circNT5E通過調控miR-506-3p表達對結腸癌細胞遷移、侵襲和凋亡的影響

孟凡迪 徐勤鴻 楊剛華 萬永 張雷

結腸癌是一種臨床常見的消化道惡性腫瘤，在各類惡性腫瘤中發(fā)病率較高，預后差，新的靶向治療藥物的應用為晚期結腸癌的治療開辟了新的前景［1-2］。研究結腸癌轉移、凋亡的分子機制有利于尋找新的靶向藥物治療靶點。環(huán)狀RNA（Circular RNA，circRNA）是一種新的內源性非編碼RNA，其異常表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關［3］。尋找在結直腸癌中存在差異表達并具有重要生物學功能的circRNA，將為闡明結腸癌的發(fā)病機制奠定基礎，且可為結直腸癌的診治提供新的靶點及思路［4］。circNT5E 是來自NT5E 的circRNA，有研究報道circNT5E 在膠質瘤組織中高表達，敲低其表達可通過調控miR-422a 抑制膠質瘤細胞的增殖、遷移和侵襲，促進細胞凋亡［5］。circNT5E 在非小細胞肺癌組織和細胞中上調表達，沉默其表達通過海綿化miR-134 抑制非小細胞肺癌細胞的增殖和遷移，并誘導凋亡［6］。然而circNT5E 對結腸癌細胞遷移、侵襲和凋亡的影響及其機制還尚未清楚。研究報道m(xù)iR-506 可抑制結腸癌增殖［7］。miR-506-3p 過表達抑制前列腺癌腫瘤的進展，可作為前列腺癌中的新型腫瘤抑制物［8］。上調miR-506-3p 表達可抑制卵巢癌細胞生長和增殖［9］。因此，本實驗旨在研究circNT5E 對結腸癌細胞遷移、侵襲和凋亡的影響及其機制是否與miR-506-3p 表達有關。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選取2017年1月至2019年5月本院經病理檢測為結腸癌且具有完整臨床病理資料的患者組織標本40 例，其中 男22 例，女18 例，年齡16～68歲。以患者癌組織邊緣2～5 cm 處切除的癌旁組織作為對照，所有患者術前均未接受放化療，無其他合并腫瘤。所有患者均知情且同意。

1.2 細胞與主要試劑

結腸癌細胞HCT116 購自上海彩佑實業(yè)有限公司；胎牛血清、RPMI-1640 培養(yǎng)基購自上海研謹生物科技有限公司；熒光定量PCR 試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司；Transwell 小室、Matrigel 膠購自美國Bio-Rad 公司；膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙錠（Annexin V-FITC/PI）凋亡檢測試劑盒購自北京凱瑞基生物科技有限公司；RIPA蛋白裂解液、二辛可寧酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒購自上海圻明生物科技有限公司；MMP-2、MMP-9、Bcl-2、Bax、GAPDH 抗體及HRP 標記的山羊抗兔IgG 購自上海恒斐生物科技有限公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京博邁斯科技發(fā)展有限公司。

1.3 細胞培養(yǎng)與分組

將結腸癌細胞HCT116 接種在RPMI-1640 培養(yǎng)液（含10%胎牛血清）中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數生長期細胞，將si-NC、si-circNT5E、pcDNA、pcDNA-circNT5E、miR-NC、miR-506-3p 分別轉染至HCT116 細胞中，命名為si-NC 組、si-circNT5E 組、pcDNA 組、pcDNA-circNT5E 組、miR-NC 組、miR-506-3p 組；將si-circNT5E 分別與anti-miR-NC、anti-miR-506-3p 共轉染至HCT116細胞中，命名為si-circNT5E+anti-miR-NC 組、si-circNT5E+anti-miR-506-3p 組。

1.4 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測circNT5E和miR-506-3p 的表達水平

詳細步驟參照文獻［7］，其中PCR 循環(huán)條件為95℃預變性5 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s；72℃延伸30 s，共40 個循環(huán)；60℃延長5 min。

1.5 顯色原位雜交（CISH）檢測癌組織中circNT5E 表達

將10%福爾馬林固定、石蠟包埋的結腸癌組織和癌旁組織標本切片，厚4 μm，將切片50℃烤片過夜，脫蠟、水化、抗原修復，100℃烤箱孵育15 min，蛋白酶K 消化、脫水。雜交過夜，DAB 顯色，蘇木素復染，中性樹膠封片、顯微鏡下觀察拍照。

1.6 Transwell 檢測細胞遷移和侵襲

將基質膠（Matrigel）與RPMI -1640 培養(yǎng)液以1∶5 比例混勻，然后取100 μL 加入Transwell 小室的上室，凝固后取100 μL 細胞懸液接種于上室，培養(yǎng)24 h。然后分別用4%多聚甲醛固定和0.1%結晶紫染色，顯微鏡下隨機觀察5 個視野，計算細胞遷移數目和侵襲數目。

1.7 流式細胞儀檢測細胞凋亡

取培養(yǎng)24 h 后的各組細胞，PBS 漂洗胞2 次，然后分別加入10 μL 的Annexin V-FITC 和5 μL 的PI，輕搖混勻，常溫避光孵育15 min，流式細胞儀檢測。每組設3 個復孔，實驗重復3 次。

1.8 蛋白質印跡（Western blot）法檢測MMP-2、MMP-9、Bcl-2、Bax 蛋白表達

詳細步驟參照文獻［7］，其中一抗工作液以1∶800 稀釋，二抗工作液以1∶1 000 稀釋。每個蛋白樣品設3 個重復。

1.9 雙熒光素酶報告實驗驗證circNT5E 和miR-506-3p 的靶向關系

構建包含miR-506-3p 結合位點的circNT5E 野生型和突變型熒光素酶表達載體WT-circNT5E、MUT-circNT5E，將其分別與miR-NC、miR-506-3p共轉染至結腸癌細胞中，轉染48 h 后，根據雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測熒光素酶活性。

1.10 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 20.0 軟件進行數據分析，計量資料用（）表示，兩組比較行t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 circNT5E 和miR-506-3p 在結腸癌組織中的表達

與癌旁組織相比，結腸癌組織中circNT5E 呈陽性表達，且表達水平顯著升高，miR-506-3p 表達水平顯著降低（P＜0.05）。見圖1，表1。

表1 circNT5E和miR-506-3p在結腸癌組織中的表達（±s）Table 1 Expressions of circNT5E and miR-506-3p in colon cancer tissues（±s）

表1 circNT5E和miR-506-3p在結腸癌組織中的表達（±s）Table 1 Expressions of circNT5E and miR-506-3p in colon cancer tissues（±s）

分組癌旁組織結腸癌組織t 值P 值n 40 40 circNT5E 1.00±0.08 3.37±0.31 46.818 0.000 miR-506-3p 1.00±0.05 0.48±0.04 51.362 0.000

2.2 沉默circNT5E 表達對結腸癌HCT116 細胞遷移、侵襲和凋亡的影響

與si-NC 組相比，si-circNT5E 組結腸癌HCT116 細胞中circNT5E 表達水平顯著降低，遷移、侵襲細胞數顯著降低，細胞凋亡率顯著升高，MMP-2、MMP-9、Bcl-2 表達水平顯著降低，Bax 表達水平顯著升高（P＜0.05）。見表2。

2.3 miR-506-3p 過表達對結腸癌HCT116 細胞遷移、侵襲和凋亡的影響

與miR-NC 組相比，miR-506-3p 組miR-506-3p表達水平顯著升高，遷移、侵襲細胞數顯著降低，細胞凋亡率顯著升高，MMP-2、MMP-9、Bcl-2 表達水平顯著降低，Bax 表達水平顯著升高（P＜0.05）。見表3。

2.4 circNT5E 靶向調控miR-506-3p 的表達

StarBase 在線軟件預測顯示circNT5E 的序列中含有與miR-506-3p 互補的核苷酸序列見圖2，雙熒光素酶報告實驗結果顯示，與miR-NC組相比，miR-506-3p 組轉染WT-circNT5E 載體的細胞熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05），轉染MUT-circNT5E 載體的細胞熒光素酶活性無顯著變化差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表4。與pcDNA 組相 比，pcDNA-circNT5E 組miR-506-3p 表達水平顯著降低（P＜0.05）；與si-NC 組相比，si-circNT5E 組miR-506-3p 表達水平顯著升高（P＜0.05）。見表5。

表2 沉默circNT5E 表達對結腸癌HCT116 細胞遷移、侵襲和凋亡的影響（±s）Table 2 Effect of silenced circNT5E expression on migration，invasion and apoptosis of colon ca cellsncer HCT116（±s）

表2 沉默circNT5E 表達對結腸癌HCT116 細胞遷移、侵襲和凋亡的影響（±s）Table 2 Effect of silenced circNT5E expression on migration，invasion and apoptosis of colon ca cellsncer HCT116（±s）

分組si-NC 組si-circNT5E 組t 值P 值circNT5E 1.00±0.06 0.53±0.05 18.053 0.000遷移細胞數（個）98.32±9.54 43.25±4.87 15.424 0.000侵襲細胞數（個）79.63±7.25 34.11±3.69 16.787 0.000凋亡率（%）6.25±0.52 23.14±2.33 21.225 0.000 MMP-2蛋白0.71±0.07 0.31±0.03 15.757 0.000 MMP-9蛋白0.63±0.06 0.26±0.02 17.551 0.000 Bcl-2蛋白0.58±0.05 0.20±0.02 21.169 0.000 Bax 蛋白0.33±0.03 0.78±0.07 17.726 0.000

表3 miR-506-3p 過表達對結腸癌HCT116 細胞遷移、侵襲和凋亡的影響（±s）Table 3 Effects of miR-506-3p overexpression on migration，invasion and apoptosis of colon cancer HCT116 cells（±s）

表3 miR-506-3p 過表達對結腸癌HCT116 細胞遷移、侵襲和凋亡的影響（±s）Table 3 Effects of miR-506-3p overexpression on migration，invasion and apoptosis of colon cancer HCT116 cells（±s）

分組miR-NC 組miR-506-3p 組t 值P 值miR-506-3p 1.00±0.08 2.84±0.27 19.602 0.000遷移細胞數（個）94.36±9.44 55.21±5.52 10.740 0.000侵襲細胞數（個）76.32±7.61 40.25±4.58 12.183 0.000凋亡率（%）7.36±0.78 18.63±1.25 22.947 0.000 MMP-2蛋白0.70±0.07 0.36±0.03 13.393 0.000 MMP-9蛋白0.65±0.06 0.29±0.03 16.100 0.000 Bcl-2蛋白0.56±0.05 0.25±0.02 17.270 0.000 Bax蛋白0.32±0.03 0.74±0.07 16.545 0.000

表4 雙熒光素酶報告實驗（±s）Table 4 Double luciferase report experiments（±s）

表4 雙熒光素酶報告實驗（±s）Table 4 Double luciferase report experiments（±s）

分組miR-NC 組miR-506-3p 組t 值P 值WT-circNT5E 1.03±0.06 0.61±0.06 14.849 0.000 MUT-circNT5E 1.05±0.09 1.01±0.08 0.997 0.334

表5 circNT5E 調控miR-506-3p 的表達（±s）Table 5 circNT5E regulates miR-506-3p expression（±s）

表5 circNT5E 調控miR-506-3p 的表達（±s）Table 5 circNT5E regulates miR-506-3p expression（±s）

注：與pcDNA 組比較，aP＜0.05；與si-NC 組比較，bP＜0.05。

分組pcDNA 組pcDNA-circNT5E 組si-NC 組si-circNT5E 組F 值P 值miR-506-3p 1.00±0.08 0.57±0.05a 1.01±0.06 2.63±0.25b 396.140 0.000

2.5 抑制miR-506-3p 表達逆轉了沉默circNT5E 表達對結腸癌HCT116 細胞遷移、侵襲和凋亡的作用

與si-circNT5E+anti-miR-NC 組相比，sicircNT5E+anti-miR-506-3p 組miR-506-3p 表達水平顯著降低，遷移、侵襲細胞數顯著升高，細胞凋亡率顯著降低，MMP-2、MMP-9、Bcl-2 表達水平顯著升高，Bax 表達水平顯著降低（P＜0.05）。見表6。

3 討論

circRNA 具有高豐度性、穩(wěn)定性、保守性的特點，在多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展起重要作用，有望成為新的診斷、預測腫瘤的生物標志物及精準治療的靶點［10］。研究報道circCCDC66 可促進結腸癌的生長和轉移［11］。circPIP5K1A 可抑制結腸癌細胞活力及侵襲、遷移［12］。說明circRNA 參與結腸癌的發(fā)生發(fā)展過程。本實驗結果顯示，結腸癌患者組織中circNT5E 表達水平顯著升高，說明circNT5E 與結腸癌有關。且沉默circNT5E 后，遷移、侵襲細胞數顯著降低，細胞凋亡率顯著升高，MMP-2、MMP-9、Bcl-2 表達水平顯著降低，Bax 表達水平顯著升高。說明沉默circNT5E 可抑制結腸癌細胞遷移、侵襲，促進細胞凋亡。

研究表明異常表達的miRNA 也參與結腸癌的進展，與其預后相關，可作為預后檢測標志物［13］。miR-506-3p 在骨肉瘤組織和細胞中表達下調，上調其表達抑制骨肉瘤細胞的增殖、遷移和侵襲［14］。本實驗結果顯示，結腸癌組織中miR-506-3p 表達水平顯著降低。過表達miR-506-3p，遷移、侵襲細胞數顯著降低，細胞凋亡率顯著升高，MMP-2、MMP-9、Bcl-2 表達水平顯著降低，Bax 表達水平顯著升高。說明過表達miR-506-3p 可抑制結腸癌細胞遷移、侵襲，促進細胞凋亡。有研究報道，敲除lncRNA NEAT1 可通過上調miR-506-3p 誘導胰腺癌細胞的細胞周期停滯和促進細胞凋亡而顯著抑制細胞增殖［15］。lncRNA SNHG17 通過靶向miR-506-3p/CTNNB1 軸激活Wnt/β-catenin 信號通路促進神經膠質瘤的發(fā)展［16］。研究表明circRNA 可充當miRNA 的“海綿”，從而參與基因的表達調控。本實驗結果顯示，circNT5E 靶向調控miR-506-3p，抑制miR-506-3p 表達逆轉了沉默circNT5E 表達對結腸癌HCT116 細胞遷移、侵襲和凋亡的作用。

表6 抑制miR-506-3p 表達逆轉了沉默circNT5E 表達對結腸癌HCT116 細胞遷移、侵襲和凋亡的作用（±s）Table 6 Inhibition of miR-506-3p expression reverses the effects of silenced circNT5E expression on colon cancer HCT116 cell migration，invasion and apoptosis（±s）

表6 抑制miR-506-3p 表達逆轉了沉默circNT5E 表達對結腸癌HCT116 細胞遷移、侵襲和凋亡的作用（±s）Table 6 Inhibition of miR-506-3p expression reverses the effects of silenced circNT5E expression on colon cancer HCT116 cell migration，invasion and apoptosis（±s）

注：與si-NC 組比較，a P＜0.05；與si-circNT5E+anti-miR-NC 組比較，bP＜0.05。

分組si-NC si-circNT5E si-circNT5E+anti-miR-NC si-circNT5E+anti-miR-506-3p F 值P 值miR-506-3p 1.00±0.05 2.69±0.26a 2.71±0.27 1.55±0.15b 158.217 0.000遷移細胞數（個）97.25±9.36 45.28±4.29a 44.65±4.33 81.21±8.36b 128.736 0.000侵襲細胞數（個）77.63±7.58 38.33±3.68a 36.94±3.57 60.36±6.07b 112.801 0.000凋亡率（%）7.03±0.71 22.36±2.24a 24.69±2.41 12.65±1.27b 190.797 0.000 MMP-2蛋白0.72±0.07 0.32±0.03a 0.30±0.03 0.60±0.06b 151.340 0.000 MMP-9蛋白0.66±0.06 0.28±0.03a 0.26±0.03 0.57±0.05b 187.253 0.000 Bcl-2蛋白0.57±0.05 0.23±0.02a 0.21±0.02 0.46±0.04b 228.429 0.000 Bax蛋白0.31±0.03 0.77±0.07a 0.79±0.08 0.43±0.04#152.609 0.000

綜上所述，沉默circNT5E 表達可能通過上調miR-506-3p 的表達抑制結腸癌HCT116 細胞遷移、侵襲，促進細胞凋亡。