長(zhǎng)順綠殼蛋雞早期發(fā)育在酶作用下性逆轉(zhuǎn)研究

李興美,何 勇,李興芳,李志惠,程德元,侯曉琪

(1.貴州農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院,貴州貴陽(yáng) 551400；2.貴州師范學(xué)院,貴州貴陽(yáng) 550018；3.遵義市中醫(yī)院,貴州遵義 563000)

貴州長(zhǎng)順縣綠殼蛋雞具有優(yōu)良的蛋肉品質(zhì)和寶貴的遺傳資源（潘周雄等，2008）。2008年長(zhǎng)順縣綠殼雞蛋通過(guò)省無(wú)公害農(nóng)產(chǎn)品和產(chǎn)地認(rèn)證，2012年通過(guò)國(guó)家有機(jī)產(chǎn)品認(rèn)證，2014年獲得農(nóng)業(yè)部地理標(biāo)志認(rèn)證（孫鵑等，2014）。因此，長(zhǎng)順縣綠殼蛋雞是貴州長(zhǎng)順地區(qū)精準(zhǔn)脫貧攻堅(jiān)的重要發(fā)展產(chǎn)業(yè)，也是地方區(qū)域經(jīng)濟(jì)發(fā)展的支柱產(chǎn)業(yè)。

為了提高生產(chǎn)力，人們已在禽性別控制方面作了一定研究。1974—1979年馬焰（譯）對(duì)來(lái)航品系雞后代雌雄性別進(jìn)行研究，在未做任何處理的情況下，對(duì)不同后代雞性比的遺傳變異情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，在正常遺傳繁育中，雞的雌雄性比遺傳變異不顯著，公雞比例平均為50.9%，母雞比例平均為49.1%，雌雄遺傳性比比較平穩(wěn)（馬焰，1980）。因此，不可能選出某一優(yōu)勢(shì)性別作為繁育種用雞，但對(duì)雞性別的人工干預(yù)也有部分研究，如易治明和張志霞（1986）在雞性別控制研究方法中使用雌激素和雞睪丸勻漿制備的抗睪丸血清，用于人工干預(yù)孵化過(guò)程中雞胚性別，雖然最后獲得一定效果，但并不理想，雌性雞比例雖較高，但小雞孵化率極低，其效果并不顯著。張靜蓉和陳忠（2013）在雞性別決定與控制技術(shù)的研究進(jìn)展中闡明，雞的性別可能是由Z 染色體和W 染色體決定，但這只是一種假說(shuō)，最后具體實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證和生產(chǎn)驗(yàn)證也未見(jiàn)報(bào)道。雞的性別分化與生物調(diào)節(jié)劑相關(guān)，在雞胚性別分化期與芳香化酶表達(dá)高度相關(guān)，可能起活化芳香化酶轉(zhuǎn)錄作用，參與調(diào)節(jié)芳香化酶合成，對(duì)雌激素分泌進(jìn)行間接調(diào)節(jié)（GOVOROUN 等，2004）。CYP19A1（cytochrome P450 19A1）編碼合成芳香化酶，進(jìn)而合成雌激素，因鳥(niǎo)類發(fā)育受激素影響較大，故該基因是鳥(niǎo)類卵巢分化關(guān)鍵因子。其表達(dá)始于孵育后6.5 d，符合性腺?gòu)?qiáng)烈分化時(shí)期，用芳香化酶抑制劑處理性腺尚未分化的雌性雞胚（ZW），可誘導(dǎo)雌性向雄性的性反轉(zhuǎn)（ELBRECHT 和 SMITH，1992）。但利用芳香化酶抗體調(diào)節(jié)作用控制長(zhǎng)順綠殼蛋雞的性別分化還未見(jiàn)報(bào)道，因此，本文對(duì)此進(jìn)行深入研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 種蛋購(gòu)于貴州省綠殼蛋雞的發(fā)源地，即貴州省長(zhǎng)順縣鼓揚(yáng)鎮(zhèn)聯(lián)富綠殼蛋雞養(yǎng)殖合作社，購(gòu)買(mǎi)時(shí)間為2018年5月至2019年5月。

1.2 試劑及儀器 主要試劑：芳香化酶抗體50ul/瓶，稀釋液 Tris-HCl，pH=7.4，100 mL/瓶，高錳酸鉀、甲醛，均購(gòu)自上海博湖生物科技有限公司。

儀器設(shè)備：雙系統(tǒng)全自動(dòng)孵化機(jī)DZ47-63，1584 個(gè)，購(gòu)自山東省德州市德城區(qū)召鵬孵化設(shè)備廠

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 種蛋的選擇 一般選擇生產(chǎn)1 周之內(nèi)的新鮮蛋種蛋，清潔度、大小、蛋形、蛋殼顏色都符合種用要求。

1.3.2 孵化機(jī)的消毒 采用熏蒸消毒法，高錳酸鉀與甲醛按一定比例混合，高錳酸鉀的需要量為15 g/m3，甲醛的需要量為30 mL/m3，孵化機(jī)總空間體積為0.70 m3，高錳酸鉀為10.50 g，甲醛為21 mL，將兩者混合后放入孵化機(jī)中，然后將孵化機(jī)關(guān)閉，關(guān)好窗戶和門(mén)迅速離開(kāi)。待清毒30 min后打開(kāi)門(mén)、窗戶和孵化機(jī)，通風(fēng)換氣2.5 d，排凈孵化機(jī)中的甲醛氣體。

1.3.3 種蛋的消毒 采用噴霧法進(jìn)行種蛋消毒，配制0.1% 的新潔爾滅水溶液，取5% 新潔爾滅原液，加5 倍40℃的溫水，將配成液用噴霧器噴灑到種蛋表面5 min，晾干后送孵化機(jī)中入孵。

1.3.4 試劑的配制 芳香化酶抗體與稀釋液以1 ∶1000 的比例進(jìn)行稀釋。

1.3.5 芳香化酶的作用機(jī)理 芳香化酶是一種生物調(diào)節(jié)劑，可催化睪酮最左邊的一個(gè)不規(guī)則六圓環(huán)，使最左邊的雙鍵打開(kāi)，其結(jié)構(gòu)變?yōu)閹в幸粋€(gè)羥基的苯環(huán)，即睪酮轉(zhuǎn)變?yōu)榇贫?。（如圖1 所示）

1.4 試驗(yàn)的過(guò)程

1.4.1 受精蛋的處理 將孵化第 4、5、6、7 天的種蛋進(jìn)行照蛋，受精率約為81%，選擇發(fā)育良好的受精蛋，然后進(jìn)行兩種處理。

1.4.2 胚內(nèi)處理法 孵化至第4 天照蛋，選出血管發(fā)育良好的胚蛋，分別對(duì)孵化第 4、5、6、7 天的胚蛋進(jìn)行處理，即在尿囊區(qū)避開(kāi)大血管處打一小孔，注入已稀釋好的芳香化酶抗體稀釋液，注入劑量分別為 0.05、0.10、0.15、0.20 mL，每天每劑量注入胚蛋為80 個(gè)，最后再用蠟液化封住小孔，再返回孵化機(jī)繼續(xù)孵化。

1.4.3 胚外處理法 孵化至第4 天照蛋，選出血管發(fā)育良好的胚蛋，分別對(duì)孵化第 4、5、6、7 天的胚蛋進(jìn)行處理，將預(yù)先準(zhǔn)備好的消毒棉固定在胚蛋外面，再將已配制好芳香化酶抗體稀釋液注射到蛋外消毒棉中，以保證稀釋液能較好的浸入胚中，注入劑量分別為 0.05、0.10、0.15、0.20 mL，每天每劑量注入80 個(gè)受精蛋，最后再返回孵化機(jī)繼續(xù)孵化。

1.4.4 孵化條件 溫度為37.80℃，濕度為60%左右，最后3 d 濕度為75% 左右。

1.5 統(tǒng)計(jì)與分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS22.0 軟件進(jìn)行處理，并進(jìn)行多重比較，對(duì)不同處理之間的差異性進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 胚內(nèi)處理結(jié)果

2.1.1 成活率的分析 由表1 可知，胚內(nèi)注射芳香化酶抗體稀釋液，孵化后小雞成活率較低，平均成活率只有9.06%，死亡率高達(dá)90.94%。其中成活率最高為17.50%，最低為5.00%。通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，不同劑量處理之間的F=0.39，差異性不顯著（P＞0.05），表明各處理組對(duì)小雞的成活率影響不明顯；總體分析表明，不同日齡處理之間F=8.72，差異顯著（P＜ 0.05），但第 4、5、7 天之間差異性不顯著。

2.1.2 雌雄雞性比的分析 由表2 可知，通過(guò)胚內(nèi)處理后，孵化成活雛雞中母雞比例較高，平均高達(dá)92.80%，公雞所占比例平均為7.20%。其中，母雞最高達(dá)到100%，最低為71.40%。通過(guò)方差分析，不同劑量處理之間的F=0.13，差異性不顯著（P＞0.05），表明不同劑量對(duì)母雞百分比效果不明顯；不同日齡處理之間的F=0.82，差異性不顯著（P＞0.05），表明不同日齡處理對(duì)母雞百分比效果不顯著。

表1 不同日齡不同劑量胚內(nèi)處理對(duì)雛雞成活率的影響

表2 不同日齡不同劑量胚內(nèi)處理對(duì)性別比的影響

2.2 胚外處理結(jié)果

2.2.1 成活率的分析 由表3 可知，采用胚外注射芳香化酶的抗體稀釋液，雛雞成活率較高，成活率平均為90.27%，死亡率平均為9.73%。其中，成活最高為100%，最低為80%。經(jīng)分析得出：在不同劑量之間F=0.29，差異性不顯著（P＞0.05），不同劑量處理對(duì)雛雞成活率影響不顯著；總體分析不同日齡處理之間F=17.96，差異性極顯著（P＜ 0.01），但第 4、5、7 天之間差異性不顯著（P＞ 0.05）。

表3 不同日齡不同劑量胚外處理對(duì)成活率的影響

2.2.2 雌雄雞性比的分析 由表4 可知，通過(guò)蛋外處理后，最后得出雌性平均為72.82%，雄性平均為27.18%，其中最高為80.77%，最低為66.67%。通過(guò)總體分析表明，不同劑量之間處理，F(xiàn)=2.76，差異性不顯著（P＞ 0.05），不同劑量處理對(duì)雌性的百分比效果不明顯；不同日齡之間處理，F(xiàn)=25.24，差異性極顯著（P＜ 0.01）。

表4 不同日齡不同劑量胚外處理對(duì)雌雄性比的影響

3 討論

3.1 胚內(nèi)處理的成活率與雌雄性比 通過(guò)采用芳香化酶抗體稀釋劑胚內(nèi)注射，雛雞成活率極低，平均只有9.06%，不同日齡胚內(nèi)處理與雛雞成活率之間的差異顯著（P＜0.05），不同劑量處理與成活率之間的差異性不顯著（P＞0.05），這說(shuō)明注射日齡對(duì)小雞成活率有一定影響，不同劑量試劑注射對(duì)小雞成活率無(wú)顯著影響。在孵化過(guò)程中，前期發(fā)育較好，后期即出雛前4 d 左右，胚胎死亡逐漸升高。待出雛后將成活雛雞飼養(yǎng)至完全能辨別雌雄，雌性百分比為92.80%，雄性為7.20%。這與易治明和張志霞（1986）的研究結(jié)果相似，即將雌激素和抗睪丸雞血清制備液注入胚蛋中，68個(gè)胚蛋孵化僅成活9 只小雞，成活率為13.2%，但9 只小雞全部為雌性，雌性百分比為100%。說(shuō)明胚蛋打孔注射對(duì)胚胎發(fā)育有較大影響，雛雞成活率較低。

所以，早期胚內(nèi)注射芳香化酶抗體稀釋液對(duì)雞胚成活率及雌性比例的影響因素可能：一是胚蛋打孔后會(huì)受到外環(huán)境影響，打破胚內(nèi)環(huán)境的平衡；二是芳香化酶抗體注入后反應(yīng)太強(qiáng)烈，脆弱的雞胚難以適應(yīng)。酶是一種量少功能強(qiáng)大的調(diào)節(jié)劑，所以，在孵化過(guò)程中有可能是雄性雞都被致死，而成活的只是母雞，也有可能部分是雄性雞逆轉(zhuǎn)成雌性雞。因此，胚內(nèi)處理方式的代表性不強(qiáng)，成活母雞并不能代表是雄性逆轉(zhuǎn)獲得的。

3.2 胚外處理的成活率與雌雄性比 芳香化酶抗體稀釋劑胚外注射，雛雞成活率較高，平均為90.27%，死亡率較低，平均為9.73%。不同劑量處理對(duì)雛雞成活率差異性不顯著（P＞0.05），不同日齡胚內(nèi)處理與雛雞成活率間差異極顯著（P＜0.01）。胚外處理成活雛雞養(yǎng)至完全能辨別雌雄，母雞比例平均為72.82%，公雞的平均為27.18%，不同劑量處理母雞的百分比差異性不顯著（P＞0.05），不同日齡之間處理母雞百分比差異性極顯著（P＜ 0.01）。

所以，雖然胚外處理母雞的比例為72.82%，與胚內(nèi)處理母雞的比例為92.80% 要低些，但胚外處理的成活率較高，這可能是因?yàn)榕咄馓幚韺?duì)胚內(nèi)環(huán)境沒(méi)有太大改變，胚外固定消毒棉注射芳香化酶抗體稀釋液，主要是通過(guò)外殼緩慢浸潤(rùn)至胚內(nèi)，對(duì)胚胎發(fā)育不可能達(dá)到致死程度。根據(jù)馬焰（譯）（1980）對(duì)來(lái)航品系雞后代雌雄性別進(jìn)行研究，正常遺傳繁育中雞雌雄性比遺傳變異比例不顯著，公雞比例平均為50.9%，母雞比例平均為49.1%。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，母雞比例平均為72.82%，公雞比例平均為27.18%。這說(shuō)明芳香化酶抗體對(duì)雞胚的發(fā)育確實(shí)起一定作用，胚外注射芳香化酶抗體稀釋液對(duì)雞性別發(fā)生了逆轉(zhuǎn)。而且胚外處理比胚內(nèi)處理效果好，在孵化第6 天時(shí)胚外注射芳香化酶抗體試劑雞胚有雄性雞向雌性雞的逆轉(zhuǎn)改變。

4 結(jié)論

從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，長(zhǎng)順綠殼蛋雞早期胚胎發(fā)育的性逆轉(zhuǎn)在芳香化酶抗體作用中起一定效果，胚外注射效果較好，但在性逆轉(zhuǎn)機(jī)制方面還不清楚。在今后研究工作中還需進(jìn)一步從分子水平思考長(zhǎng)順綠殼蛋雞性別決定的基因，性別決定的影響因素，并從性逆轉(zhuǎn)機(jī)制方面作相關(guān)探索。