高靈敏瑞利光散射法測定藥物及人血中美司那

何樹華，劉曉紅，周清清，江 虹

(長江師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，長江師范學(xué)院武陵山片區(qū)綠色發(fā)展協(xié)同創(chuàng)新中心，重慶 408100)

美司那又名α-巰基乙基磺酸鈉鹽，為抗腫瘤類輔助藥，對(duì)泌尿系統(tǒng)有特殊的保護(hù)作用。由于美司那結(jié)構(gòu)中巰基(-SH)的存在，可以預(yù)防人體進(jìn)行腫瘤化療時(shí)，所用高劑量環(huán)磷酰胺所引起的出血性膀胱炎等泌尿系統(tǒng)的上皮毒性，可以去除環(huán)磷酰胺或異環(huán)磷酰胺所產(chǎn)生的毒性物質(zhì)丙烯酸，且不干擾母體藥物對(duì)腫瘤的化療效果。但作為一種新型的抗毒劑，如用藥過量時(shí)，可能使患者出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉、過敏反應(yīng)，或誘發(fā)低血壓、心率加快，或肝轉(zhuǎn)氨酶升高等副作用。為了合理用藥，對(duì)美司那藥物中的含量進(jìn)行研究有著重要意義。

目前，國內(nèi)外對(duì)美司那的檢測方法研究很少，報(bào)道較多的方法是高效液相色譜法[1 - 7]，也偶見離子色譜法[8]、分光光度法[9 - 11]及電化學(xué)法[12]等的報(bào)道。高效液相色譜法除儀器偏貴不易普及外，還存在前處理煩瑣、費(fèi)時(shí)等不足。其它方法或靈敏度不夠高或選擇性欠佳或條件要求嚴(yán)格等。本工作采用高靈敏的瑞利光散射(RLS)技術(shù)，利用堿性艷藍(lán)B與美司那之間的靜電作用，建立了檢測美司那的簡便、快速、高靈敏的RLS新方法，尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。方法用于人體血液及藥物中美司那的測定，結(jié)果滿意。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

F-2500型熒光分光光度計(jì)(日本，日立公司)；pHS-3C型精密酸度計(jì)(上海虹益儀器儀表有限公司)。

美司那(Mesna，MSN；中國食品藥品檢定研究院)對(duì)照品溶液：164.2 mg/L(貯備液)，存于4 ℃冰箱；臨用時(shí)取貯備液配成1.642 mg/L工作液。堿性艷藍(lán)B(Basic Brilliant Blue B，BASB；上海源葉生物科技有限公司)溶液：1.0×10-4mol/L。B-R緩沖溶液：取適量0.04 mol/L H3PO4、H3BO3和HAc與適量0.2 mol/L NaOH溶液混合，用酸度計(jì)測定，配成pH=3.5～10.2的溶液。所有試劑均為分析純，水為二次蒸餾水。

樣品：不同廠家生產(chǎn)的美司那注射液(1#和2#，市售只見這種劑型的藥物)；人體血清(3#，長江師范學(xué)院校醫(yī)院提供)。

1.2 試樣溶液的制備

抽取1#和2#美司那注射液樣品各1支，內(nèi)容物分別置于1 000 mL容量瓶中，用水定容。準(zhǔn)確移取該液5.00 mL置于另一1 000 mL容量瓶中，用水定容，即制得1#和2#待測液。取3#血清樣品2.00 mL，加適量三氯乙酸，振搖，以4 000 r/min離心分離15 min，取上清液2.00 mL置于50 mL容量瓶中，用水定容，即為3#待測液。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

室溫下，準(zhǔn)確移取0～1.00 mL MSN標(biāo)準(zhǔn)工作液(或MSN試液)于10 mL比色管中，依次加入1.50 mL pH=9.25 B-R緩沖溶液和3.00 mL堿性艷藍(lán)B溶液，搖勻后，用水定容。靜置20 min，在熒光分光光度計(jì)上同步掃描瑞利光散射(RLS)光譜，測定最大RLS波長355 nm處體系和試劑空白的RLS強(qiáng)度IRLS及I0，再計(jì)算出ΔIRLS=IRLS-I0。

2 結(jié)果與討論

2.1 MSN-BASB的光譜特征

圖1為MSN、BASB及他們以靜電作用相結(jié)合的RLS光譜圖。可知，MSN自身幾乎無散射，BASB自身有較弱的RLS信號(hào)，若在BASB溶液中加入pH=9.25 B-R緩沖溶液，則RLS信號(hào)顯著增強(qiáng)(λmax=355 nm，IRLS=1 672)，在最大RLS峰的長波方向466 nm附近及555 nm處有相對(duì)較弱的散射峰。從圖可知，當(dāng)在BASB的堿性溶液中加入不同用量的MSN標(biāo)準(zhǔn)工作液后，由于BASB是一種陽離子染料，可與MSN結(jié)構(gòu)中的-SO3H以靜電引力作用結(jié)合成離子締合物，使體系的摩爾質(zhì)量增大，導(dǎo)致RLS增強(qiáng)，其增強(qiáng)強(qiáng)度ΔIRLS隨著MSN用量的增大逐淅增強(qiáng)，當(dāng)MSN處于一定濃度范圍內(nèi)時(shí)，其質(zhì)量濃度與ΔIRLS呈線性關(guān)系，可用于MSN的定量分析。實(shí)驗(yàn)選用靈敏度最高的355 nm波長作為測定波長。

圖1 MSN與BASB的RLS光譜Fig.1 RLS spectra of MSN and BASB1:0.164 mg/L MSN;2:3.00×10-5 mol/L BASB;3 - 8:0.0,0.0328,0.0657,0.0985,0.131,0.164 mg/L MSN-3.00×10-5 mol/L BASB;pH=9.25.

2.2 反應(yīng)條件的選擇

2.2.1 介質(zhì)、酸度及用量室溫下，取1.00 mL MSN標(biāo)準(zhǔn)工作液、2.00 mL BASB溶液，考察1.00 mL相同pH值的各緩沖溶液(HAc-NaAc、B-R、Tris-HCl)對(duì)MSN與BASB以靜電引力結(jié)合生成的締合物時(shí)ΔIRLS的影響。實(shí)驗(yàn)表明，使用B-R緩沖溶液時(shí)，RLS強(qiáng)度相對(duì)較大(ΔIRLS=788)，體系靈敏度較高，故選用B-R緩沖溶液作反應(yīng)介質(zhì)。相繼考察了不同pH值的B-R緩沖溶液對(duì)MSN與BASB以靜電引力結(jié)合生成的締合物的ΔIRLS的影響，見圖2。結(jié)果表明，在酸性范圍內(nèi)，締合物受酸度影響小，在堿性范圍內(nèi)，pH值的大小對(duì)締合物影響較大，最適酸度是pH=9.25。該條件下，體系的ΔIRLS相對(duì)最大，當(dāng)大于或小于pH=9.25時(shí)，體系靈敏度均有不同程度降低。考察pH=9.25 B-R緩沖溶液的用量對(duì)締合物ΔIRLS的影響時(shí)，實(shí)驗(yàn)表明，用量在1.50～2.50 mL范圍內(nèi)，ΔIRLS較大且基本不變。故實(shí)驗(yàn)選用pH=9.25 B-R緩沖溶液1.50 mL來控制反應(yīng)的酸度。

圖2 pH對(duì)ΔIRLS的影響Fig.2 Effect of buffer pH on ΔIRLSMSN:0.164 mg/L;BASB:2.0×10-5 mol/L.

2.2.2 BASB用量或濃度室溫下，取1.00 mL MSN標(biāo)準(zhǔn)工作液、1.50 mL pH=9.25 B-R緩沖溶液，考察0.50～4.00 mL BASB溶液對(duì)MSN與BASB以靜電引力結(jié)合生成的締合物的ΔIRLS的影響，見圖3。曲線表明，當(dāng)BASB的用量在2.80～3.20 mL范圍內(nèi)(或體系溶液中BASB的濃度在2.8×10-5～3.2×10-5mol/L范圍內(nèi))時(shí)，ΔIRLS相對(duì)較大，實(shí)驗(yàn)選用靈敏度最佳的BASB用量3.00 mL或體系溶液中最佳BASB濃度3.0×10-5mol/L。

圖3 BASB濃度對(duì)ΔIRLS的影響Fig.3 Effect of BASB concentration on ΔIRLSMSN:0.164 mg/L;B-R:pH=9.25,1.50 mL.

2.2.3 試劑加入順序室溫下，取1.00 mL MSN標(biāo)準(zhǔn)工作液及上述選定條件下的B-R緩沖溶液和BASB溶液，考察他們的加入順序?qū)SN與BASB以靜電引力結(jié)合生成的締合物的ΔIRLS的影響。實(shí)驗(yàn)表明，ΔIRLS相對(duì)最大的試劑加入順序?yàn)椋篗SN溶液、B-R緩沖溶液、BASB溶液。故實(shí)驗(yàn)選擇用最佳的試劑加入順序進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。

2.2.4 時(shí)間及穩(wěn)定性室溫下，取1.00 mL MSN標(biāo)準(zhǔn)工作液，在上述選定實(shí)驗(yàn)條件下，考察MSN與BASB的反應(yīng)時(shí)間對(duì)其以靜電引力結(jié)合生成的締合物的ΔIRLS的影響。實(shí)驗(yàn)表明，MSN與BASB的靜電相吸作用在20 min內(nèi)，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，ΔIRLS逐淅增大，20～80 min內(nèi)，ΔIRLS達(dá)最大且基本不變。由此說明，MSN與BASB的反應(yīng)在20 min內(nèi)可進(jìn)行完全，穩(wěn)定時(shí)間至少1 h。故實(shí)驗(yàn)選在20 min后進(jìn)行測定。

2.3 ΔIRLS與MSN的關(guān)系

分別取MSN標(biāo)準(zhǔn)工作液0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL于10 mL具塞比色管中，按選定的實(shí)驗(yàn)條件加入其它試劑溶液，再按1.3的方法測定標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的RLS增強(qiáng)強(qiáng)度ΔIRLS。以ΔIRLS為縱坐標(biāo)，MSN的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，作ΔIRLS-c標(biāo)準(zhǔn)曲線。MSN在0.005～0.16 mg/L范圍內(nèi)與ΔIRLS呈線性關(guān)系，線性方程為：ΔIRLS=-15.79+5372c，相關(guān)系數(shù)r=0.9993，檢出限為0.0046 mg/L。

2.4 共存物質(zhì)的影響

2.5 樣品測定

準(zhǔn)確移取1.2下的1#待測液0.30 mL、2#待測液0.20 mL、3#待測液1.00 mL，按1.3的測定方法配制溶液并同步掃描RLS光譜，各做6份平行測定。根據(jù)譜圖上RLS強(qiáng)度及回歸方程即可求出各待測液中MSN的含量，從而求得原始MSN樣品中MSN的含量。最后做3水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)，各水平做6份平行測定，依據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果即可判斷方法的準(zhǔn)確度和精密度。結(jié)果見表1。

表1 美司那樣品分析結(jié)果及回收試驗(yàn)(n=6)

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3 結(jié)論

用本文建立的瑞利光散射法測定美司那，簡便、快速并有高的靈敏度(4.8 ng/L)、準(zhǔn)確度(回收率為98.3%～102%)和精密度(RSD為1.8%～2.5%)，滿足痕量分析要求。樣品處理簡單、安全，所用儀器為普通熒光分光光度計(jì)易于普及，所用試劑為一般的分析純易于采購。本方法可用于市售MSN藥物及人體血液樣品中MSN的定量分析。