范圍和功能區(qū)調(diào)整,同時(shí)對(duì)保護(hù)區(qū)各功能區(qū)域嚴(yán)格劃分,保護(hù)區(qū)的重要保護(hù)對(duì)象天然油松林、落葉闊葉次生林和其他野生動(dòng)植物資源主要分布在核心區(qū)內(nèi),保護(hù)區(qū)核心區(qū)實(shí)行絕對(duì)保護(hù)、封閉管理和禁止采伐等一切破壞活動(dòng).與此同時(shí),有嚴(yán)格的管理制度和完善的管理團(tuán)隊(duì).這些因素都為大型真菌發(fā)生提供了良好的條件.

蔡懷頫等[4]2003年對(duì)北京松山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)進(jìn)行了一次大型真菌調(diào)查,共鑒定大型真菌31種,其中包含有毒真菌6種,分別是冠狀環(huán)柄菇[Lepiota cristata(Bolt:Fr)Quel]、花蓋小脆柄菇[Psathyrella multipedata(Imai)Hongo]、覆瓦網(wǎng)路菌[Paxillus curtisiiBerk]、白乳菇[Lactarius plperatus(L:F)Gray]、中華散尾鬼筆[Lysuras mokusinfsinensis(lioyd)Kobnyasi]和苦粉泡牛肝菌[Tylopilus felleus(Bull:Fr)Karst].本研究此次調(diào)查的17種有毒真菌并沒有與之前的記錄重復(fù),故隨著在北京松山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)內(nèi)調(diào)查的深入,還有可能發(fā)現(xiàn)和記錄更多的有毒真菌.

以前大眾對(duì)大型真菌資源關(guān)注度較低,同時(shí)對(duì)松山及周邊區(qū)域大型真菌的調(diào)查研究較為缺乏[5],詳細(xì)描述有毒真菌的文獻(xiàn)較少.保護(hù)區(qū)內(nèi)對(duì)生物多樣性的保護(hù)監(jiān)管也未涉及大型真菌類群.此次針對(duì)北京松山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)內(nèi)有毒真菌的研究,既符合當(dāng)前對(duì)真菌資源關(guān)注的背景,也增加了保護(hù)區(qū)生物數(shù)據(jù)的多樣性和豐富性,對(duì)保護(hù)區(qū)內(nèi)生物多樣性保護(hù)和管理,也提出了新的關(guān)注點(diǎn)、理念和要求.

目前,隨著人們生活水平的不斷提高,對(duì)可食用野生菌資源的需求在不斷增加,大型真菌資源受到了前所未有的關(guān)注.與此同時(shí),云南、廣東、貴州和浙江等地因采食野生菌導(dǎo)致中毒致死事件頻頻發(fā)生,相關(guān)研究也在逐步深入[17-21],這使得了解調(diào)查毒菌的意義也更為重要.北京松山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)目前處于封閉管理狀態(tài),待后期開放,會(huì)迎接大量游客參觀游覽.為避免隨意采集并誤食有毒真菌的意外事件發(fā)生,本研究通過調(diào)查摸清保護(hù)區(qū)內(nèi)有毒真菌的種類和分布,為保護(hù)區(qū)管理處對(duì)游客提前進(jìn)行相關(guān)教育和警示,以及保護(hù)區(qū)工作人員管理和科普宣教上有十分重要的意義.