miR-499、miR-16、肌紅蛋白與常規(guī)心肌損傷標(biāo)志物的關(guān)系及在急性心肌梗死早期診斷中的價(jià)值

李剛 朱春凱 鄭培明

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）發(fā)病急驟，是一種嚴(yán)重威脅人類健康的心血管疾病，隨著血運(yùn)重建技術(shù)的發(fā)展與進(jìn)步，病死率有所降低，但仍是冠心病死亡的最主要原因之一，而是否能早期明確診斷，指導(dǎo)臨床及時(shí)進(jìn)行治療是改善患者預(yù)后的關(guān)鍵［1-2］。肌鈣蛋白I（Cardiac troponini I，cTnI）、肌酸激酶同工酶（creatine kinase-MB，CK-MB）是診斷AMI 常用的心肌損傷標(biāo)志物，特異性較高，但多在AMI 發(fā)病3 h 后明顯升高，不利于疾病的早期診斷［3-4］。微小RNA 是一類高度保守的非編碼小分子RNA，由19～25 個(gè)核苷酸組成，雖然不編碼蛋白質(zhì)，但能調(diào)控靶基因降解、穩(wěn)定性、蛋白質(zhì)翻譯等，參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡［5］。有研究顯示，微小RNA 在血漿中穩(wěn)定存在，AMI 可引起患者循環(huán)中部分微小RNA的表達(dá)異常，具有疾病生物學(xué)標(biāo)記的潛在特性［6-7］。微小RNA-499（microRNA-499，miR-499）、微小RNA-16（microRNA-16，miR-16）是兩種微小RNA，是否與cTnI、CK-MB 有關(guān)及能否用于AMI的早期診斷尚不明確。肌紅蛋白（myoglobin，MYO）在AMI 患者中呈高表達(dá)，但在發(fā)病后表達(dá)的時(shí)間效應(yīng)仍不清楚［8］。鑒于此本研究探討miR-499、miR-16、MYO 與常規(guī)心肌損傷標(biāo)志物的關(guān)系及在AMI 早期診斷中的價(jià)值，報(bào)告如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取2017年2月至2019年12月本院收治的134 例AMI 患者（AMI 組）及體檢中心134 例健康人群（對(duì)照組）。其中AMI 組女65 例，男69 例平均（63.95±6.94）歲，體質(zhì)量指數(shù)19～26 kg/m2，平均（22.29±1.60）kg/m2；對(duì)照組女70 例，男64 例，平均（64.05±6.89）歲，體質(zhì)量指數(shù)19～26 kg/m2，平均（22.33±1.57）kg/m2。兩組性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)等資料均衡可比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①AMI 組均符合AMI 診斷標(biāo)準(zhǔn)［9］；②發(fā)病至入院時(shí)間＜2 h；③無風(fēng)濕性心臟病；④無病毒性感染等感染類疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有心臟瓣膜病、心房纖顫者；②先天性心臟病者；③合并惡性腫瘤者；④伴有肝腎肺功能嚴(yán)重不全者；⑤急性腦血管疾病者；⑥肺栓塞者；⑦心肌炎者，主動(dòng)脈夾層者。

1.3 方法

1.3.1 主要試劑、儀器

cTnI、CK-MB 檢測(cè)試劑盒（深圳市科潤(rùn)達(dá)生物工程有限公司）；總RNA 提取試劑盒（上海索寶生物科技有限公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（廣州泛思生物科技有限公司）；引物合成（北京擎科）；賽博綠色熒光染料實(shí)時(shí)PCR 反應(yīng)混合液（北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司）；實(shí)時(shí)定量PCR 儀（美國(guó)Biosystems公司，ABI7300）。

1.3.2 血cTnI、CK-MB、miR-499 mRNA、miR-16 mRNA 檢測(cè)

采集AMI 組發(fā)病后2、6、12 h 及對(duì)照組入院后次日清晨空腹肘部靜脈血，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清cTnI、CK-MB 水平，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)血miR-499 mRNA、miR-16 mRNA 表達(dá)。

1.3 觀察指標(biāo)

①比較兩組常規(guī)心肌損傷標(biāo)志物：cTnI、CKMB 表達(dá)。②比較兩組miR-499 mRNA、miR-169 mRNA、MYO 的表達(dá)。③分析miR-499、miR-16、MYO 之間的相關(guān)性。④分析miR-499、miR-16、MYO 與cTnI、CK-MB 相關(guān)性。⑤分析miR-499、miR-16、MYO 在AMI 早期診斷中的價(jià)值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以（）表示，多組間比較以單因素方差分析，兩兩比較以LSD-t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用n（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，采用Pearson 分析各指標(biāo)間相關(guān)性，采用接收者操作特征（Receiver Operating Characteristic，ROC）曲線及ROC 下面積（Area under the curve，AUC）分析各指標(biāo)在AMI 早期診斷中的價(jià)值。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組常規(guī)心肌損傷標(biāo)志物的表達(dá)

發(fā)病2 h 時(shí)，AMI 組cTnI、CK-MB 與對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；發(fā)病6、12 h，AMI 組cTnI、CK-MB 均高于對(duì)照組（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組常規(guī)心肌損傷標(biāo)志物的表達(dá)比較（±s）Table 1 Comparison of expression of conventional myocardial injury markers between the 2 groups（±s）

表1 兩組常規(guī)心肌損傷標(biāo)志物的表達(dá)比較（±s）Table 1 Comparison of expression of conventional myocardial injury markers between the 2 groups（±s）

組別AMI 組2 h 6 h 12 h對(duì)照組F 值P 值n 134 134 cTnI（μg/L）0.25±0.05 9.12±2.23 20.42±5.65 0.23±0.04 1331.381＜0.001 CK-MB（U/L）18.11±4.68 24.59±6.13 73.58±14.25 17.84±3.79 1398.770＜0.001

2.2 兩組miR-499 mRNA、miR-16 mRNA、MYO的表達(dá)

發(fā)病2、6、12 h 時(shí)，AMI 組miR-499 mRNA、miR-16 mRNA、MYO 高于對(duì)照組（P＜0.05）。見表2。

表2 AMI 組miR-499 mRNA、miR-16 mRNA、MYO 的表達(dá)比較（±s）Table 2 Comparison of miR-499 mRNA，miR-16 mRNA，and MYO expression in the AMI group（±s）

表2 AMI 組miR-499 mRNA、miR-16 mRNA、MYO 的表達(dá)比較（±s）Table 2 Comparison of miR-499 mRNA，miR-16 mRNA，and MYO expression in the AMI group（±s）

組別AMI 組2 h 6 h 12 h對(duì)照組F 值P 值n miR-499 mRNA miR-16 mRNA MYO（μg/L）134 134 1.48±0.50 2.69±0.72 2.75±0.68 1.09±0.39 276.104＜0.001 2.09±0.77 2.78±0.85 2.25±0.69 1.18±0.46 118.531＜0.001 68.98±19.12 132.38±28.44 342.08±33.27 53.02±12.44 3899.732＜0.001

2.3 分析miR-499、miR-16、MYO 之間的相關(guān)性

miR-499 mRNA 與miR-16 mRNA（r=0.642）呈正相關(guān)，與MYO（r=0.473）呈正相關(guān)；miR-16 mRNA與MYO（r=0.473）呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

2.4 分析miR-499、miR-16、MYO 與cTnI、CK-MB相關(guān)性

cTnI、CK-MB 與miR-499（r1=0.496，r2=0.519）、miR-16（r1=0.496，r2=0.557）、MYO（r1=0.501，r2=0.547）呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2。

2.5 分析miR-499、miR-16、MYO 在AMI 早期診斷中的價(jià)值

ROC 分析顯示，miR-16 診斷早期AMI 的AUC最大，其次是miR-499、MYO，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3、圖3。

3 討論

目前AMI 的診斷主要依賴臨床癥狀、心電圖、心肌損傷標(biāo)志物的變化，對(duì)具有以上病理特征變化的典型AMI，早期明確診斷較為容易，但長(zhǎng)期臨床工作發(fā)現(xiàn)，早期缺乏AMI 典型癥狀的患者并不少見，且有較大比例患者心電圖無典型改變，以致不能獲得及時(shí)再灌注治療，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后，這使得心肌損傷標(biāo)志物的檢測(cè)起相當(dāng)重要的作用［10］。CK-MB、cTnI 是常用的心肌損傷標(biāo)志物，本研究結(jié)果提示AMI 發(fā)病早期cTnI、CK-MB 無顯著變化，這一發(fā)現(xiàn)與既往的觀點(diǎn)［11］一致。cTnI 是心肌的特有分泌物，在AMI 后，3～6 h 開始釋放，10～24 h 達(dá)到高峰［12］；CK-MB 在心肌損傷后，3～8 h 后開始升高，可持續(xù)3～5 d，提示CK-MB、cTnI 在AMI 早期診斷中有一定的局限性［13］。因此有必要研究其他有效的心肌標(biāo)志物。

表3 ROC 分析結(jié)果Table 3 ROC analysis results

miR-499、miR-16 均是微小RNA 家族成員。終末期腎病合并AMI 患者外周血miR-499 mRNA高于未合并AMI 患者，提示miR-499 mRNA 與AMI 發(fā)生有關(guān)［14］。miR-16 在體外培養(yǎng)新生大鼠心室細(xì)胞中的過度表達(dá)降低了細(xì)胞活力，增加了細(xì)胞凋亡，相反miR-16 特異性抑制劑能逆轉(zhuǎn)以上變化，用miR-16 慢病毒過度表達(dá)miR-16，可顯著增加AMI 大鼠心肌梗死面積，加重心功能不全，而慢病毒介導(dǎo)miR-16 基因敲除可減輕急性心肌損傷，可見miR-16 參與AMI 發(fā)病與病情惡化［15］。但兩者是否有助于AMI 的早期診斷尚不清楚。結(jié)合文獻(xiàn)分析，AMI 發(fā)生后在缺氧/復(fù)氧刺激下，心肌細(xì)胞可釋放miR-499，導(dǎo)致miR-499 表達(dá)升高，并介導(dǎo)內(nèi)皮損傷標(biāo)志物表達(dá)明顯增加，引起內(nèi)皮損傷，從而參與AMI 發(fā)病及病情進(jìn)展［16］。由于研究的前沿性，缺乏相關(guān)循證資料，仍不清楚miR-16 通過何種途徑參與AMI，但本研究采用Pearson 分析發(fā)現(xiàn)，miR-499 mRNA 與miR-16 mRNA 呈正相關(guān)，表明兩者可相互影響發(fā)揮作用，且發(fā)病12 h miR-499、miR-16 均與CK-MB、cTnI 呈正相關(guān)，有作為心肌損傷標(biāo)志物的潛質(zhì)。后續(xù)的ROC 分析顯示，miR-499 診斷早期AMI，miR-16 均呈現(xiàn)出一定的診斷價(jià)值，可為臨床診斷早期AMI 提供量化數(shù)據(jù)參考。

MYO 是肌細(xì)胞等儲(chǔ)存和分配氧的蛋白質(zhì)，心肌中含量特別豐富，在心肌缺血大鼠中表達(dá)明顯升高［17］。本研究提示MYO 可能有助于AMI 的早期診斷。石萍等［18］指出，MYO 在AMI 發(fā)病早期，0～3 h 后血中即可升高，佐證了MYO 可作為AMI早期診斷的敏感指標(biāo)。本研究不足之處在于，未分析各指標(biāo)聯(lián)合的診斷價(jià)值，有待后續(xù)的進(jìn)一步探討。

綜上所述，miR-499、miR-16、MYO 在AMI發(fā)病早期即升高，各指標(biāo)間呈正相關(guān)，并與cTnI、CK-MB 呈正相關(guān)，可作為AMI 早期診斷的標(biāo)志物。