下調(diào)miR-9對LPS誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞炎癥因子分泌的影響和機(jī)制

李媛莉 趙繼波 張三明

膿毒癥是一種由于微生物感染而引起的宿主炎癥損傷的相關(guān)疾病，膿毒癥引起的心肌損傷是臨床上常見的并發(fā)癥［1］。脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）是常見的促膿毒癥誘導(dǎo)因子，其也是體外模擬膿毒癥心肌細(xì)胞損傷的誘導(dǎo)因子。miRNA是在生命體內(nèi)廣泛存在的非編碼RNA，其大小約為20 nt，序列高度保守，具有多種生物學(xué)作用，參與人類疾病的進(jìn)展［2］。研究顯示，膿毒癥的發(fā)生也與miRNA 的異常表達(dá)有關(guān)，miRNA 異常表達(dá)與膿毒癥心肌細(xì)胞炎癥因子分泌等有關(guān)［3］。miR-9 在人體內(nèi)的多個(gè)組織和細(xì)胞中表達(dá)，具有調(diào)控細(xì)胞生長、組織炎癥等功效。有研究表明，miR-9 在膿毒癥中表達(dá)上調(diào)，敲除miR-9 可以減少膿毒癥小鼠血清中炎癥因子水平，延長小鼠的生存時(shí)間［4］。miR-9 在心肌細(xì)胞中表達(dá)，下調(diào)其表達(dá)改善缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷［5］。NF-κB 信號通路廣泛參與人體內(nèi)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖等過程，其在膿毒癥中過度激活，下調(diào)其激活水平可以減輕膿毒癥心肌損傷［6］。本實(shí)驗(yàn)研究miR-9 在膿毒癥大鼠心肌組織中的表達(dá)變化，探討下調(diào)miR-9 對LPS 誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞炎癥損傷的影響和機(jī)制，為靶向基因治療膿毒癥大鼠心肌損傷和研究膿毒癥分子發(fā)生機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF 雄性成年大鼠購自維通利華實(shí)驗(yàn)動物中心，體重200～220 g。大鼠心肌細(xì)胞H9C2 購自武漢普諾賽生命科技有限公司；inhibitor control、miR-9 inhibitor 購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；TNF-α 檢測試劑盒購自上海瑞番生物科技有限公司；p65、p-p65 抗體購自美國Abcam；IL-6 檢測試劑盒購自艾美捷科技有限公司；LPS 購自美國Sigma；IL-1β檢測試劑盒購自上海嵐派生物科技有限公司。

1.2 膿毒癥模型構(gòu)建［7］

大鼠分成2組，每組9只，為Model和Normal組。

1.3 qRT-PCR 檢測膿毒癥心肌組織中miR-9 表達(dá)

用Trizol 提取心肌組織中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA 為模板進(jìn)行qRT-PCR 反應(yīng)，miR-9 以U6 作為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算miR-9 相對表達(dá)量。

1.4 心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組處理

用含有10 μg/mL 的LPS 細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞（LPS 組）；LPS+Anti-NC、LPS+Anti-miR-9 組心肌細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)開始前12 h 分別轉(zhuǎn)染inhibitor control、miR-9 inhibitor；Control 組細(xì)胞正常培養(yǎng)。分別將Anti-NC、Anti-miR-9 共轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞，加入含有10 μg/mL 的LPS 細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，分別記作LPS+Anti-NC 組、LPS+Anti-miR-9 組。

1.5 CCK-8 檢測細(xì)胞活力

將心肌細(xì)胞按照“1.4”分組方法接種到96 孔板內(nèi)（2×103個(gè)/孔），每孔添加10 μL 的CCK-8 溶液，繼續(xù)放在37℃孵育2 h，以酶標(biāo)儀測定450 nm的OD值。

1.6 ELISA 法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液上清中TNF-α、IL-6、IL-1β 水平

Control、LPS、LPS+Anti-NC、LPS+Anti-miR-9組細(xì)胞培養(yǎng)24 h 以后，收集培養(yǎng)液上清，分別用TNF-α 檢測試劑盒、IL-6 檢測試劑盒、IL-1β 檢測試劑盒檢測TNF-α、IL-6、IL-1β 水平，步驟完全按照試劑盒操作說明進(jìn)行。

1.7 Western blot檢測細(xì)胞中p65、p-p65蛋白表達(dá)水平

Control、LPS、LPS+Anti-NC、LPS+Anti-miR-9組細(xì)胞培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，BCA 法檢測濃度，加入Loading Buffer 混合，沸水煮5 min。SDS-PAGE 凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，室溫封閉2 h，分別加入一抗稀釋液與二抗稀釋液，滴加ECL 顯色，應(yīng)用Image J 分析蛋白條帶的灰度值，以β-actin作為參照，分析蛋白相對表達(dá)變化。p65、p-p65 一抗分別以1∶1 000和1∶800稀釋，二抗以1∶2 000稀釋。

1.8 NF-κB 信號激活劑對下調(diào)miR-9 影響心肌細(xì)胞分泌炎癥因子的作用檢測

心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-9 inhibitor 以后，用含有10 μg/mL 的LPS 和1 μmol/L 的NF-κB 信號激活劑PMA 細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，記為LPS+Anti-miR-9+PMA 組，以LPS+Anti-miR-9 組作為對照，CCK-8檢測細(xì)胞活力，ELISA 法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液上清中TNF-α、IL-6、IL-1β 水平，Western blot 檢測細(xì)胞中p65、p-p65 蛋白表達(dá)水平，步驟同上。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析分析，計(jì)量資料用（）表示，兩組數(shù)據(jù)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組差異比較用單因素方差，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-9 在膿毒癥大鼠心肌組織中高表達(dá)

膿毒癥大鼠心肌組織中miR-9 表達(dá)水平明顯高于正常大鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 膿毒癥大鼠心肌組織中miR-9 表達(dá)水平（±s）Table 1 Expression level of Mir-9 in myocardium of septic rats（±s）

表1 膿毒癥大鼠心肌組織中miR-9 表達(dá)水平（±s）Table 1 Expression level of Mir-9 in myocardium of septic rats（±s）

組別Normal Model t 值P 值miR-9 水平1.00±0.08 2.15±0.16 18.18＜0.001

2.2 miR-9 inhibitor 下調(diào)LPS 條件下心肌細(xì)胞中miR-9 表達(dá)水平

LPS 處理以后的心肌細(xì)胞中的miR-9 表達(dá)水平升高；轉(zhuǎn)染miR-9 inhibitor 后的心肌細(xì)胞經(jīng)過LPS 處理以后，細(xì)胞中的miR-9 表達(dá)水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 miR-9 inhibitor 轉(zhuǎn)染前后LPS 條件下心肌細(xì)胞中miR-9 表達(dá)水平（±s）Table 2 Expression levels of Mir-9 in myocardial cells before and after transfection with Mir-9 inhibitor（±s）

表2 miR-9 inhibitor 轉(zhuǎn)染前后LPS 條件下心肌細(xì)胞中miR-9 表達(dá)水平（±s）Table 2 Expression levels of Mir-9 in myocardial cells before and after transfection with Mir-9 inhibitor（±s）

注：與Control 比較，aP＜0.05；與LPS+Anti-NC 比較，bP＜0.05。

組別Control LPS LPS+Anti-NC LPS+Anti-miR-9 F 值P 值miR-9 水平1.00±0.10 1.96±0.13a 1.99±0.15 0.98±0.12b 160.30＜0.001

2.3 下調(diào)miR-9 減少LPS 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞分泌炎癥因子

LPS 處理以后的心肌細(xì)胞活力降低，細(xì)胞分泌的TNF-α、IL-6、IL-1β 增多；轉(zhuǎn)染miR-9 inhibitor后的心肌細(xì)胞經(jīng)過LPS 處理以后，細(xì)胞分泌的TNF-α、IL-6、IL-1β 減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

2.4 下調(diào)miR-9抑制LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中NF-κB信號通路激活

LPS 處理以后的心肌細(xì)胞中p-p65 蛋白表達(dá)水平增多；轉(zhuǎn)染miR-9 inhibitor 后的心肌細(xì)胞經(jīng)過LPS 處理以后，細(xì)胞中p-p65 蛋白表達(dá)水平減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1、表4。

2.5 NF-κB 信號激活劑逆轉(zhuǎn)下調(diào)miR-9 抑制LPS條件下心肌細(xì)胞分泌炎癥因子作用

NF-κB 信號激活劑PMA 處理下調(diào)miR-9 的心肌細(xì)胞，經(jīng)LPS 誘導(dǎo)以后，細(xì)胞中的p-p65 蛋白表達(dá)水平升高，細(xì)胞分泌的TNF-α、IL-6、IL-1β 水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2、表5。

表3 miR-9 inhibitor 轉(zhuǎn)染前后LPS 條件下心肌細(xì)胞分泌的TNF-α、IL-6、IL-1β 水平和細(xì)胞活力（±s）Table 3 Levels of TNF-，IL-6，IL-1 secreted by cardiomyocytes and cell activity before and after transfection with Mir-9 inhibitor（±s）

表3 miR-9 inhibitor 轉(zhuǎn)染前后LPS 條件下心肌細(xì)胞分泌的TNF-α、IL-6、IL-1β 水平和細(xì)胞活力（±s）Table 3 Levels of TNF-，IL-6，IL-1 secreted by cardiomyocytes and cell activity before and after transfection with Mir-9 inhibitor（±s）

注：與Control 比較，aP＜0.05；與LPS+Anti-NC 比較，bP＜0.05。

組別Control LPS LPS+Anti-NC LPS+Anti-miR-9 F 值P 值TNF-α（pg/mL）223.54±12.05 1456.27±125.26a 1420.31±104.42 869.97±65.14b 403.40＜0.001 IL-6（pg/mL）165.24±13.28 1205.10±110.36a 1156.72±103.32 647.98±43.75b 349.10＜0.001 IL-1β（pg/mL）104.41±10.22 954.28±72.30a 968.51±63.25 559.76±60.43b 462.61＜0.001 OD 值（細(xì)胞活力）0.45±0.04 0.32±0.03a 0.31±0.04 0.42±0.05b 106.69＜0.001

表4 miR-9 inhibitor 轉(zhuǎn)染前后LPS 條件下心肌細(xì)胞中p-p65、p65 表達(dá)水平（±s）Table 4 Expression levels of P-P65 and P65 in myocardial cells before and after transfection with Mir-9 inhibitor（±s）

表4 miR-9 inhibitor 轉(zhuǎn)染前后LPS 條件下心肌細(xì)胞中p-p65、p65 表達(dá)水平（±s）Table 4 Expression levels of P-P65 and P65 in myocardial cells before and after transfection with Mir-9 inhibitor（±s）

注：與Control 比較，aP＜0.05；與LPS+Anti-NC 比較，bP＜0.05。

組別Control LPS LPS+Anti-NC LPS+Anti-miR-9 F 值P 值p65 0.89±0.09 0.87±0.07 0.88±0.10 0.86±0.11 0.15 0.96 p-p65 0.23±0.03 0.76±0.07a 0.74±0.05 0.31±0.04b 233.39＜0.001

3 討論

miRNA 在自然界中廣泛存在，是一類沒有編碼功能的小分子RNA，miRNA具有多種功能，在各種細(xì)胞生長、代謝、炎癥等過程中發(fā)揮作用。研究報(bào)道顯示，多種疾病的發(fā)生與miRNA的表達(dá)有關(guān)，miRNA可能是疾病治療和診斷的分子標(biāo)記物［8］。膿毒癥的發(fā)生也受到miRNA 的調(diào)控作用，其表達(dá)改變與膿毒癥損傷有關(guān)［9］。miR-9是目前發(fā)現(xiàn)的人體內(nèi)普遍表達(dá)的調(diào)節(jié)因子，在腫瘤等多種疾病中發(fā)揮作用［10］。最近的研究表明，miR-9與膿毒癥有關(guān)，其在膿毒癥中表達(dá)上調(diào)，敲除miR-9 改善膿毒癥小鼠炎癥，下調(diào)miR-9 還可以抑制巨噬細(xì)胞炎癥因子分泌［4］。miR-9是一種心肌損傷促進(jìn)因子，其在缺氧、缺血心肌細(xì)胞損傷中發(fā)揮促進(jìn)作用［5］。本次的實(shí)驗(yàn)表明，miR-9 在膿毒癥大鼠心肌組織中表達(dá)上調(diào)，說明miR-9可能與膿毒癥大鼠心肌損傷有關(guān)，這與上述研究報(bào)道結(jié)果相符合。

膿毒癥是一種全身性的炎癥反應(yīng)，膿毒癥心肌損傷是常見的膿毒癥連續(xù)過程。研究顯示，膿毒癥發(fā)生時(shí)，心肌細(xì)胞釋放大量的炎癥因子，促進(jìn)炎癥損傷。LPS是膿毒癥的促進(jìn)因子，其可以在體外誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷，促進(jìn)心肌細(xì)胞釋放炎癥因子［11］。TNF-α、IL-6、IL-1β是常見的膿毒癥炎癥因子，其可以促進(jìn)炎癥發(fā)生，誘導(dǎo)心肌損傷［12］。本次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LPS 處理以后的大鼠心肌細(xì)胞分泌的TNF-α、IL-6、IL-1β 增多，細(xì)胞活力下降，而下調(diào)miR-9 可以逆轉(zhuǎn)LPS 對大鼠心肌細(xì)胞TNF-α、IL-6、IL-1β 分泌和細(xì)胞活力的影響，這說明下調(diào)miR-9具有抑制LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷和炎癥因子分泌的作用。

本實(shí)驗(yàn)還表明，LPS 處理以后的心肌細(xì)胞中p-p65 蛋白水平升高，p65 蛋白表達(dá)沒有變化，而下調(diào)miR-9 可以降低心肌細(xì)胞中p-p65 蛋白表達(dá)水平，miR-9 作用機(jī)制可能與p-p65 有關(guān)。p-p65 是p65 的磷酸化形式，p65 是NF-κB 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵亞單位［13］。NF-κB 是一個(gè)多功能調(diào)控因子，其激活后可以誘導(dǎo)組織炎癥發(fā)生［14］。研究報(bào)道顯示，膿毒癥中NF-κB 過度激活，而抑制NF-κB 信號可以改善膿毒癥心肌損傷［15］。

表5 NF-κB 信號激活劑處理miR-9 inhibitor 轉(zhuǎn)染后LPS 條件下心肌細(xì)胞中p-p65、p65 表達(dá)水平、細(xì)胞活力和分泌的TNF-α、IL-6、IL-1β 水平（±s）Table 5 Expression levels of P-P65 and P65，cell activity，and secretion of TNF-，IL-6 and IL-1 in myocardial cells treated with NF-B signal activator after Mir-9 inhibitor transfection（±s）

表5 NF-κB 信號激活劑處理miR-9 inhibitor 轉(zhuǎn)染后LPS 條件下心肌細(xì)胞中p-p65、p65 表達(dá)水平、細(xì)胞活力和分泌的TNF-α、IL-6、IL-1β 水平（±s）Table 5 Expression levels of P-P65 and P65，cell activity，and secretion of TNF-，IL-6 and IL-1 in myocardial cells treated with NF-B signal activator after Mir-9 inhibitor transfection（±s）

注：與LPS+Anti-miR-9 比較，aP＜0.05。

組別LPS+Anti-miR-9 LPS+Anti-miR-9+PMA t 值P 值p65 0.87±0.12 0.85±0.10 0.36 0.72 p-p65 0.34±0.05 0.79±0.09a 12.36＜0.001 TNF-α（pg/mL）875.36±52.17 1395.47±109.94a 12.09＜0.001 IL-6（pg/mL）684.20±55.32 1105.58±92.36a 11.07＜0.001 IL-1β（pg/mL）570.86±43.31 1034.01±85.52a 13.67＜0.001 OD 值（細(xì)胞活力）0.44±0.06 0.36±0.02a 3.58 0.003

綜上，miR-9 在膿毒癥大鼠心肌組織中高表達(dá)，下調(diào)miR-9 可以抑制LPS 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞分泌炎癥因子，其作用機(jī)制與下調(diào)NF-κB 信號激活水平有關(guān)。miR-9 在膿毒癥心肌損傷中可能發(fā)揮促進(jìn)作用，靶向抑制miR-9 可能是減輕膿毒癥心肌損傷的途徑。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果為研究膿毒癥心肌損傷發(fā)生機(jī)制提供了參考。在以后實(shí)驗(yàn)中會探討miR-9 通過何種靶向機(jī)制影響調(diào)控NF-κB 信號激活進(jìn)而影響炎癥發(fā)生。