乙型肝炎病毒血清學(xué)標(biāo)志物檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展歷程

張學(xué)東 盧建華 王夢(mèng)寒 戴二黑★

自從1965年美國(guó)巴魯克·布倫博格博士（Baruch Blumberg）發(fā)現(xiàn)澳大利亞抗原即乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）以來(lái)，至今已有50 多年的歷史［1］，乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法不斷涌現(xiàn)和更新?lián)Q代，HBV DNA、HBV RNA、HBV cccDNA 定量檢測(cè)、HBV 基因型與基因突變位點(diǎn)檢測(cè)、HBV 核心相關(guān)抗原（HBcrAg）檢測(cè)等新技術(shù)、新方法相繼問世并在臨床逐漸推廣應(yīng)用［2-6］。與此同時(shí)，傳統(tǒng)的HBV 血清學(xué)標(biāo)志物如常用的HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc 乙肝“兩對(duì)半”等檢測(cè)技術(shù)也不斷創(chuàng)新發(fā)展［7］，從最初的免疫擴(kuò)散技術(shù)相繼建立了對(duì)流免疫電泳技術(shù)（CIEP）、紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)、放射免疫分析試驗(yàn)（Rodio Immunoassay，RIA）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）、固相膜免疫分析技術(shù)、化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)（chemiluminescent immunoassay，CLIA）等。

本文重點(diǎn)對(duì)以上HBV 血清學(xué)標(biāo)志物檢測(cè)技術(shù)的原理及其特點(diǎn)進(jìn)行簡(jiǎn)要介紹，旨在幫助大家在正確地了解HBV 血清學(xué)標(biāo)志物檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上，根據(jù)各單位的實(shí)際情況科學(xué)合理的選用這些技術(shù)。

1 HBV 血清學(xué)標(biāo)志物檢測(cè)技術(shù)

1.1 對(duì)流免疫電泳技術(shù)

對(duì)流免疫電泳是將雙向免疫擴(kuò)散與電泳相結(jié)合，在直流電場(chǎng)中定向加速的免疫擴(kuò)散技術(shù)。1970年，Gocke、prinee 等用對(duì)流免疫電泳技術(shù)檢測(cè)乙型肝炎表面抗原（HBsAg）和表面抗體（HBsAb），取得了較好的效果而被推廣應(yīng)用［8］；中國(guó)學(xué)者余乾炎和張志榮也在HBsAg 上做了相應(yīng)研究［9］。該試驗(yàn)相對(duì)簡(jiǎn)單、快速，靈敏度相比雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)提高8～16 倍，可測(cè)定的蛋白質(zhì)濃度最低限度達(dá)μg/mL 水平。該方法常用于抗原或抗體的性質(zhì)、效價(jià)和純度的測(cè)定，但不適用于抗原為免疫球蛋白或抗原抗體遷移率接近的情況，否則會(huì)導(dǎo)致抗原抗體朝同一個(gè)方向泳動(dòng)［9］。目前隨著新的檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，乙肝血清學(xué)標(biāo)志物檢測(cè)目前很少應(yīng)用此技術(shù)。

1.2 紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)

紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)利用抗人O 型紅細(xì)胞的單克隆抗體，該抗體能與任何血型的紅細(xì)胞結(jié)合而不出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，將此抗體與特異性抗體或抗原連接，運(yùn)用特異性凝集反應(yīng)可檢測(cè)標(biāo)本中的抗原或抗體［10］。該試驗(yàn)中受檢標(biāo)本為新鮮全血，取手指血或耳垂血即可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，受檢者即刻可知檢測(cè)結(jié)果。此試驗(yàn)以前曾經(jīng)用于檢測(cè)乙肝表面抗原，靈敏度為2～5 IU/mL，根據(jù)最新國(guó)家行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)要求［11］，HBsAg要求檢測(cè)限adr≤0.1 IU/mL，adw≤0.1 IU/mL，ay≤0.2 IU/mL，因此此技術(shù)靈敏度不能滿足國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求，乙肝血清學(xué)標(biāo)志物檢測(cè)一般不再使用此技術(shù)。

1.3 放射免疫分析試驗(yàn)

放射性免疫試驗(yàn)以放射性核素為基本特征，用放射性核素標(biāo)記抗原或抗體分子，通過(guò)測(cè)定放射性強(qiáng)度評(píng)估抗原-抗體反應(yīng)的情況，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)物質(zhì)的定量或定性分析［12］。放射免疫試驗(yàn)將放射性核素的高靈敏性與抗原-抗體間的高特異性結(jié)合于一體，檢測(cè)HBsAg 靈敏度可以達(dá)到0.5 IU/mL。放射性免疫試驗(yàn)開創(chuàng)了體液微量物質(zhì)定量分析的新紀(jì)元［13］，并為建立酶免疫試驗(yàn)、化學(xué)發(fā)光免疫試驗(yàn)等方法奠定了理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。目前，由于放射性核素的放射性污染問題，放射免疫試驗(yàn)已經(jīng)逐漸被酶免疫試驗(yàn)、化學(xué)發(fā)光免疫試驗(yàn)等方法所替代。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)是以酶作為標(biāo)記指示物，以抗原抗體免疫反應(yīng)為基礎(chǔ)的固相吸附測(cè)定方法。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性［14］。ELISA 技術(shù)因具有方法簡(jiǎn)單、易于操作、試劑開放、成本較低等優(yōu)點(diǎn)，從上世紀(jì)80年代開始一直占據(jù)臨床免疫學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域的主導(dǎo)地位，采用此技術(shù)檢測(cè)乙肝血清學(xué)標(biāo)志物乙肝“兩對(duì)半”，如HBsAg 靈敏度可以達(dá)到0.1 IU/mL［15］。但是，因?yàn)榇嬖谑止げ僮髡`差大、耗費(fèi)人力，結(jié)果報(bào)告時(shí)間久，灰區(qū)結(jié)果較多，難以準(zhǔn)確定量，需要批量操作，以及靈敏度和特異性較低等劣勢(shì)，人們一直在探尋新的方法克服ELISA 技術(shù)的不足。

1.5 固相膜免疫分析技術(shù)

固相膜免疫分析技術(shù)屬于快速免疫檢驗(yàn)技術(shù)，一般包括免疫層析試驗(yàn)、免疫滲慮試驗(yàn)、斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和免疫印跡試驗(yàn)。用于乙肝血清學(xué)標(biāo)志物檢測(cè)的技術(shù)主要是免疫層析試驗(yàn)，以硝酸纖維素膜等為固相載體，樣品溶液借助毛細(xì)作用在層析條上泳動(dòng)，同時(shí)樣品中的待測(cè)物與層析材料上待測(cè)物的受體發(fā)生高特異性、高親和性的免疫反應(yīng)，層析過(guò)程中免疫復(fù)合物被富集或截留在層析材料的一定區(qū)域，通過(guò)目測(cè)或儀器檢測(cè)標(biāo)記物聚集而得到直觀的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。這項(xiàng)技術(shù)多用于急診檢測(cè)及床旁檢測(cè)，但由于其檢測(cè)HBsAg 的靈敏度只有5 IU/mL［16］，人眼判斷結(jié)果主觀性較強(qiáng)，批量化操作相對(duì)較難等問題，在應(yīng)用范圍方面受到一定的限制。

1.6 化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)

化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)是指伴隨化學(xué)反應(yīng)過(guò)程所產(chǎn)生的光的發(fā)射現(xiàn)象，由于化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生電子能級(jí)處于激發(fā)態(tài)的物質(zhì)，被激發(fā)的物質(zhì)通過(guò)躍遷釋放能量產(chǎn)生光子，從而導(dǎo)致發(fā)光現(xiàn)象。按發(fā)光持續(xù)時(shí)間分為輝光型（glow）和閃光型（flash），輝光型發(fā)光時(shí)間在數(shù)分鐘至數(shù)十分鐘以上；閃光型發(fā)光時(shí)間在數(shù)秒內(nèi)［17］。

1.6.1 化學(xué)發(fā)光技術(shù)分類及代表性廠家

化學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)大體上可分為兩大類，即酶促與非酶促化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)系統(tǒng)。酶促化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)系統(tǒng)中作為標(biāo)記物的酶基本不被消耗，而反應(yīng)體系中發(fā)光劑的量充分過(guò)量，發(fā)光強(qiáng)度穩(wěn)定，發(fā)光時(shí)間長(zhǎng)，常采用速率法檢測(cè)［18］。其中辣根過(guò)氧化物酶系統(tǒng)的標(biāo)記物為辣根過(guò)氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP），以魯米諾（Luminol）及其衍生物作為發(fā)光底物［19］，安圖、強(qiáng)生等廠家的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)屬于此類；堿性磷酸酶系統(tǒng)的標(biāo)記物為堿性磷酸酶（AP），以螺旋金剛烷環(huán)氧化物苯磷酸酯（3-［2-spiroadamatane］-4-methoxy-4-［3-phosphoryloxy］-phenyl-1，2-dioxetane）Dioxetane，AMPPD）作為發(fā)光底物［20］，邁瑞、西門子（德普）、希斯美康、貝克曼等廠家的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)屬于此類。非酶促化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)目前有三種方法，一是直接化學(xué)發(fā)光，作為標(biāo)記物的化學(xué)物質(zhì)如吖啶酯在堿性環(huán)境下，直接被過(guò)氧化物氧化產(chǎn)生發(fā)光信號(hào)，發(fā)光過(guò)程中標(biāo)記物被消耗，發(fā)光信號(hào)持續(xù)時(shí)間短，檢測(cè)模塊需加裝進(jìn)樣器［21］，雅培、西門子等廠家的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)屬于此類。二是通過(guò)電極上的電化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生而不是由氧化劑或者發(fā)光劑產(chǎn)生，標(biāo)記物為三聯(lián)吡啶釕衍生物即［Ru（bpy）3］2+，并以三丙胺為還原劑［22］，該技術(shù)是羅氏公司的專利。三是光激化學(xué)發(fā)光（LiCA）：如目標(biāo)抗原可使兩個(gè)抗體上標(biāo)記的感光珠和發(fā)光珠緊密的連接在一起，在680 nm 激發(fā)光下，可完成魯米諾氧化途徑化學(xué)發(fā)光過(guò)程［23］，國(guó)內(nèi)科美公司的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)屬于此類。

1.6.2 磁微?；瘜W(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)特點(diǎn)及乙肝標(biāo)志物應(yīng)用

由于磁微粒本身具有大比表面和高分散穩(wěn)定性、超順磁性生物相容性、功能基特性、生物活性物質(zhì)化學(xué)連接、類均相反應(yīng)等特性［24］，賦予磁微?；瘜W(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)以下幾方面的特點(diǎn)：①靈敏度高，如采用魯米諾系統(tǒng)的化學(xué)發(fā)光法，檢測(cè)發(fā)光值的信號(hào)范圍0～10 億［25］。②反應(yīng)迅速：屬于類均相反應(yīng)，底物不需要終止直接發(fā)光，整體反應(yīng)時(shí)間在17～56 min。③隨機(jī)單孔管理：具有樣本隨到隨測(cè)或急診功能，不存在加樣時(shí)間差。④自動(dòng)化程度高：磁微?；瘜W(xué)發(fā)光分析儀集自動(dòng)進(jìn)樣、加樣、反應(yīng)、檢測(cè)、打印報(bào)告等步驟于一體。⑤全封閉系統(tǒng)：磁微?；瘜W(xué)發(fā)光分析儀整個(gè)系統(tǒng)封閉，避免了人為因素帶來(lái)的檢測(cè)誤差，同時(shí)也提高了生物安全性。

化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)技術(shù)由于上述各方面性能的優(yōu)勢(shì)，促進(jìn)了乙肝血清學(xué)標(biāo)志物由定性檢測(cè)向定量檢測(cè)轉(zhuǎn)變［26］。目前國(guó)內(nèi)外主流產(chǎn)品可進(jìn)行表面抗原和表面抗體的定量檢測(cè)，單位分別為IU/mL 和mIU/mL。而安圖生物率先在國(guó)際上研發(fā)和生產(chǎn)了基于磁微?；瘜W(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)的乙肝五項(xiàng)全定量全自動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)，表面抗原和表面抗體均可以溯源至WHO 和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；e 抗原、e 抗體、核心抗體也可以溯源至WHO 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。乙肝五項(xiàng)全定量檢測(cè)賦予了乙肝血清學(xué)標(biāo)志物新的內(nèi)涵和臨床意義［27］，為深入研究乙肝自然史、抗病毒治療療效預(yù)測(cè)與監(jiān)測(cè)、乙肝疫苗免疫效果評(píng)價(jià)、推動(dòng)精準(zhǔn)醫(yī)療等提供了堅(jiān)實(shí)可靠的平臺(tái)。

2 小結(jié)與展望

近年來(lái)，化學(xué)發(fā)光免疫分析方法及應(yīng)用研究發(fā)展異常迅速，并以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)在乙肝檢測(cè)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，特別是磁性微粒子的免疫分離技術(shù)、金納米粒子的催化功能以及化學(xué)發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移在化學(xué)發(fā)光免疫分析方法中的應(yīng)用［28］。但是，化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中仍然存在不足，如核心技術(shù)智能化控制技術(shù)欠缺等［29］。為了使化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)得到更加廣泛的應(yīng)用，未來(lái)研究的主要方向應(yīng)集中在以下幾個(gè)方面：①分析儀器的大通量化與流水線化；②降低儀器成本，使儀器微型化、便攜化；③強(qiáng)化對(duì)檢測(cè)樣本基質(zhì)的處理，減少非特異性吸附，提高檢測(cè)的穩(wěn)定性；④在高通量研究方面，完善多通道、多組分化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測(cè)技術(shù)，提高檢測(cè)效率；⑤發(fā)展化學(xué)發(fā)光免疫分析聯(lián)用技術(shù)，擴(kuò)大應(yīng)用范圍。

化學(xué)發(fā)光經(jīng)過(guò)近30年發(fā)展已成為臨床主要檢測(cè)技術(shù)之一。隨著檢驗(yàn)分析技術(shù)的不斷進(jìn)步，實(shí)驗(yàn)室和臨床檢驗(yàn)儀器從過(guò)去半自動(dòng)化逐步向全自動(dòng)化普及［30］，工作模式也從過(guò)去單臺(tái)儀器的自動(dòng)工作發(fā)展到目前流水線作業(yè)的全實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)化（Total laboratory automation，TLA）或稱為全程自動(dòng)化，流水線和生化免疫聯(lián)機(jī)是大勢(shì)所趨。國(guó)產(chǎn)化學(xué)發(fā)光乙肝產(chǎn)品在新形勢(shì)下有著巨大的市場(chǎng)潛力，同時(shí)也將面臨著更加激烈、殘酷的競(jìng)爭(zhēng)。如何提高檢測(cè)精準(zhǔn)度、檢測(cè)穩(wěn)定性等方面或許是化學(xué)發(fā)光乙肝產(chǎn)品保持競(jìng)爭(zhēng)力的核心問題。這也需要行業(yè)內(nèi)所有的企業(yè)的共同努力，在競(jìng)爭(zhēng)中成長(zhǎng)、在成長(zhǎng)中優(yōu)化，促進(jìn)化學(xué)發(fā)光技術(shù)的長(zhǎng)遠(yuǎn)發(fā)展。

乙肝檢測(cè)技術(shù)從定性到定量的發(fā)展，需要解決溯源準(zhǔn)確性的問題?；瘜W(xué)發(fā)光技術(shù)面臨當(dāng)前及未來(lái)醫(yī)學(xué)發(fā)展的需求，在輔助臨床診斷之外，承擔(dān)起更多疾病的早期篩查、治療效果監(jiān)測(cè)及預(yù)后評(píng)估等任務(wù)時(shí)，就不得不要求更準(zhǔn)確更科學(xué)的檢測(cè)結(jié)果。乙肝化學(xué)發(fā)光產(chǎn)品由定性向定量的功能升級(jí)轉(zhuǎn)換也對(duì)企業(yè)提出的更高要求。檢驗(yàn)結(jié)果的溯源性將成為檢驗(yàn)儀器、試劑生產(chǎn)以及臨床實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)的重要質(zhì)量指標(biāo)，也必然受到IVD 廠商和醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室越來(lái)越多的重視。